一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的原核表達(dá)及純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的原核表達(dá)及純化方法，包括以下步驟：(1)引物合成；(2)目的基因的擴(kuò)增；(3)重組質(zhì)粒的構(gòu)建；(4)重組載體在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)；(5)重組蛋白的純化。本發(fā)明利用PCR技術(shù)從MRSA基因組中擴(kuò)增出編碼PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的DNA片段，將此目的基因克隆至pGEX-6p-1原核表達(dá)載體上，并利用親和層析進(jìn)一步純化出較高純度的蛋白，為研發(fā)針對該蛋白的檢測方法奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】-種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的原核表 達(dá)及純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a轉(zhuǎn)肽 酶區(qū)的原核表達(dá)及純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)是引起院內(nèi)外感染的重要病原菌，也是細(xì)菌耐藥性的主要監(jiān)測對象，嚴(yán)重威脅著人類 健康。MRSA不僅對包括甲氧西林在內(nèi)的絕大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，而且對氨基糖 苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、磺胺類等多種抗生素也具有不同程度的耐藥性。目前研究表 明，MRSA的主要耐藥機(jī)制與其含有的一種特殊的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a有關(guān)，PBP2a由耐藥 基因 mecA編碼，含有668個氨基酸，相對分子質(zhì)量約78kD，錨定于細(xì)胞膜表面，與β -內(nèi)酰 胺類抗生素有較低的親和力。該蛋白由N-末端跨膜區(qū)、非青霉素結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)肽酶區(qū)三部分 組成，其中轉(zhuǎn)肽酶區(qū)是其行使其功能的主要區(qū)域。PBP2a蛋白是所有MRSA共有特征蛋白，可 作為疫苗開發(fā)的靶抗原。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的原核表達(dá)及純化方法，該方法利用PCR技術(shù)從MRSA基因組中擴(kuò)增出編 碼PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的DNA片段，將此目的基因克隆至pGEX-6p-l原核表達(dá)載體上，并利用親 和層析進(jìn)一步純化出較高純度的蛋白，為研發(fā)針對該蛋白的檢測方法奠定了基礎(chǔ)。
[0004] 其具體技術(shù)方案為：
[0005] -種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的原核表達(dá)及純化方法，其特征 在于，包括以下步驟：
[0006] (1)引物合成
[0007] 根據(jù)Genbank中mecA基因序列，利用Primer5. 0軟件設(shè)計針對轉(zhuǎn)肽酶區(qū)基因的 引物，上游引物：5, -CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAG-3'，下游引物：5' -CCCGAATTCA TTCATCTATATCGTATTTTTTATTA-3 '，在上游引物5 '端引入BamH I酶切位點(diǎn)，在下游引物5 ' 端引入EcoR I酶切位點(diǎn)，由南京金斯瑞生物科技有限公司負(fù)責(zé)合成；預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為 1026bp ；
[0008] (2)目的基因的擴(kuò)增
[0009] 將臨床分離的MRSA菌株接種于新鮮LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，取3mL菌液12000g 離心5min，棄上清，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取MRSA基因組DNA ;以MRSA基因組為模板， 進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，50°C退火30°C，72°C延伸 lmin，進(jìn)行30個循環(huán)；72°C延伸8min ;取反應(yīng)產(chǎn)物5μ L，在I. 0%瓊脂糖凝膠中，IOOV電壓 下電泳40min，用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果；
[0010] (3)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0011] 上述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板（含41^、1?了631&1)，371：培養(yǎng)12?1611; 挑取白色克隆，接種到含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及 雙酶切驗(yàn)證正確后，送南京金斯瑞生物科技有限公司測序；
[0012] 將測序正確的pMD19-T_mecAf質(zhì)粒和pGEX_6p_l空質(zhì)粒分別用BamH I、EcoR I進(jìn) 行雙酶切，膠回收目的基因片段和空質(zhì)粒片段，連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布 氨芐平板；挑取若干克隆，用菌落PCR方法鑒定；過夜培養(yǎng)鑒定為陽性的克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn) 行雙酶切鑒定及測序驗(yàn)證；
[0013] (4)重組載體在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
[0014] 將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E. coli BL21，挑取單個菌落，接種至含有氨 芐的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜；經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后，以1/100接種量接種于新鮮的含 有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中，，37°C震蕩培養(yǎng)至OD為0. 6,加 IPTG至終濃度為0. lmmol/L， 誘導(dǎo)3?4h，取ImL培養(yǎng)液離心收集細(xì)菌，重懸于50 μ L PBS緩沖液中，加入等體積2 X上 樣緩沖液l〇〇°C煮沸5min，取10 μ L樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析；
[0015] (5)重組蛋白的純化
[0016] 將過夜培養(yǎng)的菌液以1/100接種量接種于500mL新鮮的含有氨芐青霉素的LB培 養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)至OD為0. 6,加 IPTG至終濃度為0. lmmol/L，28°C誘導(dǎo)8h，將菌液于 6000r/min離心30min后收集菌體，用20mL PBS重懸菌體，于冰上超聲破碎細(xì)胞（參數(shù)：時 間IOmin,功率30 %，超聲開5sec，超聲間歇5sec);結(jié)束后與高速冷凍離心機(jī)12000rpm, 4°C離心30min，小心吸出上清；取裂解上清IOmL,用0. 45um的濾膜過濾，與ImL ProteinIso GST Resin填料混合，于混勻器上翻轉(zhuǎn)過夜，使蛋白與填料充分結(jié)合；次日將混合物填裝重 力層析柱，用30倍床體積的PBS洗脫雜蛋白，用1倍柱體積的洗脫緩沖液（50mM Tris-HCl， IOmM還原性谷胱甘肽，pH 8. 0)洗脫目的蛋白3次，分別收集洗脫液；純化前和純化后的產(chǎn) 物進(jìn)行SDS-PAGE，分析純化效果。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得了編碼 PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的基因片段，并克隆進(jìn)pGEX-6p-l表達(dá)載體中，經(jīng)條件優(yōu)化確定在0D600為 0. 6時加入終濃度為0. lmmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，28°C震蕩培養(yǎng)8h時PBP2a重組蛋白表達(dá) 量及蛋白可溶性較好。利用蛋白親和層析柱純化重組蛋白，并最終獲得了較高純度的重組 蛋白。Western blot結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白在E. coli中獲得了高效表達(dá)。PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)蛋 白的高效表達(dá)和純化，為進(jìn)一步制備單克隆抗體，建立MRSA快速檢測方法奠定了較好的基 礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為目的基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果，M :DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker ;1 :mecA基因片段PCR擴(kuò)增結(jié) 果；
[0019] 圖2為重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果，M :DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker ;1 :BamH I、EcoR I雙酶切 重組質(zhì)粒；
[0020] 圖3為重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化，M :蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker ;1 :經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的空質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化菌；2 :未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌；3 :經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌；4 :純化的重組蛋 白；
[0021] 圖4為重組表達(dá)蛋白的Western-Blot檢測結(jié)果，1 :蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)Marker ;2 :經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的空質(zhì)粒；3 :純化的重組蛋白。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0023] 1材料與方法
[0024] 1.1質(zhì)粒、菌株和試劑
[0025] MRSA菌株純化自西京醫(yī)院敗血病病人血液；pGEX-6p_l表達(dá)載體由西北工業(yè)大 學(xué)生命學(xué)院微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室保存；PMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I、DNA Ligation Kit Ver. 2. 1 購自 TaKaRa 公司；T4DNA Ligase 購自 Promega 公司；克隆菌株 E. coli DH5a、表達(dá)菌株E. coli BL21、DNA Marker 1Kb、蛋白親和層析柱購自全式金生物 科技公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取純化試劑盒、膠回收純化試劑盒購自天根生化 科技公司；
[0026] 1. 2實(shí)驗(yàn)方法
[0027] L 2.1引物合成
[0028] 根據(jù)Genbank中mecA基因序列，利用Primer5. 0軟件設(shè)計針對轉(zhuǎn)肽酶區(qū)基因的引 物，上游引物：5, -CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAG-3'，下游引物：5' -CCCGAATTCATTC ATCTATATCGTATTTTTTATTA-3 '，在上游引物5 '端引入BamH I酶切位點(diǎn)，在下游引物5 '端 引入EcoR I酶切位點(diǎn)，由南京金斯瑞生物科技有限公司負(fù)責(zé)合成。預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為 1026bp〇
[0029] 1.2. 2目的基因的擴(kuò)增
[0030] 將臨床分離的MRSA菌株接種于新鮮LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，取3mL菌液12000g離 心5min，棄上清，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取MRSA基因組DNA。以MRSA基因組為模板， 進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，50°C退火30°C，72°C延伸 lmin，進(jìn)行30個循環(huán)；72°C延伸8min。取反應(yīng)產(chǎn)物5 μ L，在1. 0%瓊脂糖凝膠中，IOOV電壓 下電泳40min，用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。
[0031] 1.2. 3重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0032] 上述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板（含41^、1?了631&1)，371：培養(yǎng)12?1611。 挑取白色克隆，接種到含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及 雙酶切驗(yàn)證正確后，送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。
[0033] 將測序正確的pMD19-T_mecAf質(zhì)粒和pGEX_6p_l空質(zhì)粒分別用BamH I、EcoR I進(jìn) 行雙酶切，膠回收目的基因片段和空質(zhì)粒片段，連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布 氨芐平板。挑取若干克隆，用菌落PCR方法鑒定。過夜培養(yǎng)鑒定為陽性的克隆，提取質(zhì)粒， 進(jìn)行雙酶切鑒定及測序驗(yàn)證。
[0034] 1.2. 4重組載體在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
[0035] 將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E. coli BL21，挑取單個菌落，接種至含有氨 芐的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜。經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后，以1/100接種量接種于新鮮的 含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中，，37°C震蕩培養(yǎng)至OD為0. 6,加 IPTG至終濃度為0. lmmol/ L，誘導(dǎo)3?4h，取ImL培養(yǎng)液離心收集細(xì)菌，重懸于50 μ L PBS緩沖液中，加入等體積2 X 上樣緩沖液l〇〇°C煮沸5min，取10 μ L樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0036] 1. 2. 5重組蛋白的純化
[0037] 將過夜培養(yǎng)的菌液以1/100接種量接種于500mL新鮮的含有氨芐青霉素的LB培 養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)至OD為0. 6,加 IPTG至終濃度為0. lmmol/L，28°C誘導(dǎo)8h，將菌液于 6000r/min離心30min后收集菌體，用20mL PBS重懸菌體，于冰上超聲破碎細(xì)胞（參數(shù)：時 間IOmin,功率30 %，超聲開5sec，超聲間歇5sec)。結(jié)束后與高速冷凍離心機(jī)12000rpm，4°C 離心30min，小心吸出上清。取裂解上清IOmL,用0. 45um的濾膜過濾,與ImL ProteinIso GST Resin填料混合，于混勻器上翻轉(zhuǎn)過夜，使蛋白與填料充分結(jié)合。次日將混合物填裝重 力層析柱，用30倍床體積的PBS洗脫雜蛋白，用1倍柱體積的洗脫緩沖液（50mM Tris-HCl， IOmM還原性谷胱甘肽，pH 8.0)洗脫目的蛋白3次，分別收集洗脫液。純化前和純化后的產(chǎn) 物進(jìn)行SDS-PAGE，分析純化效果。
[0038] 1. 2. 6 重組蛋白的 Western Blotting 檢測
[0039] 將重組蛋白在12%分離膠，5%濃縮膠中進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移印記 到 PVDF 膜上后，TBST(NaCL 8g/L，KCL 0.2g/L，Tris Base 3g/L，Tween200.05%，pH7.4)配 置的5%脫脂牛奶封閉lh，將膜與I : 2000稀釋的鼠抗His單克隆抗體共同4°C孵育過夜， TBST洗膜3次，每次5min。將膜與1 : 2000稀釋的羊抗鼠二抗IgG-HRP共同室溫孵育lh， TBST洗膜3次，每次5min。加入ECL化學(xué)發(fā)光液，于暗室中用X光片曝光數(shù)秒至數(shù)分鐘，顯 影出理想條帶，定影水洗后分析結(jié)果。
[0040] 2 結(jié)果
[0041] 2. 1目的基因的PCR擴(kuò)增
[0042] 以MRSA基因組為模板擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳可見IOOObp左右 有清晰的條帶（圖1)，與預(yù)期的MRSA青霉素結(jié)合蛋白2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)編碼基因大小相符。
[0043] 2. 2重組表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切鑒定
[0044] 重組質(zhì)粒pGEX-6p-l-mecAf經(jīng)BamH I、EcoR I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在預(yù)期 位置出現(xiàn)清晰條帶（圖2)，且序列測定結(jié)果與預(yù)期完全一致，表明已經(jīng)成功構(gòu)建重組表達(dá) 載體 pGEX-6p-l_mecAf。
[0045] 2. 3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
[0046] 在重組載體中目的基因與GST-tag基因融合表達(dá)，融合標(biāo)簽的分子量約為26kD， 目的蛋白約為37kD，所以表達(dá)出的重組蛋白分子量約為63kD。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，獲得的表達(dá) 蛋白大小與所預(yù)期的一致（圖3)。利用親和層析法純化后，該位置可見單一清晰條帶，基本 無雜蛋白條帶。
[0047] 2· 4重組蛋白的Westen Blot檢測
[0048] Western blotting顯示pGEX-6p-l_mecAf的純化樣品在相對分子質(zhì)量63kD處出 現(xiàn)了清晰的顯色條帶（圖4)，證實(shí)目標(biāo)蛋白在E. coli中成功獲得大量表達(dá)。
[0049] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟 悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡 單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的原核表達(dá)及純化方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 引物合成 根據(jù)Genbank中mecA基因序列，利用Primer5. 0軟件設(shè)計針對轉(zhuǎn)肽酶區(qū)基因的引物， 上游引物：5' -CGGGATCCACTAITGATGCTAAAGITCAAAAG-3'，下游引物：5' -CCCGAAITCAITCA TCTATATCGTATTTTTTATTA-3 '，在上游引物5 '端引入BamH I酶切位點(diǎn)，在下游引物5 '端 引入EcoR I酶切位點(diǎn)，由南京金斯瑞生物科技有限公司負(fù)責(zé)合成；預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為 1026bp ； (2) 目的基因的擴(kuò)增 將臨床分離的MRSA菌株接種于新鮮LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，取3mL菌液12000g離心 5min，棄上清，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取MRSA基因組DNA ;以MRSA基因組為模板，進(jìn)行 PCR反應(yīng)；PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，50°C退火30°C，72°C延伸lmin， 進(jìn)行30個循環(huán)；72°C延伸8min ;取反應(yīng)產(chǎn)物5 ii L，在1. 0%瓊脂糖凝膠中，100V電壓下電泳 40min，用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果； (3) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 上述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板（含41^、1?了6、乂1&1)，371：培養(yǎng)12?1611;挑取 白色克隆，接種到含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及雙酶 切驗(yàn)證正確后，送南京金斯瑞生物科技有限公司測序； 將測序正確的pMD19-T-mecAf質(zhì)粒和pGEX-6p-l空質(zhì)粒分別用BamH I、EcoR I進(jìn)行雙 酶切，膠回收目的基因片段和空質(zhì)粒片段，連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐 平板；挑取若干克隆，用菌落PCR方法鑒定；過夜培養(yǎng)鑒定為陽性的克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙 酶切鑒定及測序驗(yàn)證； (4) 重組載體在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E. coli BL21，挑取單個菌落，接種至含有氨芐的 LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜；經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后，以1/100接種量接種于新鮮的含有氨 芐抗生素的LB培養(yǎng)基中，，37°C震蕩培養(yǎng)至0D為0. 6,加IPTG至終濃度為0. lmmol/L，誘導(dǎo) 3?4h，取lmL培養(yǎng)液離心收集細(xì)菌，重懸于50 y L PBS緩沖液中，加入等體積2 X上樣緩 沖液100°C煮沸5min，取10 y L樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析； (5) 重組蛋白的純化 將過夜培養(yǎng)的菌液以1/100接種量接種于500mL新鮮的含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng) 基中，37°C震蕩培養(yǎng)至0D為0. 6,加IPTG至終濃度為0. lmmol/L，28°C誘導(dǎo)8h，將菌液于 6000r/min離心30min后收集菌體，用20mL PBS重懸菌體，于冰上超聲破碎細(xì)胞（參數(shù)：時 間lOmin，功率30 %，超聲開5sec，超聲間歇5sec);結(jié)束后與高速冷凍離心機(jī)12000rpm, 4°C離心30min，小心吸出上清；取裂解上清10mL，用0. 45um的濾膜過濾，與lmL Proteinlso GST Resin填料混合，于混勻器上翻轉(zhuǎn)過夜，使蛋白與填料充分結(jié)合；次日將混合物填裝重 力層析柱，用30倍床體積的PBS洗脫雜蛋白，用1倍柱體積的洗脫緩沖液（50mM Tris-HCl， 10mM還原性谷胱甘肽，pH 8. 0)洗脫目的蛋白3次，分別收集洗脫液；純化前和純化后的產(chǎn) 物進(jìn)行SDS-PAGE，分析純化效果。
【文檔編號】C12N15/70GK104404010SQ201410603918
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】楊慧, 李冀, 黃慶生, 師俊玲, 唐蕊華, 李晶, 車速, 劉亞雄, 葉琳潔, 邵燕 申請人:西北工業(yè)大學(xué)