專利名稱：用于檢測eb病毒的引物、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及用于檢測愛潑斯坦-巴爾病毒 (Epstein-Barr virus，EBV，在此簡稱EB病毒)的引物、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)屬于γ皰疹病毒亞科的成員之一，是人類的一種特異性嗜淋巴細(xì)胞性皰疹病毒，一直被認(rèn)為是人類某些嚴(yán)重疾病以及腫瘤的致病因子，與許多疾病的發(fā)生都有著密切的關(guān)系，威脅著人類的健康。EBV主要通過人類唾液傳播， 因此呼吸道是EBV潛伏的最大場所。調(diào)查結(jié)果顯示，世界人口的90%以上都存在EBV的潛伏感染，或成為EBV攜帶者。更重要的是EBV感染與越來越多的人類惡性腫瘤有關(guān)，應(yīng)用原位雜交證明了攜帶高拷貝EBV除了能轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞外，也能賦予腫瘤細(xì)胞一定的生長優(yōu)勢，使其成為優(yōu)勢細(xì)胞群，呈現(xiàn)轉(zhuǎn)化特征。EBV引發(fā)了全球癌癥的1%，并占所有感染性癌癥的5. 6%。根據(jù)國際癌癥研究署對致癌因子的分類標(biāo)準(zhǔn)，EBV被列在第一組致癌因子中。隨著近幾年癌癥在全球的急劇蔓延，EBV感染的早期檢測和預(yù)防成為當(dāng)務(wù)之急。 目前ELISA檢測EBV各項(xiàng)抗體是臨床診斷EBV感染的重要指標(biāo)之一，但它實(shí)際上檢測的是人體對EBV感染的免疫反應(yīng)狀態(tài)，無法檢測病毒自身，也就無法準(zhǔn)確靈敏地反映EBV感染的情況。由于鼻咽癌外周血循環(huán)的游離EBV-DNA的拷貝數(shù)隨著全身化療周期的進(jìn)行而呈現(xiàn)動態(tài)變化，所以檢測鼻咽癌患者EBV-DNA的表達(dá)水平對判斷病灶殘留、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、判斷治療的敏感性、綜合治療方案的及時(shí)更改、確認(rèn)以及判斷療效、預(yù)后均具有重要的指導(dǎo)意義，EBV 目前已經(jīng)成為鼻咽癌診治中重要的血清分子標(biāo)志物，可以作為診斷和治療中的一項(xiàng)參考依據(jù)。目前國外已經(jīng)上市的檢測EBV-DNA的試劑盒有幾種，檢測的方法主要是熒光免疫雜交(HIGH)，國內(nèi)檢測EBV主要采用ELISA方法，未見有批準(zhǔn)上市檢測EBV-DNA的試劑盒。 基于EBV感染情況如此嚴(yán)重，開發(fā)一種簡單、易行、成本較低的檢測方法就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用于檢測EB病毒的引物或其組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述引物或其組合物在制備用于檢測EB病毒的工具中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種用于檢測EB病毒的試劑盒。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種檢測EB病毒的方法。本發(fā)明的目的是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測EB病毒的引物，該引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :1，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明還提供了一種用于檢測EB病毒的引物組合物，該引物組合物包括上述用于檢測EB病毒的引物以及內(nèi)參引物，該內(nèi)參引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :3，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :4。另一方面，本發(fā)明提供了上述引物或引物組合物在制備用于檢測EB病毒的工具中的用途。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測EB病毒的試劑盒，該試劑盒包括上述用于檢測EB病毒的引物或引物組合物。該試劑盒還可以包括細(xì)胞裂解液、核酸結(jié)合液、核酸漂洗液和核酸洗滌液和PCR反應(yīng)液。又一方面，本發(fā)明提供了一種檢測EB病毒的方法，該方法包括以下步驟1)提取樣本DNA;2)使用上述引物、引物組合物或試劑盒對步驟1)得到的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3) 檢測步驟2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。步驟1)中的樣本優(yōu)選為人的血液或體液。步驟3)中的檢測方法優(yōu)選為微流體芯片檢測法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過對患者血液中的DNA進(jìn)行EBV檢測，從而判斷患者是否感染了 EBV，具體包括以下步驟1)提取人臨床樣本的DNA。2)將EBV特異性引物和人DNA保守序列特有基因的特異性引物混合，對被測樣本的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，被擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段大小各不相同。3)擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流體芯片進(jìn)行檢測。4)通過各檢測峰的位置確定檢測到的片段的大小，從而判斷被檢測到的基因，鑒別臨床樣本感染的病毒類別。5)結(jié)果判斷a)未出現(xiàn)任何特異性峰，說明臨床樣本的DNA沒有提取出來，檢測無效；b)只出現(xiàn)DNA內(nèi)參特異性峰，說明沒有EBV感染；c)出現(xiàn)DNA內(nèi)參和EBV特異性峰，說明有EBV感染。本發(fā)明所提供的新型引物、引物組合物、試劑盒及方法，能夠?qū)BV進(jìn)行DNA水平上的檢查，靈敏度更高，效率也相應(yīng)提高。此外，它們操作簡單，成本較低，適宜于推廣應(yīng)用。 具體地，本發(fā)明具有以下有益效果首先，本發(fā)明提供了一種用于檢測EB病毒的引物，其可特異性的擴(kuò)增出EBV的保守序列BamHl-W片段(genbank登錄號為M15973. 1)。該BamHl-W片段在一個(gè)EB病毒拷貝中約重復(fù)10 11次，在不同的EB病毒株之間高度保守，選擇其作為擴(kuò)增的目的基因可提高檢測的敏感性。因此，本發(fā)明人在該BamHl-W中選取了一段基因序列并設(shè)計(jì)了一對特異性引物，即SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。其次，本發(fā)明提供了一種用于檢測EB病毒的引物組合物，其為EBV的保守序列 BamHl-W片段的特異性引物和人DNA保守序列β球蛋白(β-globin)特有基因Β297 (NCBI 查詢號NC_000007. 13)的特異性引物的組合。由于人體細(xì)胞中都含有B297基因，因此引入該基因可以確定模板的提取質(zhì)量，避免擴(kuò)增結(jié)果的假陰性。實(shí)驗(yàn)表明通過PCR反應(yīng)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的內(nèi)參引物較之其它根據(jù)人β球蛋白(β-globin)基因設(shè)計(jì)的引物能夠更快速有效地識別人體DNA，并且擴(kuò)增出的目的基因片段長度為297bp，能夠很好的區(qū)別于EBV的片段長度，有利于后續(xù)的檢測。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了用于檢測EB病毒的工具、試劑盒和方法，其中均采用了 EBV 保守序列BamHl-W片段的特異性引物，或者EBV保守序列BamHl-W片段的特異性引物和人 DNA保守序列特有基因B297的特異性引物的組合，是一種具有較好靈敏度和特異性的檢測EB病毒的工具或方法。本發(fā)明可以在基因水平上進(jìn)行迅速判斷，具有較好的靈敏度。試劑盒能夠檢測出 EB病毒的最低拷貝數(shù)為6X103。本發(fā)明能夠?qū)颊叩呐R床樣本例如血液、體液等進(jìn)行檢測， 不需要對樣本進(jìn)行培養(yǎng)后再對病毒株進(jìn)行檢測，節(jié)約了時(shí)間。同時(shí)，微流體芯片檢測法比傳統(tǒng)的DNA電泳檢測法更簡單、快捷、直觀，為臨床用藥提供了準(zhǔn)確、及時(shí)的指導(dǎo)。本發(fā)明所提供的技術(shù)成熟，雖然其檢測結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性與傳統(tǒng)的凝膠法相同，但是該檢測過程更快捷，檢測結(jié)果更容易判斷，將生物芯片技術(shù)應(yīng)用于EB病毒檢測也是新的發(fā)展趨勢。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中單獨(dú)使用B297引物擴(kuò)增DNA樣品的電泳結(jié)果圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中單獨(dú)使用B658弓丨物擴(kuò)增DNA樣品的電泳結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中使用B297引物和EBV引物擴(kuò)增臨床樣本(含EB)的電泳結(jié)果圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中使用B658引物和EBV引物擴(kuò)增臨床樣本(含EB)的電泳結(jié)果圖。 圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中未感染EBV的DNA樣品的電泳結(jié)果圖。圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中感染EBV的DNA樣品的電泳結(jié)果圖。圖7為本發(fā)明實(shí)施例4中未感染EBV的DNA樣品的微流體芯片檢測結(jié)果圖。圖8為本發(fā)明實(shí)施例4中感染EBV的DNA樣品的微流體芯片檢測結(jié)果圖。圖9A為本發(fā)明實(shí)施例4中對DNA樣品的B297基因測序后的比對結(jié)果。圖9B為本發(fā)明實(shí)施例4中對DNA樣品的EBV基因測序后的比對結(jié)果。圖IOA 圖IOF為本發(fā)明提供的檢測試劑盒靈敏度的微流體芯片檢測結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中所使用的技術(shù)，除非特別說明，均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)；所使用的儀器、設(shè)備、試劑等，除非是本說明書特別說明，均為本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人員可以通過公共途徑獲得的。實(shí)施例1 =DNA樣品的制備本實(shí)施例采用人體血液樣本制備本發(fā)明檢測方法所使用的DNA樣品，具體詳述如下。1、提取試劑A液細(xì)胞裂解液，15ml/瓶，每次用200 μ 1。_成份終濃度_Tris-HCl (ρΗ8· 0) 0. Olmol/1
NaCl0. lmol/1
EDTA (ρΗ8· 0)0. 01mol/l
SDS2% (g/ml)
B液核酸結(jié)合液，25ml/瓶，每次用400 μ 1。
成份終濃度
GuSCN5mol/l
Tris-HCl(ρΗ6. 4)0.05mol/l
EDTA (ρΗ8· 0)0.02mol/l
TrtionX-1002. 5% (g/ml)
C液核酸漂洗液，20ml/瓶，每次用300 μ 1。
成份含量
GuSCN5mol/l
Tris-HCl(ρΗ6. 4)0.05mol/l
D 核酸洗脫液，5ml/'瓶，每次用50 μ 1。
成份終濃度
Tris-HCl(pH8. 0)0. 01mol/l
NaCl0. lmol/1
EDTA (ρΗ8· 0)0. 01mol/l
E :20mg/ml蛋白酶K，l. 2ml/管，每次使用20 μ 1。 2、提取方法
1)取樣將加入EDTA抗凝劑的血液樣本解凍，混合均勻后取100μ 1于1. 5ml的:內(nèi)。
2)裂解加入A液200μ 1和蛋白酶K 20 μ 1，混勻后于56°C放置10分鐘(每隔2 分鐘混勻一次，確保裂解充分)。
3)吸附先在吸附柱中加入B液400μ1，然后將裂解液緩慢的傾倒入吸附柱中。 混勻后放置2分鐘，然后12000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘。
4)漂洗去廢液，在吸附柱中加入C液300μ 1，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，去廢液；再加入70% (V/V)的乙醇700 μ 1，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘去廢液；最后再12000轉(zhuǎn) /分鐘離心2分鐘，徹底去廢液。
5)洗脫換一個(gè)干凈的1. 5ml EP管，套住吸附柱，在吸附柱中央加入D液50 μ L， 于56°C放置10分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘。流出液即為提取的DNA樣品，可直接用于PCR反應(yīng)。實(shí)施例2 內(nèi)參引物序列的確定本實(shí)施例采用根據(jù)人DNA保守序列β球蛋白特有基因設(shè)計(jì)的兩對DNA擴(kuò)增引物擴(kuò)增實(shí)施例1所制備的DNA樣品，并用凝膠電泳檢測這兩對引物的擴(kuò)增效果，以篩選出內(nèi)參引物。1、單引物PCR擴(kuò)增1)在200 μ L Eppendorf管內(nèi)配制25 μ 1反應(yīng)體系如下，其中提取的DNA樣品分別為10份不同的血樣DNA _成份體積/μ
ddH2018. 3
5U/μ 1 Taq 酶0. 2
Taq 酶 IOXbuffer2. 5
10 μ M內(nèi)參上、下游引物各0.5
2. 5mM dNTP2
提取的DNA樣品1
內(nèi)參引物的具體序列如表1所示。表1 PCR擴(kuò)增內(nèi)參引物序列
權(quán)利要求
1.一種用于檢測EB病毒的引物，該引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID N0:1，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
2.一種用于檢測EB病毒的引物組合物，該引物組合物包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物和內(nèi)參引物，該內(nèi)參引物的上游引物核苷酸序列為SEQID NO :3，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2所述的引物組合物在制備用于檢測EB病毒的工具中的用途。
4.一種用于檢測EB病毒的試劑盒，該試劑盒包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2所述的引物組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括細(xì)胞裂解液、核酸結(jié)合液、核酸漂洗液、核酸洗脫液和PCR反應(yīng)液。
6.一種檢測EB病毒的方法，該方法包括以下步驟1)提取樣本DNA；2)使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物、權(quán)利要求2所述的引物組合物、或者權(quán)利要求3或 4所述的試劑盒對步驟1)得到的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)檢測步驟2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述步驟1)中的樣本為人的血液或體液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，其中所述步驟3)中的檢測方法為微流體芯片檢測法。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測EB病毒的引物、試劑盒及方法。其中該引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO1，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO2。本發(fā)明還提供了包括該引物的用于檢測EB病毒的組合物、工具、試劑盒和方法。它們可以在基因水平上進(jìn)行迅速的檢測，靈敏度高和特異性號，具有節(jié)約時(shí)間、技術(shù)成熟及檢測結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK102168149SQ20101012219
公開日2011年8月31日 申請日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者倪劍鋒, 楊文輝, 謝育媛, 趙珊珊, 鄧其濤 申請人:寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司