磁力裂解方法和裝置的制造方法
【專利摘要】公開了裂解細胞的方法。所述方法包括在存在多個細胞裂解珠的情況下，用磁力攪拌元件以足以裂解細胞的速率攪拌細胞。還公開了用于裂解細胞的裝置。所述裝置包括具有磁力攪拌元件和布置在其中的多個細胞裂解珠的容器。所述容器的尺寸允許磁力攪拌元件在容器內(nèi)轉(zhuǎn)動。
【專利說明】磁力裂解方法和裝置
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請要求于2009年9月21日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/272,396的優(yōu)先權(quán)，其在此通過引用整體并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003]本技術(shù)領(lǐng)域是生物技術(shù)，并且更具體地，是用于裂解細胞的方法和裝置。
[0004]背景
[0005]細胞裂解是細胞膜或細胞壁的破壞或破碎，這裂開細胞并暴露細胞的內(nèi)容物。許多技術(shù)可以用于細胞破碎，包括物理、化學(xué)(例如，基于去污劑的方法，離液鹽)和生物化學(xué)(例如，諸如溶菌酶的酶)技術(shù)。諸如渦旋和珠磨的機械裂解是物理裂解的一種形式。聲波降解法是物理裂解的另一種形式，其利用脈沖、高頻聲波來攪動和裂解細胞、細菌、芽孢以及精細切塊的組織。然而，這些方法并不易于與綜合的低成本的細胞裂解/核酸分析系統(tǒng)相兼容?；谌ノ蹌┑姆椒ㄍǔＳ捎诰哂懈行У姆桨付任锢矸椒ǜ菀资褂?。但是，去污劑的存在能干擾綜合系統(tǒng)中的下游反應(yīng)，并且對于更硬的細菌和芽孢可產(chǎn)生易變的裂解效率，并且需要較長的孵育步驟和/或加熱處理。因此，存在對經(jīng)濟、有效且與綜合的細胞裂解/分析系統(tǒng)相兼容的細胞裂解方法的需求。
[0006]概述
[0007]公開了裂解細胞、病毒顆粒和芽孢的方法。所述方法包括在存在多個細胞裂解珠的情況下，在容器內(nèi)用磁力攪拌元件攪拌細胞，其中所述攪拌元件以足以裂解細胞的速率和持續(xù)時間轉(zhuǎn)動。在一些實施方案中，細胞裂解珠選自聚合物珠、玻璃珠、陶瓷珠和金屬珠。在一些實施方案中，細胞裂解珠的直徑范圍為10?ΙΟΟΟμπι。在一些實施方案中，將Img?1g的細胞裂解珠添加到裂解室中。在一些實施方案中，將Iul?1ml的水性液體添加到裂解室中。在一些實施方案中，將樣品或樣本樣本單獨直接添加到裂解室中。在一些實施方案中，將樣品與水性液體(例如，將固體樣本勻漿并裂解以產(chǎn)生水性形式)一起直接添加到裂解室中。在一些實施方案中，磁力攪拌元件為矩形、梯形、兩端分叉的音叉狀(two-prongedtuning fork shape)、桿狀和棒狀。在一些實施方案中，細胞是真核細胞、原核細胞、內(nèi)生芽孢或它們的組合，并且以I?IxlO1t3細胞/ml的濃度范圍懸浮于液體介質(zhì)中。在一些實施方案中，細胞是病毒顆粒，并且以I?IxlO1t3顆粒/ml的濃度范圍懸浮于液體介質(zhì)中。
[0008]還公開了裂解細胞和病毒顆粒的方法。所述方法包括將細胞或病毒顆粒懸浮于液體介質(zhì)中以形成懸浮液，并且在存在多個細胞裂解珠的情況下，用磁力攪拌元件以1000?5000rpm，優(yōu)選接近5000rpm的高速率攪拌懸浮液I?600秒，優(yōu)選約90?120秒的時間段。
[0009]還公開了用于裂解細胞和病毒顆粒的裝置。所述裝置包括具有一個或多個磁力攪拌元件和布置在其中的多個細胞裂解珠的小室。小室的尺寸允許一個或多個磁力攪拌元件在室內(nèi)轉(zhuǎn)動。在一些實施方案中，所述裝置還包括產(chǎn)生轉(zhuǎn)動磁場的磁力攪拌器，其中所述一個或多個磁力攪拌元件在放置于轉(zhuǎn)動磁場的操作范圍內(nèi)時能在室內(nèi)轉(zhuǎn)動。在一些實施方案中，所述裝置還包括小室固定器，其被配置成能夠?qū)⑿∈夜潭ㄔ谟纱帕嚢杵鳟a(chǎn)生的轉(zhuǎn)動磁場內(nèi)。
[0010]還公開了從細胞中純化核酸的方法。所述方法包括向包含細胞、攪拌元件和多個珠子的器皿施加磁場，其中所述磁場引起攪拌元件與多個珠子相碰撞并且產(chǎn)生細胞裂解物，以及從細胞裂解物中分離核酸。
[0011]還公開了從細胞中擴增多核苷酸的方法。所述方法包括向包含細胞、攪拌元件和多個珠子的器皿施加磁場，其中所述磁場引起攪拌元件與多個珠子相碰撞并且產(chǎn)生細胞裂解物，以及從細胞裂解物中擴增多核苷酸。
[0012]還公開了從細胞中檢測多核苷酸的方法。所述方法包括向包含細胞、攪拌元件和多個珠子的器皿施加磁場，其中所述磁場引起攪拌元件與多個珠子相碰撞并且產(chǎn)生細胞裂解物，以及從細胞裂解物中檢測多核苷酸。在某些實施方案中，檢測步驟包括從細胞裂解物中分離核酸，從所分離的核酸中擴增多核苷酸，以及檢測所擴增的多核苷酸。
[0013]本申請還公開了以下項所述的實施方案:
[0014]項1.裂解細胞的方法，所述方法包括:在存在多個珠子的情況下，在小室內(nèi)磁力攪拌元件攪拌包含一種或多種目的細胞的液體懸浮液，其中所述磁力攪拌元件以足以裂解所述一種或多種目的細胞的速率轉(zhuǎn)動。
[0015]項2.如項I所述的方法，其還包括:將所述一種或多種細胞懸浮于液體介質(zhì)中以形成所述液體懸浮液。
[0016]項3.如項I所述的方法，其中所述珠子包含選自以下的材料:塑料、玻璃、陶瓷和金屬O
[0017]項4.如項3所述的方法，其中所述珠子是硅珠。
[0018]項5.如項I所述的方法，其中所述珠子的直徑范圍為1?I OOOym。
[0019]項6.如項I所述的方法，其中所述磁力攪拌元件包含金屬或合金。
[0020]項7.如項I所述的方法，其中所述磁力攪拌元件具有選自以下的形狀:圓形，方形，矩形，曲桿狀，截面為矩形的形狀，盤狀，桿狀，環(huán)狀，月牙形以及梯形，兩端分叉的音叉狀。
[0021]項8.如項I所述的方法，其中所述目的細胞是真核細胞或原核細胞，并且其中所述液體懸浮液包含濃度范圍為I?IxlO1t3細胞/ml的所述細胞。
[0022]項9.如項I所述的方法，其中所述細胞是病毒顆粒，并且其中所述液體懸浮液包含濃度范圍為I?IxlO13顆粒/ml的所述病毒顆粒。
[0023]項10.裂解細胞的方法，所述方法包括:向包含目的細胞、攪拌子元件和多個珠子的小室施加磁場，其中所述磁場引起所述攪拌子元件與所述珠子相碰撞，所產(chǎn)生的力足以使所述細胞破碎。
[0024]項11.如項10所述的方法，其中所述珠子包括玻璃珠、塑料珠、陶瓷珠、金屬珠或它們的混合物。
[0025]項12.如項10所述的方法，其中所述攪拌子元件包含不銹鋼。
[0026]項13.如項10所述的方法，其中所述攪拌子元件包含涂有聚合物的合金核心。
[0027]項14.如項13所述的方法，其中所述合金核心包含釹鐵硼或釤鈷。
[0028]項15.如項13所述的方法，其中所述聚合物是生物相容性聚合物。
[0029]項16.如項15所述的方法，其中所述生物相容性聚合物是PTFE或聚對二甲苯。
[0030]項17.在一個或多個器皿內(nèi)裂解細胞的方法，所述方法包括:將一個或多個器皿沿著第一軸線放置在表面上，其中每一個器皿包含一種或多種細胞，一個或多個磁力攪拌子和多個珠子；以及圍繞所述一個或多個器皿附近的第二軸線轉(zhuǎn)動磁體，其中所述第二軸線穿過所述磁體中心，所述磁體的轉(zhuǎn)動引起每一個器皿中的所述一個或多個磁力攪拌子翻轉(zhuǎn)。
[0031]項18.如項17所述的方法，其中所述第二軸線平行于所述第一軸線。
[0032]項19.如項17所述的方法，其中所述第二軸線與所述第一軸線形成角度，并且其中所述角度大于O度且小于180度。
[0033]項20.如項17所述的方法，其中所述磁體是永久性磁體。
[0034]項21.如項17所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)動的磁體引起至少一個器皿中的所述一個或多個磁力攪拌子以大于100rpm的速率轉(zhuǎn)動。
[0035]項22.如項17所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)動的磁體引起每一個器皿中的所述一個或多個磁力攪拌子轉(zhuǎn)動約I分鐘至約15分鐘的時間。
[0036]項23.如項17所述的方法，其中所述第一軸線垂直于所述表面，并且所述磁體的轉(zhuǎn)動引起每一個器皿中的所述一個或多個磁力攪拌子圍繞垂直于所述表面的軸線轉(zhuǎn)動。
[0037]項24.如項17所述的方法，其中所述第一軸線垂直于所述表面，并且所述磁體的轉(zhuǎn)動引起每一個器皿中的所述一個或多個磁力攪拌子圍繞平行于所述表面的軸線轉(zhuǎn)動。
[0038]項25.如項17所述的方法，其中所述第二軸線在所述一個或多個器皿之上。
[0039]項26.如項17所述的方法，其中所述第二軸線在所述一個或多個器皿之下。
[0040]項27.如項17所述的方法，其中所述第二軸線在所述一個或多個器皿的一側(cè)。
[0041]項28.如項17所述的方法，其中所述一個或多個器皿為選自以下的形式:小瓶、試管、微板孔和流動腔。
[0042]項29.如項17所述的方法，其中所述一個或多個器皿具有在平行于所述第一軸線的方向上延伸的形狀，并且其中所述磁體具有在平行于所述第二軸線的方向上延伸的形狀。
[0043]項30.如項17所述的方法，其中所述一個或多個器皿包含兩種或更多種類型的細胞，并且其中所述轉(zhuǎn)動步驟包括:以致使第一種類型的細胞裂解的第一速率轉(zhuǎn)動所述磁體。
[0044]項31.如項30所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)動步驟還包括:以致使第二種類型的細胞裂解的第二速率轉(zhuǎn)動所述磁體。
[0045]項32.用于裂解細胞的裝置，所述裝置包括:包含磁力攪拌元件和布置在其中的多個珠子的容器，其中所述容器的尺寸允許所述磁力攪拌元件在所述容器內(nèi)轉(zhuǎn)動。
[0046]項33.如項32所述的裝置，其中所述珠子包括玻璃珠、塑料珠、陶瓷珠或它們的混合物。
[0047]項34.如項32所述的裝置，其還包括:產(chǎn)生轉(zhuǎn)動磁場的磁力攪拌器，其中所述磁力攪拌元件在放置于所述轉(zhuǎn)動磁場的操作范圍內(nèi)時能夠在所述容器內(nèi)轉(zhuǎn)動。
[0048]項35.如項32所述的裝置，其還包括容器固定器，所述容器固定器被配置成能夠?qū)⑺鋈萜鞴潭ㄓ谒鲛D(zhuǎn)動磁場內(nèi)。
[0049]項36.如項32所述的裝置，其還包括控制所述容器溫度的溫度控制組件。
[0050]項37.從細胞中純化核酸的方法，所述方法包括:向包含所述細胞、攪拌元件和多個珠子的器皿施加磁場，其中所述磁場引起所述攪拌元件與所述多個珠子相碰撞并產(chǎn)生細胞裂解物；以及從所述細胞裂解物中分離核酸。
[0051]項38.從細胞中擴增多核苷酸的方法，所述方法包括:向包含所述細胞、攪拌元件和多個珠子的器皿施加磁場，其中所述磁場引起所述攪拌元件與所述多個珠子相碰撞并產(chǎn)生細胞裂解物；以及從所述細胞裂解物中擴增所述多核苷酸。
[0052]項39.從細胞中檢測多核苷酸的方法，所述方法包括:向包含所述細胞、攪拌元件和多個珠子的器皿施加磁場，其中所述磁場引起所述攪拌元件與所述多個珠子相碰撞并產(chǎn)生細胞裂解物；以及從所述細胞裂解物中檢測所述多核苷酸。
[0053]項40.如項39所述的方法，其中所述檢測步驟包括:從所述細胞裂解物中分離核酸;從所分離的核酸中擴增所述多核苷酸；以及檢測所擴增的多核苷酸。
[0054]附圖簡要說明
[0055]將參考以下附圖進行詳細描述，其中:
[0056]圖1是顯示裂解細胞方法的一個實施方案的流程圖。
[0057]圖2是顯示裂解細胞方法的另一實施方案的流程圖。
[0058]圖3是顯不磁體和裂解室的相對位置的圖。
[0059]圖4顯示了來自未裂解的大腸桿菌細胞(未裂解的)，通過珠磨器裂解2分鐘的大腸桿菌細胞(2m珠磨)，以及通過珠子/攪拌子裂解30秒(30s混合)或2分鐘(2m混合)的大腸桿菌細胞的特定基因組區(qū)的實時PCR擴增圖。
[0060]圖5顯示了來自未裂解的大腸桿菌細胞(未裂解的)，通過珠磨器裂解2分鐘的大腸桿菌細胞(2m珠磨)，以及通過珠子/攪拌子裂解I分鐘(Im混合)或2分鐘(2m混合)的大腸桿菌細胞的特定基因組區(qū)的實時PCR擴增圖。
[0061]圖6顯示了來自未裂解的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)芽孢(未裂解的)，通過珠磨器裂解2分鐘的蘇云金芽孢桿菌芽孢(2m珠磨)，以及通過珠子/攪拌子裂解2分鐘(2m混合)的蘇云金芽孢桿菌芽孢的特定基因組區(qū)的實時PCR擴增圖。
[0062]圖7顯示了來自未裂解的蘇云金芽孢桿菌芽孢(未裂解的)，通過珠磨器裂解2分鐘的蘇云金芽孢桿菌芽孢(2m珠磨)，以及通過珠子/攪拌子裂解1.5分鐘(1.5m混合)或2分鐘(2m混合)的蘇云金芽孢桿菌芽孢的特定基因組區(qū)的實時PCR擴增圖。
[0063]圖8顯示了來自未裂解的蘇云金芽孢桿菌芽孢(未裂解的)，通過珠磨器裂解2分鐘的蘇云金芽孢桿菌芽孢(2m珠磨)，以及通過珠子/攪拌子裂解1.5分鐘(1.5m混合)的蘇云金芽孢桿菌芽孢的特定基因組區(qū)的實時PCR擴增圖。
[0064]圖9顯示了裂解時間和珠子混合器速率對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)細胞的實時PCR反應(yīng)的影響。當(dāng)珠子混合器以高速率運轉(zhuǎn)時，金黃色葡萄球菌細胞在2分鐘內(nèi)實現(xiàn)有效裂解。較低的速率需要較長的裂解時間。未裂解的芽孢具有無裂解(O分鐘)就可檢測到的低水平的細胞外DNA。少量游離DNA結(jié)合到玻璃珠上。珠子混合器速率為100相當(dāng)于5000印111。
[0065]圖10顯示了裂解時間和珠子混合器速率對蘇云金芽孢桿菌芽孢的實時PCR反應(yīng)的影響。當(dāng)珠子混合器以高速率運轉(zhuǎn)時，蘇云金芽孢桿菌芽孢在2分鐘內(nèi)實現(xiàn)有效裂解。較低的速率需要較長的裂解時間。未裂解的芽孢具有無裂解(O分鐘)就可檢測到的低水平的細胞外DNA。少量游離DNA結(jié)合到玻璃珠上。珠子混合器速率為100相當(dāng)于5000rpm。
[0066]發(fā)明詳述
[0067]在描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案時，為了清楚而采用了特定術(shù)語。然而，本發(fā)明并不意欲限于所選擇的特定術(shù)語。應(yīng)當(dāng)理解的是，每個特定元件包括以相似方式操作以實現(xiàn)相似目的的所有技術(shù)等同物。
[0068]公開了裂解細胞的方法的實施方案。現(xiàn)在參考圖1，在一些實施方案中，方法100包括將細胞樣品添加到小室內(nèi)(步驟110)，將多個細胞裂解珠添加到容器內(nèi)(步驟120)，將磁力攪拌元件添加到容器內(nèi)(步驟130)，以及用磁力攪拌元件以足以裂解細胞的轉(zhuǎn)動速率(1000?5000rpm)攪拌細胞樣品(步驟140)。現(xiàn)在參考圖2，在其他實施方案中，方法200包括形成包含細胞、液體介質(zhì)、細胞裂解珠和磁力攪拌元件的混合物(步驟210)，以及利用變化的磁場驅(qū)動混合物中磁力攪拌元件的運動來裂解細胞(步驟220)。
[0069]如本文所使用，術(shù)語“細胞”是指真核細胞、原核細胞、病毒、內(nèi)生芽孢或它們的任意組合。因而細胞可包括細胞、細菌芽孢、真菌、病毒顆粒、單細胞真核有機體(例如，原生動物、酵母等)、從多細胞有機體(例如，原代細胞、培養(yǎng)細胞、組織、整個有機體等)中分離或聚集的細胞或以上的任意組合等。
[0070]術(shù)語“細胞樣品”是指任何含有細胞的樣品。如本文所使用，細胞樣品包括人類、植物、動物、食物、農(nóng)業(yè)或環(huán)境來源的樣本，如鼻拭物子、血液、糞便、血漿、組織、葉片、水和土壤樣品。優(yōu)選地，細胞樣品包含以不干擾磁力攪拌元件運轉(zhuǎn)的濃度懸浮于液體介質(zhì)的細胞。
[0071]關(guān)于細胞的術(shù)語“裂解”意指破碎細胞至少一部分的完整性，以從破碎的細胞中釋放細胞內(nèi)組分，如核酸和蛋白。
[0072]術(shù)語“均質(zhì)化”是指混合(不同的成分，例如糞便、組織、痰、唾液)成均勻的混合物。
[0073]可以任意適合的濃度懸浮真核細胞、原核細胞和/或病毒。在一些實施方案中，以I?IxlO1t3細胞/ml，I?IxlO5細胞/ml，或IxlO3?IxlO4細胞/ml等濃度范圍懸浮真核細胞和/或原核細胞。在一些實施方案中，以I?IxlO13顆粒/ml，I?Ix1iq顆粒/ml，或Ix15?IxlO7顆粒/ml的濃度范圍懸浮病毒顆粒。
[0074]液體介質(zhì)可以是等滲的、低滲的或高滲的。在一些實施方案中，液體介質(zhì)是水性的。在某些實施方案中，液體介質(zhì)包含緩沖液和/或至少一種鹽或鹽的組合。在一些實施方案中，液體介質(zhì)的pH范圍為約5至約8，約6至8，或約6.5至約8.5?？墒褂酶鞣NpH緩沖液以達到期望的pH。適合的緩沖液包括但不限于，Tris、MES、Bis-Tris、ADA、ACES、PIPES、MOPSO、Bis-Tris 丙燒、BES、M0PS、TES、HEPES、DIPS0、M0BS、TAPS0、HEPPS0、P0PS0、TEA、HEPPS、!'!■;[(^116、617-617、13;[(^116以及磷酸鹽緩沖液(例如，磷酸鈉或磷酸鈉-鉀等)。液體介質(zhì)可包含約1mM至約10mM的緩沖液，約25mM至約75mM的緩沖液或約40mM至約60mM的緩沖液等。液體介質(zhì)中所使用的緩沖液的種類和量可因應(yīng)用而不同。在一些實施方案中，液體介質(zhì)具有約7.4的pH，其可以利用約50mM的Tris緩沖液來達到。在一些實施方案中，液體介質(zhì)是水。
[0075]小室可以是任何適合的材料、大小和形狀的容器。在某些實施方案中，小室是塑料容器。小室的形狀可以是，例如微離心管(例如Eppendorf管)、離心管、小瓶、微孔板。小室可以是僅限定用于容納細胞、珠子和攪拌元件的一個隔室/小室，或者是用于容納相互隔離的混合物(細胞、珠子和攪拌元件)的多個離散的隔室/小室(例如孔陣列)。小室可以是密封的或可密封的容器，如具有蓋、帽或套的容器。內(nèi)表面可以是化學(xué)惰性的，以保持目的分析物的完整性。
[0076]細胞裂解珠可以是硬度大于細胞硬度的任何顆粒樣和/或珠子樣結(jié)構(gòu)。細胞裂解珠可以由塑料、玻璃、陶瓷、金屬和/或任何其他適合的材料制成。在某些實施方案中，細胞裂解珠可以由非磁性材料制成。在某些實施方案中，細胞裂解珠圍繞至少一個軸線旋轉(zhuǎn)對稱(例如，球形、圓形、卵形、橢圓形、蛋形和滴狀顆粒)。在其他的實施中，細胞裂解珠具有多面體形狀。在一些實施方案中，細胞裂解珠是不規(guī)則形狀的顆粒。在一些實施方案中，細胞裂解珠是具有突起的顆粒。在某些實施方案中，添加到每個裂解容器內(nèi)的珠子的量的范圍是I?1，OOOmg，I?100mg，I?10mg，I?1mg等。
[0077]在某些實施方案中，細胞裂解珠的直徑范圍為10?l，000ym，20-400ymS50-200ym等。
[0078]磁力攪拌元件可以是任何形狀，并且應(yīng)當(dāng)小到足以能夠放置于容器中，并在容器內(nèi)移動或旋轉(zhuǎn)或攪動。磁力攪拌元件可以是棒狀、柱形、十字形、V-形、三角形、矩形、桿或盤狀攪拌元件等。在一些實施方案中，磁力攪拌元件具有矩形形狀。在一些實施方案中，磁力攪拌子具有兩端分叉的音叉狀。在一些實施方案中，磁力攪拌子具有V-樣形狀。在一些實施方案中，磁力攪拌子具有梯形形狀。在某些實施方案中，攪拌元件的最長尺寸略微小于容器的直徑(例如，為容器的直徑的約75-95%)。在某些實施方案中，磁力攪拌元件涂有化學(xué)惰性材料，如聚合物、玻璃或陶瓷(例如瓷)。在某些實施方案中，聚合物為生物相容性聚合物如PTFE和聚對二甲苯(paralyne)。
[0079]可以將細胞懸浮液、細胞裂解珠和磁力攪拌元件按任意順序放置到小室中。在一些實施方案中，將細胞懸浮液在細胞裂解珠和磁力攪拌元件之前添加到小室中。在其他實施方案中，將細胞裂解珠和/或磁力攪拌元件在細胞之前(例如，細胞懸浮液之前)放置到小室中。
[0080]小室，特別是細胞、珠子和磁力攪拌元件位于變化磁場的操作范圍內(nèi)。例如，小室可以位于轉(zhuǎn)動磁場的操作范圍內(nèi)(例如通過在磁力攪拌器上或鄰近磁力攪拌器放置容器)。變化的磁場驅(qū)動攪拌元件運動，如轉(zhuǎn)動運動、往復(fù)運動或它們的組合等，其依次驅(qū)動珠子、細胞和液體介質(zhì)。在一些實施方案中，用磁力攪拌元件以足以裂解容器內(nèi)的細胞的轉(zhuǎn)動速率和持續(xù)時間來攪拌細胞懸浮液。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)動速率和持續(xù)時間由應(yīng)用而定，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗來確定。一般而言，足以裂解細胞的轉(zhuǎn)動速率由諸如以下的因素決定:細胞種類、細胞懸浮液的濃度、細胞懸浮液的體積、磁力攪拌元件的大小和形狀、細胞裂解珠的量/數(shù)量、大小、形狀和硬度、以及小室的大小和形狀。
[0081 ] 在某些實施方案中，磁力攪拌元件以1000?6000rpm，優(yōu)選約5000rpm的速率轉(zhuǎn)動1-600秒，優(yōu)選約90?120秒的時間段。在某些實施方案中，將小室(例如試管或微離心管形狀)放置于在磁力攪拌器(例如VP710C1旋磁回轉(zhuǎn)式攪拌器，5000RPM，14cm長的可用攪拌平臺，具有電機外殼和板夾，攪動2深孔微板或6標(biāo)準(zhǔn)微板-115伏AC-60Hz，V&P Scientific)的架子上，并且以最高速率設(shè)置(>1000rpm)攪動。在其他實施方案中，小室是微板，如ELISA板中的孔。在其他實施方案中，小室是具有細胞入口和細胞出口的柱形小室。
[0082]在某些實施方案中，通過在磁力攪拌元件附近轉(zhuǎn)動磁體，優(yōu)選永久性磁體，來產(chǎn)生變化的磁場。磁體可以圍繞穿過磁體中心的軸線在裂解室之上、之下或側(cè)面轉(zhuǎn)動。在某些實施方案中，將小室放置在垂直于小室所在的表面的位置，并且磁體圍繞同樣垂直于小室所在的表面的軸線轉(zhuǎn)動。在其他實施方案中，將小室放置在垂直于小室所在的表面的位置，并且磁體圍繞平行于小室所在的表面的軸線轉(zhuǎn)動。在其他實施方案中，將小室放置在垂直于小室所在的表面的位置，并且磁體圍繞與小室所在的表面形成角度的軸線轉(zhuǎn)動。所述角度大于O度且小于180度。在其他實施方案中，磁體還具有細長的形狀，并且圍繞沿著磁體最長的尺寸延伸的軸線轉(zhuǎn)動。
[0083]圖3給出柱形磁體301和裂解室303的相對位置。磁體301圍繞軸線A轉(zhuǎn)動并引起小室303中的磁力攪拌元件305以同一方向沿著軸線B轉(zhuǎn)動。轉(zhuǎn)動的磁力攪拌元件305與珠子307相碰撞并且在該過程中裂解細胞309。磁體301可以定位在小室303的側(cè)面、之上、之下或?qū)恰Ｔ诒緦嵤┓桨钢?，小?03具有入口311和出口313，以便于小室的裝卸。
[0084]在某些實施方案中，提高攪拌子元件的轉(zhuǎn)動速率以提高裂解效率并減少實現(xiàn)裂解所需的時間。在某些其他實施方案中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)動的速率使得僅裂解某些種類的細胞。例如，在含有多種細胞的細胞懸浮液中，攪拌元件可以第一速率轉(zhuǎn)動以裂解第一組細胞，然后以第二速率轉(zhuǎn)動以裂解第二組細胞。在其他實施方案中，將容器與溫度調(diào)節(jié)組件相結(jié)合，所述溫度調(diào)節(jié)組件控制裂解過程之前、期間和/或之后的細胞懸浮液溫度。在某些實施方案中，細胞懸浮液的溫度保持在8-2 °C。
[0085]在某些實施方案中，在攪拌步驟之前和/或期間通過將添加劑添加到細胞懸浮液中可促進特定細胞種類的裂解。添加劑的例子包括酶、去污劑、表面活性劑和其他化學(xué)品如堿和酸。已發(fā)現(xiàn)堿性條件(例如1mM NaOH)可在攪拌期間提高某些細胞種類的裂解效率。在攪拌期間還可以或可選擇地加熱細胞懸浮液以提高裂解效率。然而，添加劑對下游處理步驟包括核酸擴增和檢測可能是有害的。期望的是在消除需要添加劑的情況下實現(xiàn)有效裂解，因為可以極大地簡化樣本處理。
[0086]攪拌子/珠子組合提供許多優(yōu)于常規(guī)裂解方法的優(yōu)點。攪拌子/珠子法比化學(xué)法和酶法更快速，并且提供比許多其他類型的物理裂解法改善的細胞或病毒裂解。攪拌子/珠子法還適于利用機器人學(xué)和/或微流體學(xué)的自動化。磁源是可重復(fù)使用的，并且無需精確對準(zhǔn)器皿，可以驅(qū)動多個小室。磁力攪拌子元件的低成本使其可以是一次性的。
[0087]還公開了用于裂解細胞的裝置。所述裝置包括具有磁力攪拌元件和放置在其中的多個細胞裂解珠的小室。使用者可以簡單地將細胞懸浮液添加到小室內(nèi)，將小室放置在磁力攪拌器上，并且用磁力攪拌元件以足以裂解細胞的速率攪拌細胞懸浮液。
[0088]還公開了用于裂解細胞的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括具有磁力攪拌元件和放置在其中的多個細胞裂解珠的小室，以及產(chǎn)生轉(zhuǎn)動磁場的磁力攪拌器，其中所述磁力攪拌元件在放置于轉(zhuǎn)動磁場的操作范圍內(nèi)時能夠在小室內(nèi)轉(zhuǎn)動。
[0089]在某些實施方案中，所述系統(tǒng)還包括配置以固定小室的架子。架子可以被配置成固定多個小室，并且可以被放置在磁力攪拌器的支撐表面，用于同時處理多個樣品。為了貯存的目的，架子還可以被用作小室的固定器。例如，可以將多個小室放置在架子上并貯存于冰箱或冰柜，用于進一步的分析。小室可以與外部儀器(例如液體處理機器人，微流體裝置，分析儀器)連接。
[0090]還公開了從細胞中純化核酸的方法。所述方法包括向包含細胞、攪拌元件和多個珠子的器皿施加磁場，其中所述磁場引起攪拌元件與多個珠子相碰撞并產(chǎn)生細胞裂解物；以及從細胞裂解物中分離核酸。
[0091]還公開了從細胞中擴增多核苷酸的方法。所述方法包括向包含細胞、攪拌元件和多個珠子的器皿施加磁場，其中所述磁場引起攪拌元件與多個珠子相碰撞并產(chǎn)生細胞裂解物；以及從細胞裂解物中擴增多核苷酸。
[0092]還公開了從細胞中檢測多核苷酸的方法。所述方法包括向包含細胞、攪拌元件和多個珠子的器皿施加磁場，其中所述磁場引起攪拌元件與多個珠子相碰撞并產(chǎn)生細胞裂解物；以及從細胞裂解物中檢測多核苷酸。在某些實施方案中，檢測步驟包括從細胞裂解物中分離核酸，從所分離的核酸中擴增多核苷酸，以及檢測所擴增的多核苷酸。
實施例
[0093]實施例1:大腸桿菌細胞的裂解
[0094]將大腸桿菌細胞以14細胞/ml的濃度懸浮于Tris-EDTA緩沖液中。將I毫升細胞懸浮液添加到包含800mg玻璃珠(106μπι或更細，Sigma G8893)和磁力攪拌盤(VP-7195超回轉(zhuǎn)式攪拌盤，V&P Scientif ic)的小室(2ml塑料小瓶，Wheaton)中。
[0095]然后將塑料小瓶放置在磁力攪拌器(VP710C1旋磁回轉(zhuǎn)式攪拌器，5000RPM，V&PScientific)上，并于5000rpm下攪拌30秒、I分鐘或2分鐘。利用珠磨器(Mini Bead Beater-1 ,B1spec)根據(jù)廠商說明書于4800rpm下處理陽性對照樣品2分鐘。未處理的細胞懸浮液用作對照。然后利用Roche LightCycler 480對所裂解的細胞和對照的特定基因進行實時PCR擴增ο擴增條件如下:95 °C，250秒；接著進行45個循環(huán)(95 °C，10秒;60 °C，20秒;和72 °C，10秒);以及最后循環(huán)40°C，10秒。
[0096]如圖4和圖5所示，珠子/攪拌子法(30s混合，Im混合和2m混合)提供了比珠磨法(2m珠磨)更好的細胞裂解。
[0097]實施例2:蘇云金芽孢桿菌芽孢的裂解
[0098]將蘇云金芽孢桿菌芽孢以14細胞/ml的濃度懸浮于水中。將500μ1細胞懸浮液添加到包含800mg玻璃珠(106μπι或更細，Sigma G8893)和磁力攪拌盤(VP-7195超回轉(zhuǎn)式攪拌盤，V&P Scientif ic)的2ml塑料小瓶(Wheaton)中。
[0099]然后將塑料小瓶放置在磁力攪拌器(VP710C1旋磁回轉(zhuǎn)式攪拌器，5000RPM，V&PScientif ic)上，并于5000rpm下攪拌1.5分鐘或2分鐘。利用珠磨器(Mini Bead Beater-1,B1spec)根據(jù)廠商說明書處理陽性對照樣品2分鐘。未處理的細胞懸浮液用作對照。然后利用Roche LightCycler480，在實施例1所述條件下，對所裂解的細胞和對照蘇云金芽孢桿菌的特定基因進行實時PCR擴增。
[0100]如圖3至圖6所示，珠子/攪拌子法(1.5m混合和2m混合)提供了比珠磨法(2m珠磨)更好的細胞裂解。
[0101]實施例3:裂解時間和珠子混合器速率對金黃色葡萄球菌細胞的實時PCR反應(yīng)的影響
[0102]利用實施例2所述的相同儀器和步驟，將金黃色葡萄球菌細胞懸浮并在不同的混合器速率下裂解不同的時間段。
[0103]圖9顯示了裂解時間和珠子混合器速率對金黃色葡萄球菌細胞的實時PCR反應(yīng)的影響。當(dāng)珠子混合器以高速率運轉(zhuǎn)時，金黃色葡萄球菌細胞在2分鐘內(nèi)實現(xiàn)有效裂解。較低的速率需要較長的裂解時間。未裂解的芽孢具有無裂解(O分鐘)就可檢測到的低水平的細胞外DNA。少量游離DNA結(jié)合到玻璃珠上。珠子混合器速率為100相當(dāng)于5000rpm。
[0104]實施例4:裂解時間和珠子混合器速率對蘇云金芽孢桿菌芽孢的實時PCR反應(yīng)的影響
[0105]利用實施例2所述的相同儀器和步驟，將蘇云金芽孢桿菌芽孢懸浮并在不同的混合器速率下裂解不同的時間段。
[0106]圖10顯示了裂解時間和珠子混合器速率對蘇云金芽孢桿菌芽孢的實時PCR反應(yīng)的影響。當(dāng)珠子混合器以高速率運轉(zhuǎn)時，蘇云金芽孢桿菌芽孢在2分鐘內(nèi)實現(xiàn)有效裂解。較低的速率需要較長的裂解時間。未裂解的芽孢具有無裂解(O分鐘)就可檢測到的低水平的細胞外DNA。少量游離DNA結(jié)合到玻璃珠上。珠子混合器速率為100相當(dāng)于5000rpm。
[0107]為了便于理解本發(fā)明的結(jié)構(gòu)和實施原理，本發(fā)明已根據(jù)具體實施方案結(jié)合詳述進行了描述。本文這種對具體實施方案及其詳述的參照并不意欲限制所附權(quán)利要求書的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不脫離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的情況下，可以對所選擇的實施方案進行修改。
【主權(quán)項】
1.在器皿內(nèi)裂解細胞的方法，所述方法包括: 將所述器皿放置在表面上，其中所述器皿包含懸浮于液體介質(zhì)中的一種或多種細胞、一個或多個磁力攪拌子和多個珠子;以及 沿著軸線轉(zhuǎn)動柱形磁體，其中所述軸線穿過所述柱形磁體中心，在所述器皿附近并平行于所述器皿所在的表面以使得所述器皿位于由所述柱形磁體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)動磁場的操作范圍內(nèi)，以及其中所述轉(zhuǎn)動所述柱形磁體引起所述器皿中的所述一個或多個磁力攪拌子與所述珠子相碰撞，所產(chǎn)生的力足以使所述一種或多種細胞破碎，從而在所述器皿內(nèi)裂解所述一種或多種細胞。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述磁體是永久性磁體。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)動所述柱形磁體引起所述器皿中的所述一個或多個磁力攪拌子以大于100rpm的速率轉(zhuǎn)動。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)動所述柱形磁體引起所述器皿中的所述一個或多個磁力攪拌子轉(zhuǎn)動約I分鐘至約15分鐘的時間。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述器皿為選自以下的形式:小瓶、試管、微板孔和流動腔。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述器皿包含兩種或更多種特定類型的細胞，所述細胞包括真核細胞、原核細胞、病毒、內(nèi)生芽孢或其任意組合，以及其中所述轉(zhuǎn)動步驟包括: 以致使第一特定類型的細胞裂解而不裂解器皿中其他類型的細胞的第一速率轉(zhuǎn)動所述磁體。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)動步驟還包括: 以致使第二特定類型的細胞裂解的第二速率轉(zhuǎn)動所述磁體，所述第二特定類型的細胞不同于所述第一速率致使其先裂解的細胞類型。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多個珠子包括玻璃珠、塑料珠、陶瓷珠、金屬珠或它們的混合物。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一個或多個磁力攪拌子包含金屬或合金。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一個或多個磁力攪拌子包含涂有聚合物的合金核心。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述聚合物包含生物相容性聚合物。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述生物相容性聚合物包含聚四氟乙烯(PTFE)或聚對二甲苯。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種細胞是真核細胞或原核細胞，并且其中所述真核細胞或原核細胞以I?1χ101()細胞/ml的濃度范圍懸浮于液體介質(zhì)中。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種細胞是病毒顆粒，并且其中所述病毒顆粒以I?IxlO13顆粒/ml的濃度范圍懸浮于液體介質(zhì)中。
【文檔編號】B02C17/20GK105969761SQ201510589994
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2010年9月20日
【發(fā)明人】菲利普·貝爾格雷德爾, 本杰明·赫因德森
【申請人】阿科尼生物系統(tǒng)公司, 伯樂實驗室公司