專利名稱：一種乙型肝炎病毒核心蛋白突變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及構(gòu)建將野生型蛋白進(jìn)行突變的顯性負(fù)調(diào)節(jié)或性狀缺失突變體(Dominantnegative mutant，DNM)方法。本發(fā)明還提供了HBV核心蛋白突變體，以及將構(gòu)建的突變體基因用于治療乙型肝炎的用途。
顯性負(fù)調(diào)節(jié)或性狀缺失突變體(Dominant negative mutant，DNM)方法是將野生型蛋白進(jìn)行突變。突變蛋白與野生型蛋白共表達(dá)后，前者以某種方式干擾后者發(fā)揮作用。原野生型蛋白的性狀被突變蛋白消除。換言之，此時(shí)共表達(dá)的性狀由突變蛋白決定，其作用是負(fù)調(diào)節(jié)甚至是缺失了野生型蛋白的功能。DN突變體策略是后基因組研究中重要的方法，多種蛋白質(zhì)功能鑒定已由DN突變體法實(shí)現(xiàn)。DN突變體法同樣可用于病毒性感染治療研究。將抑制病毒復(fù)制或/和表達(dá)的突變蛋白導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，對其中已感染的病毒具有抑制作用，而對于健康細(xì)胞則可以抵御病毒的攻擊。針對兩種轉(zhuǎn)化細(xì)胞而言，均獲得了抗病毒感染的免疫力，這種形式的抗病毒免疫由于是細(xì)胞內(nèi)目的基因(gene of interest)的表達(dá)而產(chǎn)生的，因此稱其為細(xì)胞內(nèi)免疫(intracellular immunization)。
HBV基因組是一部分雙鏈的環(huán)狀DNA分子，有X，C，S，P四個(gè)開放讀碼框架。其中3.5kbmRNA與2.4kb mRNA編碼的核心蛋白、多聚酶及表面蛋白參與HBV成熟顆粒的包裝。病毒包裝始于3.5kb前基因組RNA 5′端ε信號與多聚酶的結(jié)合，外覆以180個(gè)二聚體C蛋白，形成正二十面體立體對稱衣殼結(jié)構(gòu)。C蛋白N端前139位氨基酸為二聚體核心蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而富含精氨酸的140-183位氨基酸是HBV DNA正鏈合成位點(diǎn)，同時(shí)起到穩(wěn)定二聚體的作用。HBV顆粒包裝的特點(diǎn)，為利用DN突變體基因治療HBV感染提供了依據(jù)。利用突變型HBV C蛋白競爭性結(jié)合野生型C蛋白形成嵌合二聚體，該嵌合二聚體的摻入使二十面體核衣殼形成障礙。裸露的前基因組RNA于胞內(nèi)降解。這種核心蛋白顯性負(fù)調(diào)節(jié)突變體，已證明在體外有明顯抑制HBV顆粒包裝的作用，并有望成為體內(nèi)基因治療HBV持續(xù)感染的理想方法。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供一種構(gòu)建顯性負(fù)調(diào)節(jié)突變體的方法。
本發(fā)明的目的尤其是在于提供一種制備人乙型肝炎核心蛋白突變體的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供基因治療HBV持續(xù)感染的方法和藥物。
本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的還在于提供構(gòu)建治療腫瘤和慢性傳染病的顯性負(fù)調(diào)節(jié)突變體的方法。技術(shù)方案為上述目的，我們構(gòu)建表達(dá)了HBV核心蛋白突變體，該突變體具有抑制HBV包裝的DN作用。
采用的技術(shù)方案如下從質(zhì)粒pHBV-A1中擴(kuò)增出全長HBV C基因和S基因，克隆并構(gòu)建了pGEM-T-C和pGEM-T-S重組質(zhì)粒，進(jìn)而構(gòu)建出攜帶突C基因(即C基因與S基因之融合基因)的pGEM-T-CS質(zhì)粒，并得到含有突變型C基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1+-CS?；驕y序表明兩基因融合正確。該核心蛋白與表面蛋白融合基因是核心蛋白基因3′末端延伸突變基因。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化HepG2215及HepG2細(xì)胞，用HBV陽性血清感染HepG2后，Pugh法抽提HepG2215及HepG2細(xì)胞HBV顆粒內(nèi)DNA，行斑點(diǎn)雜交。RT-PCR及免疫組織化學(xué)證實(shí)突變型核心蛋白分別在HepG2215和HepG2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平低于對照組。HBV顆粒內(nèi)DNA量的降低相當(dāng)于成熟病毒顆粒數(shù)量的減少，由此證實(shí)突變型核心蛋白通過干擾野生型核心蛋白包裝核心顆粒，致使成熟HBV顆粒數(shù)量下降。表達(dá)了突變型核心蛋白的HepG2215及HepG2細(xì)胞獲得了針對HBV感染的細(xì)胞內(nèi)免疫力。發(fā)明效果本發(fā)明所構(gòu)建的pcDNA3.1+-CS真核表達(dá)載體可以在HepG2215及HepG2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出突變型核心蛋白，且該突變型核心蛋白具有抗HBV顆粒包裝的顯性負(fù)調(diào)節(jié)/性狀缺失功能。轉(zhuǎn)化細(xì)胞因此獲得了不同程度的胞內(nèi)免疫能力。核心蛋白突變體的克隆成功，為抗HBV持續(xù)性感染提供了嶄新的治療手段。除胞內(nèi)免疫外，突變型核心蛋白由于是核心蛋白與表面蛋白的融合，而保留了全部遺傳信息的核心蛋白及表面蛋白同時(shí)激發(fā)了體液和細(xì)胞免疫，使機(jī)體獲得了體液免疫的保護(hù)。所構(gòu)建的核心蛋白突變體具有胞內(nèi)免疫和體液免疫雙重保護(hù)作用。是一種既能治病又能防病的基因工程蛋白。
附圖2含HBV核心蛋白突變體基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1+-CS構(gòu)建流程圖。通過兩株方向相反的含C基因和S基因亞克隆載體pGEM-T-C及pGEM-T-S的酶切、連接，從而實(shí)現(xiàn)了C基因與S基因的融合。融合基因與去磷酸化的顯性pcDNA3.1+連接，得到含有融合基因的pcDNA3.1+-CS真核表達(dá)載體。核心蛋白C末端與表面蛋白N末端完整讀框融合蛋白可以認(rèn)為是核心蛋白C末端延長突變體。
附圖3HepG2215細(xì)胞中的HBV顆粒內(nèi)DNA斑點(diǎn)雜交檢測結(jié)果。3-6組1-4組是轉(zhuǎn)化并表達(dá)出核心蛋白突變體的HepG2215細(xì)胞內(nèi)HBV DNA雜交點(diǎn)，而第1組HepG2215細(xì)胞只轉(zhuǎn)化了空載體pcDNA3.1+；第2組HepG2215細(xì)胞無任何轉(zhuǎn)化。與前兩組比較，3-6組HBV DNA量有不同程度地降低。
附圖4HepG2215細(xì)胞中的HBV顆粒內(nèi)DNA斑點(diǎn)雜交灰度掃描量化直方圖。與第2組比較，第3到第6組HBV DNA量降低了56％、90％、30％、70％。
附圖5HepG2細(xì)胞中的HBV顆粒內(nèi)DNA斑點(diǎn)雜交檢測結(jié)果。1-4組是轉(zhuǎn)化并表達(dá)出核心蛋白突變體的HepG2細(xì)胞內(nèi)HBV DNA雜交點(diǎn)，而第5組HepG2細(xì)胞只轉(zhuǎn)化了空載體pcDNA3.1+；第6組HepG2細(xì)胞無任何轉(zhuǎn)化。可見，與第5，6組比較，表達(dá)了核心蛋白突變體的1-4組HepG2細(xì)胞內(nèi)HBV顆粒中DNA量不同程度降低。
附圖6HepG2細(xì)胞中的HBV顆粒內(nèi)DNA斑點(diǎn)雜交灰度掃描量化直方圖。與第6組比較，第1到第4組HBV DNA量降低了42％、58％、40％、45％。
附圖7包含HBV核心蛋白突變體基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+-CS全序列，其中劃線部分為HBV核心蛋白突變體基因即核心蛋白與表面蛋白融合基因序列。
實(shí)施例現(xiàn)結(jié)合


和實(shí)施例，對本發(fā)明作詳細(xì)解釋1材料pHBVadr1-A1含有全長adr1亞型HBV基因組，由上海醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室袁正宏教授惠贈(zèng)。克隆載體pGEM-T及工具酶等購自大連TaKaRa公司。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、Lipofectamine購自GIBCO公司。HBV陽性血清取自臨床病人，抽提的病毒基因組DNA經(jīng)PCR證實(shí)HBV DNA陽性。真核表達(dá)載體pcDNA3.1+、大腸桿菌DH5α和HepG2細(xì)胞株等為本室保存。GIBCO公司DIG DNA標(biāo)記檢測試劑盒由上海長海醫(yī)院藥學(xué)部劉厚佳碩士提供。2合成擴(kuò)增全長核心蛋白基因與表面蛋白基因引物，并引入合適的限制性酶切位點(diǎn)。
Cu5′ATCGATAAGCTTATGGACATTGACCCG 3′Cd5′GGATCCGAATTCACATTAAGATTCCCG 3′Su5′GGATCCGAATTCATGGAGAGCACAACA 3′Sd 5′ATCGATAAGCTTTCAAATGTATACCCA 3′AAGCTT及GAATTC分別為HindIII和EcoRI內(nèi)切位點(diǎn)。
3HBV核心蛋白突變體基因的克隆用PCR法從質(zhì)粒pHBV-A1中擴(kuò)增出C和S區(qū)全基因。擴(kuò)增參數(shù)為94℃ 5min后，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s循環(huán)反應(yīng)30次；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)膠回收，純化后與亞克隆載體pGEM-T連接。轉(zhuǎn)化鈣化菌DH5α，涂布含氨芐青霉素之篩選瓊脂糖平板，挑選菌落擴(kuò)增培養(yǎng)。抽提質(zhì)粒，以HindIII/EcoRI雙酶切后，選出插入正向C基因的pGEM-T-C和反向S基因的pGEM-T-S克隆。用EcoRI/PstI分別消化pGEM-T-C及pGEM-T-S，低熔點(diǎn)膠回收并將有C基因載體部分與S基因連接后，得到含有突變型C基因(核心蛋白與表面蛋白融合基因)的克隆載體pGEM-T-CS。雙脫氧法測定質(zhì)粒中融合基因序列，選用T7和SP6為測序引物，從C基因上游和S基因下游相向重疊測序。結(jié)果顯示兩基因無致死性點(diǎn)突變，讀框完整，基因拼接正確。再以HindIII酶消化pGEM-T-CS，回收CS融合片段。將CS融合基因片段與去磷酸化的線性載體pcDNA3.1+連接，酶切及PCR鑒定后得到含有突變型核心蛋白基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1+-CS(圖1)。
4 pcDNA3.1+-CS經(jīng)Lipofectamine介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2215及HepG2細(xì)胞，再以G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)胞克隆。抽提HepG2215細(xì)胞內(nèi)總RNA，以oligo dT引物M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶成cDNA后，Cu/Sd為引物PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)同前擴(kuò)增C，S基因參數(shù)。轉(zhuǎn)化HepG2細(xì)胞涂片。以小鼠HBsAb單抗免疫結(jié)合后，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗結(jié)合一抗，以DAB/H2O為底物顯色。RT-PCR和免疫組織化學(xué)法均證實(shí)重組突變體蛋白在HepG2215及HepG2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
5Pugh法抽提HepG2215及HepG2胞漿HBV顆粒內(nèi)DNA0.1％NP40裂解細(xì)胞釋放出HBV顆粒，13000rpm離心移上清。DNase I(type II)100ug/ml終濃度消化含HBV上清后PEG8G00沉淀HBV顆粒。重溶后重復(fù)DNase I(type II)100ug/ml消化上清。0.5％SDS及0.5mg/ml蛋白酶K裂解HBV顆粒，釋放之HBV DNA以酚氯仿抽提，無水乙醇沉淀，70％乙醇再洗后溶于10μl TE溶液。抽提之DNA 5μl行斑點(diǎn)雜交檢測HBV檢測用探針采用DIG隨機(jī)引物標(biāo)記。膜在6×SSC溶液中浸泡5min。濾紙吸干，80℃烤2h。將已轉(zhuǎn)移固定的雜交膜以6×SSC濕潤并浸泡2min。將濕潤的雜交膜裝入雜交袋中，按0.2ml/cm2加入預(yù)雜交液。68℃水浴搖床預(yù)雜交1-2h。倒出預(yù)雜交液。以100pg/ml合成引物進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，68℃孵育12小時(shí)。以2×SSC，0.1％SDS室溫5min，洗膜兩次。0.1×SSC，0.1％SDS68℃，15min，洗膜兩次。在雜交及嚴(yán)格洗膜后將膜在洗滌液中稍事漂洗1-5min。在4ml封閉液中孵育30min，25℃。在封閉液中將抗DIG-AP稀釋到150mU/ml，將膜在1ml抗體溶液中孵育30min。用4ml洗滌液中洗兩次，每次15min。在1ml無底物顯色液中平衡2-5min。在黑暗中把封閉的膜以0.4ml新配制的含底物NBT/BCIP顯色液孵育，勿搖動(dòng)。16h后，將膜用2ml水洗5min以終止反應(yīng)。雜交點(diǎn)以Scanmaker掃描，Smartscape圖象分析斑點(diǎn)雜交灰度積分差異。結(jié)果顯示表達(dá)了突變型核心蛋白的HepG2215及HepG2細(xì)胞內(nèi)HBV顆粒中DNA量不同程度地低于陰性對照組(圖2，3)。HBV顆粒內(nèi)DNA量的降低相當(dāng)于成熟病毒顆粒數(shù)量的減少，由此證實(shí)突變型核心蛋白通過干擾野生型核心蛋白包裝核心顆粒致使病毒數(shù)量減少。表達(dá)了突變型核心蛋白的HepG2215及HepG2細(xì)胞獲得了抗HBV感染的胞內(nèi)免疫。
以上工作表明，本研究所構(gòu)建的pcDNA3.1+-CS真核表達(dá)載體可以在HepG2215及HepG2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出突變型核心蛋白，且該突變型核心蛋白具有抗HBV顆粒包裝的顯性負(fù)調(diào)節(jié)/性狀缺失功能。轉(zhuǎn)化細(xì)胞因此獲得了不同程度的胞內(nèi)免疫能力。核心蛋白突變體的克隆成功，為抗HBV持續(xù)性感染提供了嶄新的治療手段。除胞內(nèi)免疫外，突變型核心蛋白由于是核心蛋白與表面蛋白的融合，而保留了全部遺傳信息的核心蛋白及表面蛋白同時(shí)激發(fā)了體液和細(xì)胞免疫，使機(jī)體獲得了體液免疫的保護(hù)。因此，我們所構(gòu)建的核心蛋白突變體具有胞內(nèi)免疫和體液免疫雙重保護(hù)作用。是一種既能治病又能防病的基因工程蛋白。
SEQ1GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCGCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCTCCTCACCATACAGCACTAAGGCAAGAGATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCATCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCATCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTGAAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTACTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCTTGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTGGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTGAATTCATGGAGAGCACAACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACCCACGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGGTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTGAAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTA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權(quán)利要求
1.一種將野生型蛋白進(jìn)行突變的方法，其特征是構(gòu)建顯性負(fù)調(diào)節(jié)或性狀缺失突變體，該方法包括下列步驟a構(gòu)建含有特定基因突變的表達(dá)載體，b利用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化特定靶細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征是包含真核表達(dá)載體，該真核表達(dá)載體包括pcDNA 3.1+等具有類似功能的載體。
3.權(quán)利要求1所述的特定基因，其特征是與病原生物的致病性有關(guān)。
4.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征是含有乙肝炎病毒核心蛋白基因和表面蛋白基因的真核表達(dá)載體pcDNA 3.1+-CS。
5.按權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于乙肝炎病毒核心蛋白基因3′端與全長表面蛋白基因5′融合。
6.按權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，具備SEQ1所述的核苷酸序列GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCTCCTCACCATACAGCACTAAGGCAAGAGATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCATCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCATCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTGAAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTACTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCTTGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTGGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTGAATTCATGGAGAGCACAACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACCCACGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGGTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTGAAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
7.權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體在治療HBV感染中的應(yīng)用，其特征是包含有HBV核心蛋白突變體基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
8.含有權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體的胞內(nèi)免疫疫苗，其特征是包括HBV核心蛋白突變體基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
9.含有權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體的重組免疫疫苗，其特征在于包括HBV核心蛋白突變體基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
10.HBV核心蛋白突變體在治療乙型肝炎中的應(yīng)用，其特征在于包括HBV核心蛋白突變體基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明采用PCR技術(shù)從含有HBV全基因序列的質(zhì)粒pHBV－A1中擴(kuò)增出全長HBV C基因與S基因，經(jīng)酶切連接后實(shí)現(xiàn)了兩基因的融合，并進(jìn)一步構(gòu)建成含有核心蛋白與表面蛋白融合基因(核心蛋白突變體)的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.文檔編號C12N15/31GK1470637SQ0213617
公開日2004年1月28日 申請日期2002年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月24日
發(fā)明者戚中田, 武文斌, 潘衛(wèi), 曹廣文 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)