專利名稱：用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的引物組合物、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的引物組合物、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
近年來，葡萄球菌感染率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcusaureus，MRSA)禾口耐甲氧西林 疑固醇陰性葡萄球菌(Metici 11 in-sensitive coagulase-negativeStaphylococcus, MSCNS)的耐藥性逐漸加強(qiáng)，而后者還被稱為耐甲氧西林表皮葡萄球菌。其中，MRSA位居醫(yī)院感染病原菌之首， MRSA感染與乙型病毒性肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征被認(rèn)為是目前世界上最難解決的三大感染性難題。細(xì)菌的耐藥性是指細(xì)菌多次與藥物接觸后，對藥物的敏感性減小甚至消失，致使藥物對耐藥菌的療效降低甚至無效。長久以來，細(xì)菌的耐藥性并未引起足夠的重視，醫(yī)生們相信現(xiàn)有藥物對付耐藥菌已經(jīng)是綽綽有余。比如對天然青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌，可以應(yīng)用氨芐青霉素；當(dāng)氨芐青霉素?zé)o效時，還可以換用頭孢菌素；甚至于對頭孢菌素耐藥的MRSA，人們還有最后一道防線——萬古霉素。但是在1992年，美國首次發(fā)現(xiàn)了對萬古霉素產(chǎn)生耐藥性的MRSA，這幾乎將醫(yī)生逼到無藥可用的尷尬境地。在我國，濫用抗生素的情況十分普遍。據(jù)調(diào)查，我國約有75%的門診感冒患者應(yīng)用抗生素，而外科手術(shù)的圍手術(shù)期應(yīng)用抗生素的情況則高達(dá)95%。在住院患者中，抗生素應(yīng)用率為79%，這一數(shù)字遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于英國的22%和各國的平均水平30%。同時，由于醫(yī)生濫開氨芐西林等廣譜抗菌類藥物，導(dǎo)致人體內(nèi)菌群失調(diào)并誘發(fā)二次感染的情況更是屢見不鮮。我國在職醫(yī)生中不少人至今仍用天然青霉素對付耐藥性早已達(dá)98%的金葡菌。另外，有的醫(yī)院不做藥敏試驗就使用抗生素的情況也十分嚴(yán)重。藥敏實驗是確定細(xì)菌對何種抗生素敏感的重要步驟，不經(jīng)過這一步就用藥， 如同打一場無準(zhǔn)備之仗，其效果可想而知。傳統(tǒng)的辨別病原菌是否耐藥的方法是制片擴(kuò)散法，該方法需要對臨床樣本進(jìn)行培養(yǎng)，檢測耗時長。如能在用藥之前準(zhǔn)確無誤的測得所感染菌株的耐藥情況，則將對臨床用藥起到非常好的指導(dǎo)作用。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的引物組合物。本發(fā)明的另一個目的是提供上述引物組合物在制備用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的試劑盒。本發(fā)明的又一個目的是提供一種用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的方法。
本發(fā)明的目的是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的引物組合物，該引物組合物包括用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的引物以及內(nèi)參引物，其中用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :1，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO 2 ；內(nèi)參引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :7，下游引物核苷酸序列為SEQ ID N0:8o本發(fā)明還提供了該引物組合物在制備用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途。優(yōu)選地，上述引物組合物還包括用于檢測金黃色葡萄球菌的引物和/或用于檢測表皮葡萄球菌的引物，其中用于檢測金黃色葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :3，下游引物核苷酸序列為SEQ IDNO :4;用于檢測表皮葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列為SEQ IDNO :5，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :6。本發(fā)明還提供了該引物組合物在制備用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途，其中葡萄球菌為金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的試劑盒，該試劑盒包括上述引物組合物。該試劑盒還可以包括細(xì)胞裂解液、核酸結(jié)合液、核酸漂洗液、核酸洗脫液和PCR反應(yīng)液。又一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的方法，該方法包括以下步驟1)提取樣本DNA ;2)使用上述引物組合物或試劑盒對步驟1)得到的DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；3)檢測步驟2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。其中，步驟1)中的樣本優(yōu)選為人的血液、體液或組織；步驟3)中的檢測方法優(yōu)選為微流體芯片檢測法。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，通過檢測兩種葡萄球菌特異性基因和耐藥菌特異性基因，來鑒別患者所感染的菌種類別，具體包括以下步驟1)提取人臨床樣本的DNA ；2)將四種基因，即人的DNA保守序列，金黃色葡萄球特有基因femA，表皮葡萄球菌特有基因SE，耐甲氧西林葡萄球菌特有基因mecA的特異性引物混和，對被測樣本的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，被擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段大小不同。3)擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流體芯片進(jìn)行檢測；4)通過各檢測峰的位置確定檢測到的片段的大小，從而判斷檢測到的基因，鑒別臨床樣本感染的菌種類別。5)結(jié)果判斷a)未出現(xiàn)任何特異性峰，說明臨床樣本的DNA沒有提取出來，檢測無效；b)只出現(xiàn)DNA內(nèi)參特異性峰，說明沒有葡萄球菌感染；c)出現(xiàn)DNA內(nèi)參和femA特異性峰，說明有甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌感染；d)出現(xiàn)DNA內(nèi)參和SE特異性峰，說明有甲氧西林敏感表皮葡萄球菌感染；e)出現(xiàn)DNA內(nèi)參、femA和mecA特異性峰，說明有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染；f)出現(xiàn)DNA內(nèi)參、SE和femA特異性峰，說明有甲氧西林敏感表皮葡萄球菌和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌感染；g)出現(xiàn)DNA內(nèi)參、SE和mecA特異性峰，說明有耐甲氧西林表皮葡萄球菌感染；h)出現(xiàn)DNA內(nèi)參、SE、mecA和femA特異性峰，說明有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌混合感染。本發(fā)明提供了一種可快速便捷檢測金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，耐甲氧西林表皮葡萄球菌的方法，該方法簡單，成本較低，適宜推廣應(yīng)用。具體地，本發(fā)明具有以下有益效果首先，本發(fā)明提供了一種用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的引物組合物，其中包括人DNA保守序列和耐甲氧西林葡萄球菌基因mecA，以及任選的金黃色葡萄球特有基因 femA、表皮葡萄球菌特有基因SE的特異性引物。實驗表明，通過PCR反應(yīng)，這些引物較之其它根據(jù)其各自的保守序列設(shè)計的引物能夠更快速、有效地識別出相應(yīng)的病毒。上述人DNA 保守序列作為內(nèi)參，選用的是人β球蛋白(β-globin)基因。由于人體細(xì)胞中都含有此基因，引入該基因可以確定模板的提取質(zhì)量，避免擴(kuò)增結(jié)果的假陰性。其次，本發(fā)明提供了用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的試劑盒，其中包括人DNA保守序列和耐甲氧西林葡萄球菌基因mecA，以及任選的金黃色葡萄球特有基因femA、表皮葡萄球菌特有基因SE的特異性引物。該試劑盒不僅能高效、特異性的擴(kuò)增出目的DNA，還能確定模板的提取質(zhì)量，避免擴(kuò)增結(jié)果的假陰性。本發(fā)明提供了一種可快速、便捷檢測葡萄球菌種類和/或葡萄球菌耐藥性的方法，可以在基因水平上進(jìn)行迅速的判斷，具有較高的靈敏度和特異性。該方法可直接對患者的臨床樣本(例如血液、體液等)進(jìn)行檢測，不需要對樣本進(jìn)行培養(yǎng)后再對菌株進(jìn)行檢測， 節(jié)約了時間。同時，微流體芯片檢測法比傳統(tǒng)的DNA電泳檢測法簡單、快捷、直觀。為臨床用藥提供了準(zhǔn)確、及時的指導(dǎo)。因此，本發(fā)明所提供的方法技術(shù)成熟，檢測結(jié)果穩(wěn)定，比傳統(tǒng)的濾紙片法、凝膠法等更快捷、靈敏、準(zhǔn)確。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中圖1為臨床樣本出現(xiàn)的各種感染耐藥菌情況的電泳結(jié)果圖；圖2A 圖2G為臨床樣本出現(xiàn)的各種感染耐藥菌情況的微流體芯片結(jié)果圖；圖3A 圖3D為感染的不同耐藥菌的基因擴(kuò)增片段的測序比對結(jié)果；圖4A 圖4D為本發(fā)明所提供的引物組合物靈敏度的微流體芯片檢測結(jié)果圖；圖5A 圖5B為本發(fā)明所提供的合引物組合物特異性的微流體芯片檢測結(jié)果圖；圖6A 圖6C為本發(fā)明所提供的引物組合物重復(fù)性的微流體芯片檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下實施例中所使用的技術(shù)，除非特別說明，均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)；所使用的儀器設(shè)備、試劑等，除非是本說明書特別說明，均為本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人員可以通過公共途徑獲得的。實施例1 臨床樣本的制備本實施例制備本發(fā)明檢測方法所使用的人體血液樣本，詳述如下。1、提取試劑A液細(xì)胞裂解液，15ml/瓶，每次用200 μ 1。_成份終濃度
權(quán)利要求
1.一種用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的引物組合物，該引物組合物包括用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的引物以及內(nèi)參引物，其中用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :1，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :2 ；內(nèi)參引物的上游引物核苷酸序列為SEQ IDNO :7，下游引物核苷酸序列為SEQ ID N0:8o
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合物在制備用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合物，其特征在于，所述引物組合物還包括用于檢測金黃色葡萄球菌的引物和/或用于檢測表皮葡萄球菌的引物，其中用于檢測金黃色葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列為SEQ IDNO :3，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :4 ；用于檢測表皮葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :5，下游引物核苷酸序列為 SEQ ID NO :6ο
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物組合物在制備用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途，其中葡萄球菌為金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。
5.一種用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的試劑盒，該試劑盒包括根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的引物組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括細(xì)胞裂解液、核酸結(jié)合液、核酸漂洗液、核酸洗脫液和PCR反應(yīng)液。
7.—種檢測耐甲氧西林葡萄球菌的方法，該方法包括以下步驟1)提取樣本DNA；2)使用根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的引物組合物，或根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒對步驟1)得到的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)檢測步驟2)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中的樣本為人的血液、體液或組織。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中的檢測方法為微流體芯片檢測法。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的引物組合物，其中包括的用于檢測耐甲氧西林葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO1，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO2；內(nèi)參引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO7，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO8。其中還可以包括的用于檢測金黃色葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO3，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO4；用于檢測表皮葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO5，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO6。本發(fā)明還提供了上述引物組合物的試劑盒。采用所述引物組合物及試劑盒檢測耐甲氧西林葡萄球菌的方法，可以在基因水平上進(jìn)行迅速判斷，具有較好的靈敏度和特異性，具有節(jié)約時間、技術(shù)成熟及檢測結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/14GK102168130SQ20101012219
公開日2011年8月31日 申請日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者倪劍鋒, 楊文輝, 趙珊珊 申請人:寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司