專利名稱：羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
羅漢果是葫蘆科(Cucurbitaceae)羅漢果屬Siraitia植物羅漢果Siraitia grosvenorii (Swingle)C. Jeffery ex Lu et Ζ. Y. Zhang 的果實(shí)。羅漢果為廣西桂林特有的一種珍貴藥食兩用植物。羅漢果甜苷(mogroside)是羅漢果中主要有效成分，具有保健和藥用價(jià)值，然而由于羅漢果甜苷從羅漢果果實(shí)中提取，提取得率僅為左右，因此，尋找獲得羅漢果甜苷的新方法勢(shì)在必行，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是獲得羅漢果甜苷的有效途徑之一。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有關(guān)羅漢果懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用羅漢果莖段誘導(dǎo)形成的愈傷組織建立細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法。本發(fā)明目的通過(guò)如下步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)1)接種和誘導(dǎo)羅漢果莖段愈傷組織，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2. 5%蔗糖、4. Omg/1瓊脂的MS液體培養(yǎng)基(pH 5.8)上繼代培養(yǎng)，選取連續(xù)繼代3_5次的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有MS+0. 2-1. Omg/1 6-BA+0. 02-0. IOmg/ 1 NAA, 2. 0-4. 0%蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基的無(wú)菌三角瓶中，其接種量300g/l，初始培養(yǎng)基 PH為5. 0-6. 5，置于120r/min振蕩培養(yǎng)箱25°C黑暗條件下懸浮培養(yǎng)24h后靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，3d后采用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次，7d后將懸浮細(xì)胞經(jīng)40 μ m篩網(wǎng)過(guò)濾后接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到一定數(shù)量的均一穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)溫度為25士2°C，光強(qiáng)為20001x，光照時(shí)間為12h/d ；3)培養(yǎng)21d收獲，蒸餾水沖洗3次，真空抽濾后稱量鮮重(Fresh Cell Weight, FCW)，然后將所得細(xì)胞置于60°C烘箱中干燥至恒重后稱量干重(Dry Cell Weight，DCW)。步驟2)中所述懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的優(yōu)選培養(yǎng)基為MS+1. Omg/1 6-BA+O. 02mg/l NAA， 4. 0%蔗糖為碳源，初始培養(yǎng)基pH為5. 5-6. 0。步驟2)中所述的繼續(xù)振蕩培養(yǎng)的繼代次數(shù)為3 5次。本發(fā)明的積極效果是利用羅漢果莖段誘導(dǎo)形成的愈傷組織，建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，研究了 4種因素對(duì)懸浮垃圾細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，篩選出適宜的培養(yǎng)條件，提高了羅漢果懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的產(chǎn)量，并為利用羅漢果懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系提取羅漢果甜苷奠定了基石出。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法，包括如下步驟本實(shí)驗(yàn)羅漢果健康植株的莖段為實(shí)驗(yàn)材料。1)接種和誘導(dǎo)羅漢果莖段愈傷組織，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2. 5%蔗糖、4. Omg/1瓊脂的MS液體培養(yǎng)基(pH 5.8)上繼代培養(yǎng)，選取連續(xù)繼代3次或4次或5次的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有MS+0. 2mg/l 6-BA+O. 02mg/l NAA,
2.0%蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基的無(wú)菌三角瓶中(接種量300g/l)，初始培養(yǎng)基pH為5. 0 5. 4，置于120r/min振蕩培養(yǎng)箱25°C黑暗條件下懸浮培養(yǎng)24h后靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，3d后采用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次， 7d后將懸浮細(xì)胞經(jīng)40 μ m篩網(wǎng)過(guò)濾后接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到一定數(shù)量的均一穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)溫度為25士2°C，光強(qiáng)為20001x，光照時(shí)間為12h/ d；3)培養(yǎng)21d收獲，蒸餾水沖洗3次，真空抽濾后分離細(xì)胞稱量鮮重(Fresh Cell Weight, FCff)為 570.Og/1。實(shí)施例2:羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法，包括如下步驟本實(shí)驗(yàn)羅漢果健康植株的莖段為實(shí)驗(yàn)材料。1)接種和誘導(dǎo)羅漢果莖段愈傷組織，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1瓊脂的1^培養(yǎng)基(pH 5.8)上繼代培養(yǎng)，選取連續(xù)繼代3次或4次或5 次的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有MS+0. 2mg/l 6-BA+O. 06mg/l NAA,
3.0%蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基的無(wú)菌三角瓶中(接種量300g/l)，初始培養(yǎng)基pH為5. 5 6.0，置于120r/min振蕩培養(yǎng)箱25°C黑暗條件下懸浮培養(yǎng)24h后靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，3d后采用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次， 7d后將懸浮細(xì)胞經(jīng)40 μ m篩網(wǎng)過(guò)濾后接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到一定數(shù)量的均一穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)溫度為25士2°C，光強(qiáng)為20001x，光照時(shí)間為12h/ d；3)培養(yǎng)21d收獲，蒸餾水沖洗3次，真空抽濾后分離細(xì)胞稱量鮮重(Fresh Cell Weight, FCff)為 510.Og/1。實(shí)施例3 羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法，包括如下步驟本實(shí)驗(yàn)羅漢果健康植株的莖段為實(shí)驗(yàn)材料。1)接種和誘導(dǎo)羅漢果莖段愈傷組織，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1瓊脂的1^培養(yǎng)基(pH 5.8)上繼代培養(yǎng)，選取連續(xù)繼代3次或4次或5次的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有MS+0. 2mg/l 6-BA+O. 10mg/l NAA, 4.0%蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基的無(wú)菌三角瓶中(接種量300g/l)，初始培養(yǎng)基pH為6. 1 6. 4，置于120r/min振蕩培養(yǎng)箱25°C黑暗條件下懸浮培養(yǎng)24h后靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，3d后采用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次， 7d后將懸浮細(xì)胞經(jīng)40 μ m篩網(wǎng)過(guò)濾后接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到一定數(shù)量的均一穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)溫度為25士2°C，光強(qiáng)為20001x，光照時(shí)間為Uh/d ；3)培養(yǎng)21d收獲，蒸餾水沖洗3次，真空抽濾后分離細(xì)胞稱量鮮重(Fresh Cell Weight, FCff)為 543.Og/1。實(shí)施例4 羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法，包括如下步驟本實(shí)驗(yàn)羅漢果健康植株的莖段為實(shí)驗(yàn)材料。1)接種和誘導(dǎo)羅漢果莖段愈傷組織，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1瓊脂的1^培養(yǎng)基(pH 5.8)上繼代培養(yǎng)，選取連續(xù)繼代3次或4次或5 次的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有MS+0.6mg/l 6-BA+O. 02mg/l NAA, 3.0%蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基的無(wú)菌三角瓶中(接種量300g/l)，初始培養(yǎng)基pH為6. 1 6. 4，置于120r/min振蕩培養(yǎng)箱25°C黑暗條件下懸浮培養(yǎng)24h后靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，3d后采用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次， 7d后將懸浮細(xì)胞經(jīng)40 μ m篩網(wǎng)過(guò)濾后接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到一定數(shù)量的均一穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)溫度為25士2°C，光強(qiáng)為20001x，光照時(shí)間為12h/d ；3)培養(yǎng)21d收獲，蒸餾水沖洗3次，真空抽濾后分離細(xì)胞稱量鮮重(Fresh Cell Weight, FCff)為 493. Og/1。實(shí)施例5 羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法，包括如下步驟本實(shí)驗(yàn)羅漢果健康植株的莖段為實(shí)驗(yàn)材料。1)接種和誘導(dǎo)羅漢果莖段愈傷組織，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1瓊脂的1^培養(yǎng)基(pH 5.8)上繼代培養(yǎng)，選取連續(xù)繼代3次或4次或5 次的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有MS+0. 6mg/l 6-BA+O. 06mg/l NAA,
4.0%蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基的無(wú)菌三角瓶中(接種量300g/l)，初始培養(yǎng)基pH為5. 0
5.4，置于120r/min振蕩培養(yǎng)箱25°C黑暗條件下懸浮培養(yǎng)24h后靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，3d后采用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次， 7d后將懸浮細(xì)胞經(jīng)40 μ m篩網(wǎng)過(guò)濾后接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到一定數(shù)量的均一穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)溫度為25士2°C，光強(qiáng)為20001x，光照時(shí)間為Uh/d ；3)培養(yǎng)21d收獲，蒸餾水沖洗3次，真空抽濾后分離細(xì)胞稱量鮮重(Fresh CellWeight, FCff)為 420. Og/1。實(shí)施例6:羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法，包括如下步驟本實(shí)驗(yàn)羅漢果健康植株的莖段為實(shí)驗(yàn)材料。1)接種和誘導(dǎo)羅漢果莖段愈傷組織，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1瓊脂的1^培養(yǎng)基(pH 5.8)上繼代培養(yǎng)，選取連續(xù)繼代3次或4次或5 次的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有MS+0.6mg/l 6-BA+O. 10mg/l NAA, 2. 0%蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基的無(wú)菌三角瓶中(接種量300g/l)，初始培養(yǎng)基pH為5. 5 6.0，置于120r/min振蕩培養(yǎng)箱25°C黑暗條件下懸浮培養(yǎng)24h后靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，3d后采用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次， 7d后將懸浮細(xì)胞經(jīng)40 μ m篩網(wǎng)過(guò)濾后接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到一定數(shù)量的均一穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)溫度為25士2°C，光強(qiáng)為20001x，光照時(shí)間為12h/d ；3)培養(yǎng)21d收獲，蒸餾水沖洗3次，真空抽濾后分離細(xì)胞稱量鮮重(Fresh Cell Weight, FCff)為 450. Og/1。實(shí)施例7 羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法，包括如下步驟本實(shí)驗(yàn)羅漢果健康植株的莖段為實(shí)驗(yàn)材料。1)接種和誘導(dǎo)羅漢果莖段愈傷組織，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1瓊脂的1^培養(yǎng)基(pH 5.8)上繼代培養(yǎng)，選取連續(xù)繼代3次或4次或5 次的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有MS+1.0mg/l 6-BA+O. 02mg/l NAA, 4. 0%蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基的無(wú)菌三角瓶中(接種量300g/l)，初始培養(yǎng)基pH為5. 5 6.0，置于120r/min振蕩培養(yǎng)箱25°C黑暗條件下懸浮培養(yǎng)24h后靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，3d后采用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次， 7d后將懸浮細(xì)胞經(jīng)40 μ m篩網(wǎng)過(guò)濾后接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到一定數(shù)量的均一穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)溫度為25士2°C，光強(qiáng)為20001x，光照時(shí)間為Uh/d ；3)培養(yǎng)21d收獲，蒸餾水沖洗3次，真空抽濾后分離細(xì)胞稱量鮮重(Fresh Cell Weight, FCff)為 693.Og/1。實(shí)施例8 羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法，包括如下步驟本實(shí)驗(yàn)羅漢果健康植株的莖段為實(shí)驗(yàn)材料。1)接種和誘導(dǎo)羅漢果莖段愈傷組織，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1瓊脂的1^培養(yǎng)基(pH 5.8)上繼代培養(yǎng)，選取連續(xù)繼代3次或4次或5 次的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有MS+1.0mg/l 6-BA+O. 06mg/l NAA, 2.0%蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基的無(wú)菌三角瓶中(接種量300g/l)，初始培養(yǎng)基pH為6. 1 6. 4，置于120r/min振蕩培養(yǎng)箱25°C黑暗條件下懸浮培養(yǎng)24h后靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，3d后采用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次， 7d后將懸浮細(xì)胞經(jīng)40 μ m篩網(wǎng)過(guò)濾后接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到一定數(shù)量的均一穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)溫度為25士2°C，光強(qiáng)為20001x，光照時(shí)間為Uh/d ；3)培養(yǎng)21d收獲，蒸餾水沖洗3次，真空抽濾后分離細(xì)胞稱量鮮重(Fresh Cell Weight, FCff)為 580.Og/1。實(shí)施例9 羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法，包括如下步驟本實(shí)驗(yàn)羅漢果健康植株的莖段為實(shí)驗(yàn)材料。1)接種和誘導(dǎo)羅漢果莖段愈傷組織，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1瓊脂的1^培養(yǎng)基(pH 5.8)上繼代培養(yǎng)，選取連續(xù)繼代3次或4次或5 次的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有MS+1.0mg/l 6-BA+O. 10mg/l NAA, 3. 0%蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基的無(wú)菌三角瓶中(接種量300g/l)，初始培養(yǎng)基pH為5. 0 5. 4，置于120r/min振蕩培養(yǎng)箱25°C黑暗條件下懸浮培養(yǎng)24h后靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，3d后采用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次， 7d后將懸浮細(xì)胞經(jīng)40μ m篩網(wǎng)過(guò)濾后接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到一定數(shù)量的均一穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)溫度為25士2°C，光強(qiáng)為20001x，光照時(shí)間為Uh/d ；3)培養(yǎng)21d收獲，蒸餾水沖洗3次，真空抽濾后分離細(xì)胞稱量鮮重(Fresh Cell Weight, FCff)為 390.Og/1。上述實(shí)施例中經(jīng)檢測(cè)，培養(yǎng)21d是羅漢果懸浮細(xì)胞最佳收獲時(shí)間，此時(shí)羅漢果總苷和甜苷V的含量均是最大值。占細(xì)胞重量的比值分別為8. 11%,5. 77%。
權(quán)利要求
1.一種羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法，其步驟如下1)接種和誘導(dǎo)羅漢果莖段愈傷組織，在添加O.aiig/16-BA+O. 04mg/l NAA激素、2. 5% 蔗糖、4. Omg/1瓊脂的MS液體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，該培養(yǎng)基的pH為5. 8，選取連續(xù)繼代3_5 次的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織按接種量300g/l轉(zhuǎn)接到含有MS+0.2-1. Omg/ 16-BA+0. 02-0. 1 Omg/1 NAA, 2. 0-4. 0%蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基的無(wú)菌三角瓶中，初始培養(yǎng)基pH為5. 0-6. 5，置于120r/min振蕩培養(yǎng)箱25°C黑暗條件下懸浮培養(yǎng)24h后靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，3d后采用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次，7d后將懸浮細(xì)胞經(jīng)40 μ m篩網(wǎng)過(guò)濾后接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)， 達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到一定數(shù)量的均一穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)溫度為25士2°C，光強(qiáng)為20001x，光照時(shí)間為12h/d ；3)培養(yǎng)21d收獲，蒸餾水沖洗3次，真空抽濾后稱量鮮重，然后將所得細(xì)胞置于60°C烘箱中干燥至恒重后稱量干重。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟幻中懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為 MS+1. Omg/1 6-BA+O. 02mg/l ΝΑΑ，4· 0%蔗糖為碳源，初始培養(yǎng)基 pH 為 5. 5-6. 0。
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)中所述的繼續(xù)振蕩培養(yǎng)的繼代次數(shù)為3 5次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種羅漢果愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法，1)接種和誘導(dǎo)羅漢果莖段愈傷組織，在添加NAA激素、蔗糖、瓊脂的MS液體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，選取愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到無(wú)菌三角瓶中，置于振蕩培養(yǎng)箱25℃黑暗條件下懸浮培養(yǎng)24h，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，3d后采用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次，7d后將懸浮細(xì)胞經(jīng)40μm篩網(wǎng)過(guò)濾后接種到新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)。3)培養(yǎng)21d收獲，沖洗3次，真空抽濾后稱重，烘干。本發(fā)明具有繁殖速度快、培養(yǎng)規(guī)模大和提供大量均勻一致植物細(xì)胞培養(yǎng)物的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/04GK102174463SQ20111003417
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月30日
發(fā)明者盧曦, 宋波, 曾建紅, 李云秋, 段小群, 申響寶 申請(qǐng)人:桂林醫(yī)學(xué)院