專利名稱：：抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因mecA的反義核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)耐藥基因wed的反義核酸序列及其制備含有該反義核酸序列的藥物及其用途。
背景技術(shù)：
：目前細(xì)菌耐藥問題在全球范圍內(nèi)已經(jīng)愈演愈烈，許多曾經(jīng)可以治愈的細(xì)菌感染性疾病正在成為難以治愈的疾病。MRSA是臨床中最常見、最重要的致病菌，自1961年首次發(fā)現(xiàn)MRSA以來，特別是80年代后，MRSA感染率在大部分地區(qū)均呈明顯上升趨勢，如在美國MRSA的感染率從1974年的2%增至2003年的接近60%，30年來幾乎增加了30倍；意大利從1981年的6%上升到1996的26%。隨著MRSA感染率的不斷提升，其致死率也迅速上升，英國統(tǒng)計(jì)資料顯示，1993年至2002年間MRSA致死率提高了15倍，一旦全身感染其致死率高達(dá)50%以上。MRSA感染己被列為世界三大最難解決感染性疾患之首，2007年《美國醫(yī)學(xué)會雜志》刊登的一份調(diào)查報(bào)告顯示，被稱為"超級病菌"的MRSA正在美國蔓延，每年預(yù)計(jì)有超過9萬人感染該細(xì)菌，其中有近2萬人死亡。專家警告，這一病菌的年致死人數(shù)可能超過了艾滋病。近年來MRSA感染的流行病學(xué)發(fā)生了明顯變化，MRSA的傳播已經(jīng)不止局限于醫(yī)院內(nèi)，也能發(fā)生在監(jiān)獄、體育館等醫(yī)院以外的地方。社區(qū)獲得性MRSA(CA-MRSA)檢出率日益增多，重要的是CA-MRSA能夠在健康人群中引起嚴(yán)重的甚至致命的感染。CA-MRSA的流行，已經(jīng)成為一種嚴(yán)重的公共健康問題，并引起了醫(yī)學(xué)界的高度重視。MRSA具有多藥耐藥性，對所有(3-內(nèi)酰胺類抗生素和其他多種抗菌藥物耐藥，僅對萬古霉素等糖肽類抗生素敏感，很多臨床上有效的抗生素失效，因此大大限制了醫(yī)生們的用藥。但1996年曰本報(bào)道了第一例對萬古霉素敏感性下降的MRSA(MIC=8嗎/ml)，當(dāng)時(shí)就有專家預(yù)言VRSA的出現(xiàn)只是一個(gè)時(shí)間上的問題，不出所料2002年6月美國公布了第一例VRSA(萬古霉素MIC二128pg/ml)。盡管現(xiàn)在VRSA的檢出率仍不高，但它的出現(xiàn)必將為MRSA的治療帶來更大的困難，應(yīng)受到高度重B1，以防有朝一日使MRSA的治療面臨無藥可用的境地。因此，尋找有效對抗MRSA耐藥性的藥物作用新耙點(diǎn)及藥物成為研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制包括很多種，如生成(3-內(nèi)酰胺酶導(dǎo)致P-內(nèi)酰胺類抗生素水解失活、生成新的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a等，但其中PBP2a的生成是其產(chǎn)生耐藥性最主要的原因。通常青霉素、頭孢菌素等p-內(nèi)酰胺類抗生素通過抑制位于細(xì)菌細(xì)胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白(PBP)，發(fā)揮殺滅細(xì)菌的作用。MSSA有5種PBPs，分別為PBP1(87KDa)，PBP2(80Kda)，PBP3(75Kda)，PBP3'(70Kda)及PBP4(41Kda)，而MRSA比MSSA多產(chǎn)生了一種78KDa的PBP2a，PBP2a的功能相當(dāng)于MSSA全部主要PBPs的功能，并且與p-內(nèi)酰胺類抗生素親和力極低，在此類抗生素存在的情況下依然能發(fā)揮其轉(zhuǎn)肽酶活性，完成細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，維持金葡菌的生長。PBP2a是由結(jié)構(gòu)基因wecj編碼生成的。以基因?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物中，反義核酸藥物最具開發(fā)前景，因?yàn)榕c傳統(tǒng)藥物相比反義核酸藥物具有高特異性、高選擇性的特點(diǎn)。反義寡聚核苷酸可干擾遺傳過程的多個(gè)階段①抑制轉(zhuǎn)錄，反義寡聚核苷酸同雙鏈靶DNA依據(jù)堿基配對原則，形成T-A-T、C-G-C三聯(lián)體(Triplex)。反義寡聚核苷酸結(jié)合于控制基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄子、增強(qiáng)子和啟動子區(qū)域，通過定點(diǎn)切割或位阻效應(yīng)阻止基因的轉(zhuǎn)錄；②^P制轉(zhuǎn)錄后加工，反義寡聚核苷酸可通過空間阻遏作用影響mRNA前體在核內(nèi)加工過程，包括加帽、切除內(nèi)含子、剪接、加尾、堿基修飾等，也阻止了mRNA向胞漿的轉(zhuǎn)運(yùn)；③抑制翻譯，與mRNA翻譯起始部位和核搪體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生特異結(jié)合，形成RNA/DNA雙鏈，由于空間位阻效應(yīng)而阻止核糖體與起始因子結(jié)合或者激活核糖核酸酶RNaseH，RNaseH能特異性切割并水解RNA-DNA異源雙鏈分子中的mRNA而使其失活，mRNA被水解后，其翻譯不能起動。1998年，全球第一個(gè)反義藥物Fomivirsen通過了FDA驗(yàn)證，成為反義核酸發(fā)展史上的一個(gè)里程碑，它用來治療艾滋病患者巨細(xì)胞病毒感染引起的視網(wǎng)膜炎。近年來己有數(shù)十種反義藥物進(jìn)入了I、1丄、III期臨床試驗(yàn)階段，用于腫瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病及感染性疾病的治療。并非mRNA上所有的位點(diǎn)都可以作為反義核酸的作用靶點(diǎn)，因?yàn)镽NA在體內(nèi)不是以單鏈形式存在，而是具有一定的二級結(jié)構(gòu)，因此RNA的二級結(jié)構(gòu)、RNA結(jié)合蛋白或雜交的RNA都會影響反義核酸的作用。為了避免二級結(jié)構(gòu)對反義核酸的影響，我們需要預(yù)測RNA的二級結(jié)構(gòu)，避免內(nèi)部穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和空間位置相距較遠(yuǎn)的堿基，挑選一些不穩(wěn)定的部位，如發(fā)夾、內(nèi)部環(huán)、膨脹環(huán)、多分支環(huán)等。目前反義核酸的設(shè)計(jì)仍沒有國際統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，通常人們利用一些計(jì)算機(jī)軟件分析靶基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)。RNAstructure軟件就是其中應(yīng)用較多的一種，它可按照自由能最低原理，理論上預(yù)測目的基因RNA的二級結(jié)構(gòu)，計(jì)算反義寡核苷酸與各靶點(diǎn)結(jié)合時(shí)的能量變化。反義藥物的設(shè)計(jì)是否合理，不僅取決于序列自身的自由能，而且取決于靶位的自由能，兩者之間的自由能。因而根據(jù)反義核酸與靶序列結(jié)合的凈能量(OverallAG)、反義核酸與直鏈靶序列結(jié)合所需要的能量(DuplexAG或Binding△G)、反義核酸-靶序列結(jié)合后堿基從靶序列斷裂需要的能量(BreaktargAG)、反義核酸內(nèi)結(jié)合所需要的能量(oligo-selfAG)、反義核酸間結(jié)合所需要的能量(oligo-oligoAG)和核酸-靶序列解鏈的溫度(Tm)等項(xiàng)參數(shù)，把反義靶點(diǎn)選在二級結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定區(qū)域，從而使反義核酸與靶位點(diǎn)牢固結(jié)合。參考MatveevaOV.和CairnsMJ.等人的文獻(xiàn)，確定以上參數(shù)最佳范圍為OverallAG<—10kcal/mol,Duplex△G<—25kcal/mol，oligo-selfAG》一1.1kcal/mol,oligo-oligo厶G》一8kcal/mol，Tm》50。C。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義核酸，該序列為一段人工合成的核苷酸序列，它與MRSA耐藥基因的特定位點(diǎn)的序列互補(bǔ)。因此，將一定劑量本發(fā)明所述的反義硫代寡聚脫氧核苷酸轉(zhuǎn)遞至MRSA菌體內(nèi)，該類反義核酸能夠與靶基因的特定位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制耐藥基因的表達(dá)，使MRSA恢復(fù)對p-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，從而達(dá)到有效逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性、恢復(fù)(3-內(nèi)酰胺類抗生素有效殺滅MRSA的目的。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，設(shè)計(jì)一種抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義核酸PS-ODNs，其特征在于可特異性與MRSA耐藥基因mecA的不同區(qū)域結(jié)合，阻斷這些耐藥基因的表達(dá)，其反義核酸的堿基序列如下反義核酸篩選出的作用靶位點(diǎn)最佳核酸序列(5'—3')PS-ODNsOlPS-ODNs02PS-ODNs03PS-ODNs04PS-ODNs05PS-ODNs06PS-ODNs07基因的-11~6位基因wed的42~59位基因raed的161178位基因me"的307324位基因mec4的352369位基因wed的487504位基因wed的582599位TTTCATCAATATCCTCCTATACCAAACCCGACAAC丁CTTCACCATTATCGCTTTAATGTTACCGTAGTTTGTCCACATACCATCTTCTTTATGTGTTCCTGTATTGGCTTGTTG丁TGATATAGTCTPS-ODNs08基因的796~813位GCCTTTATATTCTTTTTGPS-ODNs09基因靴c力的833~850位CGAGTCCCTTTTTACCAAPS-ODNslO基因mecvi的950967位CTTTGCCATCTTTTTTCTPS-ODNsIl基因wecj的1124--1141位TATATTCTTCGTTACTCAPS-ODNsl2基因附ed的1144--1161位TTTATCTTCGGTTAATTTPS-ODNsl3基因鵬CJ的1151--1168位GTTCTTTTTTATCTTCGGPS-ODNsl4基因wed的1185~-1202位GGTGAAGT丁GTAATCTGGPS-ODNsl5基因的1252--1269位TGTTTTATCGTCTAATGTPS-ODNsl6基因mec^的1283--1300位TTTGCCAACCTTTACCATPS-ODNsl7基因的1337--1354位TACCATTTACCACTTCATPS-ODNs18基因靴c」的1458--1475位ATATCTTCACCAACACCTPS-ODNs19基因鵬c」的1652~掘9位CTTTGTTTTTCGTGTCTTPS-ODNs20基因wec」的1810--1827位TTCTCCTTG丁TTCATTTT所述的硫代寡聚脫氧核苷酸為18個(gè)堿基，經(jīng)全硫代修飾。所述的PS-ODNs01~PS-ODNs20是靶向基因的反義核酸。所述的反義核酸用于抑制MRSA的耐藥基因表達(dá)、使MRSA恢復(fù)對P-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，用于抗MRSA感染的治療。所述的反義核酸序列用于制備抗MRSA耐藥性藥物的用途。本發(fā)明的特點(diǎn)是以MRSA耐藥基因me"的全序列為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)的一系列的反義核酸序列，可特異性的與基因/^d上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合。硫代寡聚脫氧核苷酸為18個(gè)堿基，經(jīng)全硫代修飾。通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所述的互補(bǔ)于基因me"序列的反義核酸具有抑制MRSA耐藥性的特性，在抗MRSA耐藥性治療方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。圖1是脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09對MRSA生長的影響圖示；圖2是不同濃度的脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09對MRSA生長的影響圖示；圖3是平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖-,圖4是脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09和苯唑西林聯(lián)合用藥對MRSA所致敗血癥小鼠的存活率的影響圖示；圖5是脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09和苯唑西林聯(lián)合用藥對MRSA所致敗血癥小鼠血液菌落數(shù)的影響圖示。具體實(shí)施例方式細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生使得臨床上許多曾經(jīng)有效的抗生素失效，因此本發(fā)明的研究目的是尋找新的逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性的藥物。為此，本發(fā)明根據(jù)MRSA的分子生物學(xué)信息，以MRSA的耐藥基因wed為耙基因，以陰離子脂質(zhì)體為遞藥系統(tǒng)將反義核酸藥物導(dǎo)入耐藥菌體內(nèi)，用功能學(xué)實(shí)驗(yàn)來評估反義核酸能否有效抑制或阻斷me"的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)MRSA的耐藥性；反義藥物(反義硫代寡聚脫氧核苷酸)能否作為逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性的新藥物。本發(fā)明的研究結(jié)果提示，以MRSA耐藥基因wed為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的反義核酸可以有效的抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，逆轉(zhuǎn)MRSA的耐藥性，恢復(fù)其對苯唑西林等e-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。上述的反義核酸具有開發(fā)為抗MRSA耐藥性藥物的前景。以下將以實(shí)施例具體描述本發(fā)明。實(shí)施例1抗mRNA的反義硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs)的設(shè)計(jì)在GENBANK中檢索到MRSA耐藥基因的基因組序列(基因編號GI:2791983),該序列全長2007bp,編碼PBP2a，決定MRSA耐藥性的表達(dá)。根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，從DNA序列得到靴d的mRNA。我們用RNAstructure4.2計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)，篩選出一系列反義核酸作用靶位點(diǎn)，根據(jù)這些靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)出相應(yīng)的反義核酸，腦Astructure可按照自由能最低原理，預(yù)測基因的二級結(jié)構(gòu)，計(jì)算PS-ODN與各靶點(diǎn)結(jié)合時(shí)的能量變化，并根據(jù)PS-ODN與耙序列結(jié)合的凈能量(OverallAG),PS-ODN與直鏈靶序列結(jié)合所需要的能量(DuplexAG或BindingAG)，PS-ODN-靶序列結(jié)合后，堿基從靶序列斷裂需要的能量(BreaktargAG)，PS-ODN分子內(nèi)結(jié)合所需要的能量(oligo-selfAG),PS-ODN分子間結(jié)合所需要的能量(oligo-oligoAG)和核酸-靶序列解鏈的溫度(Tm)等項(xiàng)參數(shù)篩選各項(xiàng)指標(biāo)好的PS-QDN。參考Matveeva和MurrayJ.Cairns等文獻(xiàn)，以上參數(shù)最佳范圍為OverallAG<_10kcal/mol,DuplexAG<—25kcal/mol'oJigo-selfAG》一1.1kcal/mo1，oligo-oligoAG》一8kcal/mol,Tm》5(TC。根據(jù)以上參數(shù)篩選獲得20條反義寡聚脫氧核苷酸序列。經(jīng)BLAST軟件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的反義核酸均具有高度特異性，并為增加其穩(wěn)定性進(jìn)行了硫代修飾，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，這種合成技術(shù)及設(shè)備是本行業(yè)公知的。所述的PS-ODNs01PS-ODNs20是靶向me"基因的反義寡聚脫氧核苷酸。所述的反義核酸用于抑制MRSA的耐藥基因表達(dá)、使MRSA恢復(fù)對p-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，用于抗MRSA感染的治療。所述的反義核酸序列用于制備抗MRSA耐藥性藥物的用途。序列見表l。表l設(shè)計(jì)的反義硫代寡聚脫氧核苷酸反義核酸篩選出的作用靶位點(diǎn)最佳核酸序列(5'—3')PS-ODNsOl基因的-ll6位TTTCATCAATATCCTCCTPS-ODNs02基因的42~59位ATACCAAACCCGACAACTPS-ODNs(B基因的161~178位CTTCACCATTATCGCTTTPS-ODNs04基因的307~324位AATGTTACCGTAGTTTGTPS-ODNs05基因的352^369位CCACATACCATCT丁CTT丁PS-ODNs06基因鵬a4的487-504位ATGTGTTCCTGTATTGGCPS-ODNs07基因的582599位TTGTTGTTGATATAGTCTPS-ODNs08基因的796-813位GCCTTTATATTCTTTTTGPS-ODNs09基因鵬o4的833~850位CGAGTCCCTTTTTACCAAPS-ODNs10基因鵬a4的950~967位CTTTGCCATCTTTTTTCTPS-ODNsll基因附CJ的1124~1141位TATATTCTTCGTTACTCAPS-ODNs12基因的1144M161位TTTATCTTCGGTTAATTTPS-ODNs13基因的115卜1168位GTTCTTTTTTATCTTCGGPS-ODNs14基因鵬o4的1185~1202位GGTGAAGTTGTAATCTGGPS-ODNs15基因的1252~1269位TGTTTTATCGTCTAATGTPS-ODNs16基因鵬c4的1283-1300位TTTGCCAACCTTTACCATPS-ODNsl7基因的1337~1354位TACCATTTACCACTTCATPS-ODNsl8基因柳c」的14581475位ATATCTTCACCAACACCTPS-ODNs19基因的1652~1669位CTTTGTTTTTCGTGTCTTPS-ODNs20基因的1S101827位TTCTCCTTGTTTCATTTT實(shí)施例2PCR引物的設(shè)計(jì)與合成依據(jù)GeneBank中報(bào)道的MRSA的wed和/foMJVJ的基因序列，用軟件PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)了wec^和MwiA^的兩對特異性擴(kuò)增引物。引物均經(jīng)BLAST軟件驗(yàn)證具有高度特異性，并由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列見表2。表2設(shè)計(jì)合成的擴(kuò)增引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例3陰離子脂質(zhì)體的制備首先我們PEI與PS-ODN通過靜電相互作用制備成荷正電荷的納米微粒，精密稱適當(dāng)比例的蛋黃卵磷脂(EPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2,-DSPE)，薄膜分散法制備陰離子脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)導(dǎo)PS-ODN進(jìn)入MRSA菌體內(nèi)的遞藥系統(tǒng)。以下實(shí)施例中是申請人選取實(shí)驗(yàn)結(jié)果最好的硫代寡聚脫氧核苷酸PS-ODNs09為例，其他的硫代寡聚脫氧核苷酸同樣按照下述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)中根據(jù)不同的處理方法分為如下9個(gè)組PBS的對照組(Control);包裹PBS的脂質(zhì)體組(L-PBS);包裹錯(cuò)配對照鏈PS-ODN的脂質(zhì)體組(L-M-ODN，錯(cuò)配對照PS-ODN的終濃度為I8nM);游離的PEI組(F-PEI，PEI的終濃度為0.2pM);裸PS-ODNs09組(F-ODN，PS-ODNs09的終濃度為18nM);包裹PS-ODNs09的脂質(zhì)體組(L-ODN，PS-ODNs09的終濃度為分別為0.7、2、6、18(iM)。實(shí)施例5生長曲線的測定將新鮮過夜培養(yǎng)的MRSA轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35°C、210rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，測A63q-0.5~0.6,稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)。然后取適量的細(xì)菌分組進(jìn)行不同的處理，按實(shí)施例4的方法分組，每組中再加入適量的苯唑西林(終濃度為6嗎/ml)。將混好的菌液及藥物的混合液(200^1)加入到96孔板中，37°C、150r/min振蕩培養(yǎng)，分別于l、2、3、4、5、6、7、8h測定吸光度a63。nm，繪制生長曲線，觀察細(xì)菌生長情況。結(jié)果顯示與空白對照組相比，脂質(zhì)體包裹的18pMPS-ODNs09組的MRSA的生長受到明顯的抑制，而空白脂質(zhì)體組、錯(cuò)配鏈對照組、游離PEI組和裸PS-ODNs09組MRSA的生長沒有受到明顯抑制。隨著脂質(zhì)體包裹PS-ODNs09濃度的增大，MRSA生長被抑制的作用越明顯，呈現(xiàn)濃度依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗,d的脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09逆轉(zhuǎn)了MRSA對苯唑西林的耐藥性，苯唑西林抑制了MRSA的生長。(見圖l、圖2)圖1、圖2是給予不同濃度的脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09后，苯唑西林對MRSA生長的影響圖不。圖1是給予脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09后，苯唑西林對MRSA生長的影響圖示，圖中L-ODNs09是脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09治療組(18，control是PBS組，L-PBS是空白脂質(zhì)體組，F(xiàn)-PEI是裸PEI組(0.2jiM)，F(xiàn)-ODNs09是裸PS-ODNs09組(18^iM)，L-mis-ODN是脂質(zhì)體包裹的錯(cuò)配對照鏈組(18nM)。圖2是給予不同濃度的脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09后，苯唑西林對MRSA生長的影響圖示，圖中包括PBS組(control)禾Q0.7、2、6、18piM的脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09治療組共五組。圖1、圖2顯示了給予不同濃度的脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09后，苯唑西林明顯的抑制了MRSA的生長，并具有濃度依賴性。實(shí)施例6平板克隆形成實(shí)驗(yàn)將新鮮過夜培養(yǎng)的MRSA轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35°C、210rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，測A63G=0.5~0.6,稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)。然后取適量的細(xì)菌分組進(jìn)行不同的處理，按實(shí)施例4的方法分組，將混合液孵育，37°C、150r/min，振蕩培養(yǎng)6h。然后將菌液稀釋106倍，吸取50pil稀釋菌液均勻涂布于含苯唑西林(6pg/ml)的M-H瓊脂培養(yǎng)基表面，35'C恒溫孵育24h，肉眼計(jì)數(shù)M-H瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落數(shù)(CFU)。結(jié)果顯示與空白對照組相比，脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09的四個(gè)劑量組(0.7、2、6、18yM)MRSA的菌落數(shù)均減少了一到兩個(gè)數(shù)量級，減少率都高達(dá)95%以上(尸O.Ol)。裸PS-ODNs09組MRSA的菌落數(shù)減少了30%(尸O.Ol)。而空白脂質(zhì)體組、錯(cuò)配鏈對照組和游離PEI組的菌落數(shù)與空白對照組相比無顯著性的減少(戶>0.05)。與裸PS-ODNs09組相比，脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09組的菌落數(shù)明顯減少(PO.Ol)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脂質(zhì)體包裹的抗me"的PS-ODNs09恢復(fù)了MRSA對苯唑西林的敏感性，苯挫西林因此抑制了MRSA菌落的形成。(見圖3).圖3是平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖，圖中C是PBS組，L-PBS是空白脂質(zhì)體組，L-M是脂質(zhì)體包裹的錯(cuò)配對照鏈組(18nM)，F(xiàn)-P是裸PEI組(0.2nM)，F(xiàn)-ODN是裸PS-ODNs09組(18pM)，0.7、2、6、18分別是0.7、2、6、18pM的脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09(L-ODNs09)治療組。***尸<0.01vscontrol,絲^〈0.0lvs裸PS-ODNs09(7±j,n=10)。圖3顯示了給予脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09后，苯唑西林顯著抑制MRSA的生長，MRSA的菌落數(shù)明顯i^少。實(shí)施例7最小抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)的測定稱取適量的抗生素配置成濃度為2mg/ml的藥物原液，原液配置好以后用過濾法除菌，小量分裝備用。10.24ml原液加入9.76mlM-H肉湯培養(yǎng)基中，混合即得1024貼/ml的抗生素。取14個(gè)試管，編號1I4，214號試管內(nèi)加M-H肉湯10ml;吸取1024pg/ml的抗生素分別加入1、2號試管內(nèi)，各10ml，2號經(jīng)混合后吸出10ml,加入3號內(nèi)，依次類推至14號，這樣抗生素的梯度濃度依次為1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.13、0.06、0.03、0.015嗎/ml。試管標(biāo)記后，每組并按從低濃度到高濃度的順序依次加入1ml稀釋好的藥液。搖菌至A63Qnm=0.5~0.6，稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，然后1:300稀釋。稀釋后的菌液應(yīng)在15min內(nèi)接種。然后取適量的細(xì)菌分組進(jìn)行有或無脂質(zhì)體包裹PS-ODNs09(18nM)的處理，取50的菌液與藥物的混合液依次由低濃度到高濃度加到試管中。35匯孵育1216h。同時(shí)設(shè)置M-H肉湯對照管和細(xì)菌生長對照管。結(jié)果判斷在每管中加入IOg/L(1°/。)氯化三苯四氮唑(TTC)10^d。35。C孵育3h后有細(xì)菌生長管呈紅色，不顯紅色的最低藥物濃度為抗生素對檢測菌的MIC值，結(jié)果見表3。表3給予脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09后(3-內(nèi)酰胺類抗生素對<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>苯唑西林對金葡菌的MIC值折點(diǎn)敏感MlC^2ng/ml;耐藥MK^4pg/ml;頭孢噻吩對金葡菌的MIC值折點(diǎn)敏感MlC^8ng/ml;中介MIC=16ng/ml;耐藥MlC^32嗎/ml;頭孢哌酮對金葡菌的MIC值折點(diǎn)敏感MlC^16叫/ml;中介MIC=32ng/mt;耐藥MlC^64ng/ml。結(jié)果顯示給予18pM脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09后，苯唑西林、氟氯西林、頭孢噻吩和頭孢哌酮對MRSA的MIC值均明顯降低，其中MRSA對苯唑西林和頭孢哌酮的敏感性完全恢復(fù)。實(shí)施例8Real-timeRT-PCR法檢測目的基因mec4mRNA的相對表達(dá)變化1、提取細(xì)菌總RNA:(1)冰浴5min后的菌液13000rpm離心2min，棄去上清，收集細(xì)菌沉淀；(2)細(xì)菌沉淀中加入100Hl裂解液，37'C孵育30min,每隔10min振蕩1次，以充分裂解細(xì)菌；(3)加入1mlTrizolreagent,室溫放置5min后加氯仿0.2ml/mlTrizolreagent,蓋緊離心管，用手輕柔混勻離心管，4°C、13000rpm離心30min;(4)吸取水相上清200(al轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，加入異丙醇0.5ml/mlTrizolreagent,蓋緊離心管，用手輕柔混勻，-20。C放置20min,13000rpm、4'C離心20min;(5)棄去上清，加入75%乙醇1ml/mlTrizolreagent,用手劇烈搖蕩使RNA充分溶解，8000rpm、4'C離心10min，棄上清，然后再短暫快速離心，棄去離心液。(6)將離心管置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干乙醇2min，但不要干燥過分，以免降低RNA的溶解度。將RNA溶于DEPC處理過的水中作為RT模板(必要時(shí)可在5560'C孵育助溶)，或于-2(TC凍存。2、RT:用DU800核酸蛋白分析儀測總RNA的濃度及純度。反應(yīng)體系2010XRTMix2^1，2.5mmoldNTP2|il，randomprimer2pl，QuantReverseTranscriptase1pl，模板RNAl(ig，用DEPC處理過的水補(bǔ)足20pl。反應(yīng)條件37°C60min，冰浴后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR或-2CTC保存cDNA。3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR:將對照組的cDNA稀釋，稀釋梯度為5-1、5-2、5-3、5-4、5-5，.將各稀釋梯度的cDNA分別加到目的基因(mecA)和管家基因(16srRNA)反應(yīng)體系中。反應(yīng)體系20pi:SYBRPremixExTaqTM105的引物各1|il，模板cDNA5pl，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20pl。反應(yīng)條件95。C預(yù)變性2min，95。C變性30sec，58。C退火30sec，72'C延伸30sec，讀板，39個(gè)循環(huán)。熔解曲線測定的起始溫度6(TC，目標(biāo)溫度94'C，每臺階升0.4。C，恒溫20sec，測目的基因和管家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。將各處理組的cDNA稀釋5-2后，按照上述的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件測各處理組目的基因和管家基因的熔解曲線及Ct值。每組做三個(gè)復(fù)孔。4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析方法一2-^Q法由于我們采取的是相對定量的方法，所以附e"mRNA的相對表達(dá)量是通過比較Ct值的方法來計(jì)算的。為了保證AACt的有效性，目的基因和管家基因的擴(kuò)增效率必須接近。而評價(jià)二者擴(kuò)增效率相似性的有效方法就是測定隨著模板稀釋梯度而變化的ACt值，對每一個(gè)樣本來說，ACt-Ct(目的基因)一Ct(管家基因)。以cDNA的稀釋梯度的1og5值為橫坐標(biāo)，ACt值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來評價(jià)目的基因和管家基因擴(kuò)增效率的相似性。處理組的目的基因的相對表達(dá)量就可以通過2—A^t的方法計(jì)算，AACt=ACt(處理組)-ACt(對照組)。結(jié)果見下表4。表4脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09對MRSA的耐藥基因mecA表達(dá)的影響分組濃度(一)C,他憑j△△CtControl020.82±0.1316.01±0.094.81±0.0801L匿M-ODN1820.10±0.0815.35±0.074.75±0.09-0.06±0.021.05±0.02L-PBS020.81±0.1715.93±0.064.89士0.10.07±0.030.95±0.02F-PEI0.220.41±0.0915.73±0.104.68±0.05-0.14±0.031.10±0.02F陽ODNs091823.44±0.1218.11±0.125.32±0.100.51±0.030.70±0.01L-ODNs090.724.04±0.1018.36±0.075.68±0.040.87±0.040.55±0.02L-ODNs09222.79±0.0915.93±0.116.86±0.202.04±0.250.24士0.05L-ODNs09622.42±0.1015.15±0.107.27±0.202.46±0.190.18土0.02L-ODNs091826.84±0.3118.22±0.188.62±0.293急0.350急0.02Ct:臨界循環(huán)數(shù)，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)?！鳌鰿t=(Ct,ecA-Ct.16s)treatment-(Ct.meCA-Ct.16s)e。ntrol。Control是PBS組，L-PBS是空白脂質(zhì)體組，L-M-ODN是脂質(zhì)體包裹的錯(cuò)配對照鏈組，F(xiàn)-PEI是裸PEI組，F(xiàn)-ODNs09是裸PS-ODNs09組，L-ODNs09是脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09治療組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MRSA的me"和7dsriA^的Real-timeRT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物分別在114bp及144bp處均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09能明顯抑制耐藥基因meM的表達(dá)，并具有濃度依賴性抑制效應(yīng)。而空白脂質(zhì)體、脂質(zhì)體包裹的錯(cuò)配鏈等對/^"的表達(dá)沒有明顯影響。實(shí)施例9脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09與苯唑西林聯(lián)合用藥對MRSA感染所致的小鼠敗血癥的治療作用1、構(gòu)建BALB/c小鼠敗血癥模型我們通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了MRSA導(dǎo)致BALB/c小鼠100%死亡的最小菌量是5xl05CFU/ml。將復(fù)蘇的MRSA菌液于實(shí)驗(yàn)前1天接種于2ml營養(yǎng)肉湯中，35r孵育6h后，再將其按轉(zhuǎn)1:100種于營養(yǎng)肉湯中，35'C孵育至對數(shù)生長期，即為實(shí)驗(yàn)所用菌液。將細(xì)菌原液離心(12000r/min，2min)后，用0.9%的無菌生理鹽水重懸并稀釋至5><105CFU/ml。腹腔注射MRSA懸液(5xl05CFU/ml，25ml/kg)，連續(xù)觀察BALB/c小鼠一周。2、實(shí)驗(yàn)分組及處理應(yīng)用上述敗血癥模型評估脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09在小鼠體內(nèi)能否逆轉(zhuǎn)MRSA對苯唑西林的耐藥性。140只小鼠隨機(jī)分為7組，每組20只，每只小鼠均腹腔注射MRSA懸液(5xl05CFU/ml，25ml/kg)，后立即給予不同的處理I.對照組尾靜脈注射0.9%的無菌生理鹽水，連續(xù)7天；II.苯唑西林組尾靜脈注射苯唑西林(100mg/kg，2Z日，連續(xù)7天)；III.空白脂質(zhì)體組尾靜脈注射空白脂質(zhì)體(2/日，連續(xù)3天)，同時(shí)尾靜脈注射苯唑西林(100mg/kg，2/日，連續(xù)7天)；IV.裸PS-ODNs09治療組尾靜脈注射裸的PS-ODNs09(10mg/kg，1/日，連續(xù)3天)，同時(shí)尾靜脈注射苯唑西林(100mg/kg，2/日，連續(xù)7天)；V.脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09治療組分為大、中、小三個(gè)劑量組，分別尾靜脈注射脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09(2.5、5、10mg/kg/日，連續(xù)3天)，同時(shí)尾靜脈注射苯唑西林(100mg/kg，2/日，連續(xù)7天)。每組取15只BALB/c小鼠連續(xù)觀察一周，記錄死亡情況。每組另外5只小鼠于第一次治療后24小時(shí)經(jīng)尾穿刺靜脈取血后處死。每只小鼠取O.lml血樣進(jìn)行適量稀釋，吸取50pi稀釋菌液均勻涂布于M-H瓊脂培養(yǎng)基表面，35'C恒溫孵育24h,計(jì)數(shù)CFU。結(jié)果顯示對照組、單純苯唑西林治療組、空白脂質(zhì)體加苯唑西林治療組和裸PS-ODNs09加苯唑西林治療組的小鼠全部死亡，存活率為0;而脂質(zhì)體包裹的PS-ODNa09加苯唑西林治療組的小鼠僅部分死亡，2.5、5、10mg/kg三個(gè)劑量組的小鼠存活率分別為26.7。/。、46.7%和53.3%。小鼠血樣菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示對照組、單純苯唑西林治療組、空白脂質(zhì)體加苯唑西林治療組和裸PS-ODNs-09加苯唑西林治療組的小鼠血液培養(yǎng)物均有大量MRSA存在(菌落數(shù)在lVl(f之間)；而脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09的大、中、小三個(gè)治療組分別有2、1、1只小鼠的血液培養(yǎng)物中的MRSA菌落計(jì)數(shù)為O,其余小鼠的血液樣本中的MRSA菌落數(shù)與對照組相比也明顯減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09能逆轉(zhuǎn)MRSA對苯唑西林的耐藥性，恢復(fù)了苯唑西林對MRSA的殺菌作用，從而減少了小鼠體內(nèi)的MRSA菌落數(shù)，提高了小鼠的存活率。(見圖4、圖5)圖4是脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09和苯唑西林聯(lián)合用藥對MRSA所致敗血癥小鼠的存活率的影響圖示。圖中control是PBS組，oxacillin是苯唑西林治療組，oxa+L-PBS是空白脂質(zhì)體和苯唑西林治療組，oxa+F-ODN是裸PS-ODNs09和苯唑西林治療組，oxa+L-ODN是脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09和苯唑西林治療組。圖5是脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09和苯唑西林聯(lián)合用藥對MRSA所致敗血癥小鼠血液菌落數(shù)的影響圖示。圖中C是PBS組，Oxa是苯唑西林治療組，L-PBS是空白脂質(zhì)體和苯嘩西林治療組，F(xiàn)-ODN是裸PS-ODNsG9和苯嘩西林治療組，2.5、5、10分別是2.5、5、10mg/'kg的脂質(zhì)體包裹的PS-ODNs09和苯唑西林聯(lián)合治療組(L-ODN)。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表^i，以基因mecA為特異性靶點(diǎn)的反義寡核苷酸能夠特異性的抑制MRSA的耐藥基因mecA的表達(dá)，從而恢復(fù)了MRSA對苯唑西林等0-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，恢復(fù)了該類抗生素對MRSA的殺菌效能。說明上述的以mecA為靶點(diǎn)的反義核酸具有抗MRSA耐藥性的作用，通過對核酸的序列長度、修飾方法等進(jìn)行優(yōu)化和篩選，反義寡核苷酸具有開發(fā)為對抗MRSA耐藥性的藥物的前景，與抗生素聯(lián)合用藥用于MRSA感染性疾病的治療。設(shè)計(jì)的反義硫代寡聚脫氧核苷酸-反義核酸篩選出的作用靶位點(diǎn)最佳核酸序列(5，一3，)PS-ODNsOl基因的-11~6位TTTCATCAATATCCTCCTPS-ODNs02基因的42~59位ATACCAAACCCGACAACTPS-ODNs03基因的161178位CTTCACCATTATCGCTTTPS-ODNs04基因附"J的307-324位AATGTTACCGTAGTTTGTPS-ODNs05基因的352-369位CCACATACCATCTTCTTTPS-ODNs06基因的487~504位ATGTGTTCCTGTATTGGCPS-ODNs07基因的582-599位TTGTTGTTGATATAGTCTPS-ODNs08基因的796-813位GCCTTTATATTCTTTTTGPS-ODNs09基因的833-850位CGAGTCCCTTTTTACCAAPS-ODNslO基因wed的950~967位CTTTGCCATCTTTTTTCTPS-ODNs11基因的11241141位TATATTCTTCGTTACTCAPS陽ODNs12基因柳CJ的11441161位TTTATCTTCGGTTAATTTPS-ODNsl3基因附"J的1151~1168位GTTCTTTTTTATCTTCGGPS-ODNs14基因的U851202位GGTGAAGTTGTAATCTGGPS-ODNs15基因的1252-1269位TGTTTTATCGTCTAATGTPS-ODNs16基因附gd的1283~1300位TTTGCCAACCTTTACCATPS-ODNs17基因的1337~1354位TACCATTTACCACTTCATPS-ODNsl8基因附"j的1458~1475位ATATCTTCACCAACACCTPS-ODNs19基因的16521669位CTTTGTTTTTCGTGTCTTPS-ODNs20基因AW6d的181(M827位TTCTCCTTGTTTCATTTT權(quán)利要求1、抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs)，其特征在于可特異性與MRSA耐藥基因mecA的不同區(qū)域結(jié)合，阻斷耐藥基因mecA的表達(dá)，其反義核酸的堿基序列如下2、根據(jù)^:利要求i所述的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義硫代寡聚脫氧核苷酸，其特征在于硫代寡聚脫氧核苷酸為18個(gè)堿基，.經(jīng)全硫代修飾。3、根據(jù)外又利要求1所述的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義硫代寡聚脫氧核苷酸，其特征在于PS-ODNs01~PS-ODNs20均是靶向基因的反義硫代寡聚脫氧核苷酸。4、根據(jù)ft(利要求書1所述的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義硫代寡聚脫氧核苷酸，其特征'在于所述的反義寡聚脫氧核苷酸用于抑制MRSA的耐藥基因,d表込、使MRSA恢復(fù)對P-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，用于抗MRSA感染的治療。5、根據(jù)權(quán)利要求書1所述的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義硫代寡聚脫氧核苷酸，其特征在于所述的反義寡聚脫氧核苷酸序列用于制備抗MRSA耐藥性藥物的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一類針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)耐藥基因mecA的反義硫代寡聚脫氧核苷酸序列及其制備含有該反義寡聚脫氧核苷酸序列的藥物及其用途，其特征在于可特異性與MRSA耐藥基因mecA的不同區(qū)域結(jié)合，阻斷耐藥基因mecA的表達(dá)，其反義寡聚脫氧核苷酸的堿基序列為PS-ODNs01-20，該類反義寡聚脫氧核苷酸能夠與靶基因的特定位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制耐藥基因的表達(dá)，使MRSA恢復(fù)對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，從而達(dá)到有效對抗MRSA耐藥性的目的。文檔編號C12N15/11GK101418294SQ20081023250公開日2009年4月29日申請日期2008年12月1日優(yōu)先權(quán)日2008年12月1日發(fā)明者何功浩,征侯,孟靜茹,慧王,羅曉星,敏賈,雪馬申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)