檢測(cè)松材線蟲的方法、檢測(cè)引物及其lamp檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)松材線蟲的方法、檢測(cè)引物及其LAMP檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供一種檢測(cè)松材線蟲的方法，包括：（1）提取松樹木材樣品中松材線蟲DNA；（2）建立LAMP反應(yīng)體系，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；（3）根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物熒光或濁度的變化，判定松樹木材樣品中是否存在松材線蟲。本發(fā)明還提供了一種操作簡(jiǎn)便、成本低、穩(wěn)定性強(qiáng)的從松樹木材中提取松材線蟲DNA的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了檢測(cè)松材線蟲的特異性強(qiáng)、靈敏度高的LAMP引物組。本發(fā)明還提供了松材線蟲LAMP檢測(cè)試劑盒，包括：LAMP引物組，反應(yīng)緩沖液，DNA鏈置換酶和熒光染料/特異探針。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)方便快捷等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)松材線蟲的方法、檢測(cè)引物及其LAMP檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測(cè)植物線蟲的試劑盒，尤其涉及一種檢測(cè)松材線蟲(Bursphelenchus xylophilus)的方法、專用的LAMP檢測(cè)引物及LAMP檢測(cè)試劑盒,屬于松材線蟲的檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]松材線蟲(Bursphelenchus xylophilus)病又稱松樹萎蔫病,可在短時(shí)間導(dǎo)致松樹死亡，是松樹上的一種毀滅性病害。該病寄主包括黑松、赤松和馬尾松等數(shù)十種松屬植物，也危害少數(shù)非松屬針葉樹(朱克恭，朱正昌，嚴(yán)敖金.松材線蟲的流行與研究進(jìn)展[c].中國(guó)松材線蟲病的流行與治理[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社，1995.)。日本1905年首次報(bào)道了該病在長(zhǎng)崎縣引起松樹大面積枯死。目前該病分布于美國(guó)、加拿大、墨西哥、葡萄牙、韓國(guó)、日本及中國(guó)等多個(gè)國(guó)家，其中在日本、中國(guó)和韓國(guó)發(fā)生最為嚴(yán)重(Khan F A, GbadegesinR A.0n the occurrence of nematode induecd pine wilt disease in Nigeria[J].Pakistan Journal of Nematology,1991(9):57-58.Mota M M, Braasch H, Bravo M A, etal.First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe[J].Nematology，1999，1:727-734.)。中國(guó)自1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)該病短短30年時(shí)間里，疫情已擴(kuò)大到江蘇、安徽、廣東、浙江、山東、福建、江西、廣西、四川等16個(gè)省區(qū)，每年發(fā)生面積近10萬(wàn)hm2，累計(jì)致死松樹5000多萬(wàn)株，直接經(jīng)濟(jì)損失25億元，間接損失250億元。因此，加強(qiáng)對(duì)松材線蟲病的檢疫，防止其遠(yuǎn)距離傳播是治理松材線蟲病工作的主要任務(wù)。
[0003]松材線蟲檢疫方法主要有形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)檢測(cè)兩種。形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法存在以下缺點(diǎn):(1)由于寄主、環(huán)境、地理位置等外部因素的影響，松材線蟲種內(nèi)和種間的形態(tài)都有了較大的變化，作為形態(tài)鑒定特征重要依據(jù)的雌蟲尾尖突、尾形、雄蟲交合傘形狀等常常會(huì)發(fā)生一些變化，給準(zhǔn)確鑒定帶來(lái)很大難度。(2)由于線蟲形態(tài)學(xué)鑒定必需有具有專業(yè)知識(shí)人才和儀器設(shè)備的機(jī)構(gòu)進(jìn)行，致使形態(tài)學(xué)觀察的應(yīng)用范圍受到很大的限制。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，許多基于遺傳物質(zhì)的分子檢測(cè)方法快速發(fā)展起來(lái)，由于其具有準(zhǔn)確、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，為有效地開展檢測(cè)和控制工作提供了很好的方法，逐漸成為主要的檢測(cè)方法之一。分子生物學(xué)檢測(cè)方法不僅具有準(zhǔn)確、快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)，而且由于可以直接從枯死松木中檢出松材線蟲,大大節(jié)省了時(shí)間 ，因此,近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于松材線蟲的檢疫檢測(cè)工作中，具有非常好的應(yīng)用前景。
[0004]松材線蟲分子檢測(cè)是通過(guò)分析松材線蟲DNA特有的基因組區(qū)域而對(duì)其做出準(zhǔn)確的鑒定。因此，獲得高質(zhì)量的松材線蟲基因組DNA是分子檢測(cè)過(guò)程中最關(guān)鍵的步驟。傳統(tǒng)提取木片中松材線蟲的方法為CTAB法，這種方法的主要缺點(diǎn)是:需要較多的樣本、提取時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)程繁瑣、必需在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行、不能應(yīng)用于野外環(huán)境，因此無(wú)法滿足實(shí)際檢測(cè)需要。公布號(hào)為CN 102016030 A的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種直接從木片中提取松材線蟲DNA的方法，這個(gè)方法雖然具有需要樣品量少，檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，但存在檢測(cè)試劑不易保存、檢測(cè)費(fèi)用昂貴的缺點(diǎn)。松材線蟲病的檢驗(yàn)檢疫部門多在基層單位，試驗(yàn)條件相對(duì)較差，公布號(hào)為CN 102016030 A的專利申請(qǐng)使用的DNA提取液中含有酶類物質(zhì)，必須_20°C保存，而偏遠(yuǎn)山區(qū)的檢測(cè)檢疫部門可能不具備試劑儲(chǔ)存條件。另外，該申請(qǐng)方法使用的DNA提取試劑盒(ISOHAIR，nipp0ngene)價(jià)格昂貴(50元人民幣/樣品)，在實(shí)際工作中，檢測(cè)樣品量大，一般檢測(cè)檢疫部門無(wú)法承擔(dān)使用這種方法產(chǎn)生的高昂檢測(cè)費(fèi)用。本領(lǐng)域迫切需要穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低、操作方法簡(jiǎn)便的從木塊中提取松材線蟲基因組DNA的方法。 [0005]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技術(shù)是針對(duì)革巴基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物,利用一種鏈置換型DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫65°C左右保溫幾十分鐘快速進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法。由于其具有快速、簡(jiǎn)便、特異性好、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)應(yīng)用于臨床診斷、食品衛(wèi)生檢疫及基因芯片的開發(fā)。采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)成功檢測(cè)松材線蟲的關(guān)鍵是需要針對(duì)松材線蟲的靶基因設(shè)計(jì)出特異性強(qiáng)、靈敏度高的LAMP引物組，現(xiàn)有的用于檢測(cè)松材線蟲的LAMP引物組，不同程度的存在著特異性差、靈敏度低的缺陷，有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測(cè)松材線蟲的方法；
[0007]本發(fā)明的目的之二是提供用于檢測(cè)松材線蟲的LAMP引物組；
[0008]本發(fā)明的目的之三是提供檢測(cè)松材線蟲的LAMP檢測(cè)試劑盒。
[0009]本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)是實(shí)現(xiàn)的:
[0010]本發(fā)明首先提供了一種檢測(cè)松材線蟲的方法，該方法包括以下步驟:
[0011](I)從待檢測(cè)的松樹木材樣品中提取松材線蟲DNA ；(2)以提取的DNA為模板，加入包括LAMP引物組、Bst DNA聚合酶在內(nèi)的組分建立LAMP反應(yīng)體系，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；
(3)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物熒光的有無(wú)或濁度的變化，判定待檢測(cè)的松樹木材樣品中是否存在松材線蟲。
[0012]松材線蟲分子檢測(cè)是通過(guò)分析松材線蟲DNA特有的基因組區(qū)域而對(duì)其做出準(zhǔn)確的鑒定。因此，獲得高質(zhì)量的松材線蟲基因組DNA是分子檢測(cè)過(guò)程中最關(guān)鍵的步驟。傳統(tǒng)提取松樹木片中松材線蟲的方法為CTAB法，這種方法的主要缺點(diǎn)是:需要較多的樣本、提取時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)程繁瑣、必需在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行、不能應(yīng)用于野外環(huán)境，因此無(wú)法滿足實(shí)際檢測(cè)需要。本領(lǐng)域迫切需要穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低、操作方法簡(jiǎn)便的從松樹木塊兒中提取松材線蟲基因組DNA的方法。
[0013]本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用2-10% (w/v)的Chelex-100作為提取緩沖液，特別是采用5% (w/v)的Chelex-100作為提取緩沖液提取松樹木材中的松材線蟲基因組DNA，不僅步驟簡(jiǎn)捷，而且所提取的DNA質(zhì)量較高。本發(fā)明通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)非常意外的發(fā)現(xiàn):先用異硫氰酸胍提取緩沖液處理木材樣品，再加入2-10% (w/v)的Chelex-100進(jìn)行提取，能夠非常有效的提高松材線蟲基因組DNA的得率和純度。
[0014]更優(yōu)選的，本發(fā)明的一種從待檢測(cè)的松樹木材樣品中提取松材線蟲基因組DNA的方法，包括以下步驟:
[0015]( I)向待檢測(cè)的松樹木材樣品中加入異硫氰酸胍提取緩沖液攪拌混勻，冰上放置3-10min,沸水煮 3-lOmin ； (2)加入 2-10%(w/v) Chelex-100 攪拌混勻，沸水煮 5_15min,離心，取上清液，即得；
[0016]其中，步驟(1)中所述的冰上放置時(shí)間優(yōu)選為5min，沸水煮的時(shí)間優(yōu)選為5min ;步驟(2)中所述的沸水煮的時(shí)間優(yōu)選為8min。
[0017]本發(fā)明中所述的異硫氰酸胍提取緩沖液的組成優(yōu)選為:異硫氰酸胍2-4mol/L ；Tris-HCl 0.01-0.lmol/L ；EDTA 0.01-0.05mol/L；Triton X-1000.05%-2% ;更優(yōu)選為:異硫氰酸胍 3mol/L ;Tris-HCl 0.05mol/L(pH8.0) ；EDTA 0.02mol/L(pH8.0) ；TritonX-1001%o
[0018]本發(fā)明從松樹木材中提取松材線蟲基因組DNA的方法也適用于以松材線蟲為對(duì)象，直接提取其基因組DNA，采用該方法直接提取松材線蟲的DNA，同樣具有DNA得率和純度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于各種檢測(cè)或研究；此外，本發(fā)明中所述的松材線蟲是包括表1在內(nèi)的任何一種株系的松材線蟲。
[0019]本發(fā)明中所述的松樹可以是任何一種被松材線蟲侵染的松樹，包括但不限于:馬尾松、白皮松、樟子松、五針?biāo)伞⒑谒?、紅松、油松、喬松、赤松、琉球松、歐洲黑松、海岸松、歐洲山松、輻射松、西黃松、西部白松、臺(tái)灣黑松、濕地松、剛松、扭葉松、北美喬松、火炬松、長(zhǎng)葉松、北美短葉松、刺葉松、加勒比松等。
[0020]采用LAMP方法擴(kuò)增松材線蟲，篩選獲得特異性高、靈敏度好的LAMP組是準(zhǔn)確、靈敏、特異性擴(kuò)增出松材線蟲的關(guān)鍵；為了篩選獲得特異性高、靈敏度好的LAMP引物，本實(shí)驗(yàn)克隆比較了松材線蟲和擬松材線蟲核糖體的28S、18S、IGS區(qū)、mtCO1、HSP70、β -tubulin和SYG-2基因。在28S、18S、mtCOI基因中無(wú)法找到滿足LAMP引物設(shè)計(jì)相似度低于80%的原則的區(qū)域，因此棄用28S、18S、mtCOI基因；IGS因其保守性差，種間種內(nèi)都有極大差異也被棄用；在肥?70基因、β-tubulin基因和SYG-2基因中，可以找到用于設(shè)計(jì)LAMP引物的區(qū)域，于是分別以這三個(gè)基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行了 LAMP引物設(shè)計(jì)。以HSP70為靶基因設(shè)計(jì)了 2對(duì)LAMP引物組，以β -tubulin`基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)了 5對(duì)LAMP引物組，以SYG-2基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)了 8對(duì)LAMP引物組；分別以HSP70和β -tubulin為靶基因設(shè)計(jì)的LAMP引物組經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證后，因其擴(kuò)增量不夠或者特異性不高而棄用；以SYG-2基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)的8對(duì)LAMP引物組經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，4號(hào)引物組、18號(hào)引物組、IF引物組、8號(hào)引物組和13號(hào)引物組均能特異的擴(kuò)增出松材線蟲，且最好的引物組是4號(hào)引物組(由上游外部引物SEQ ID N0.13、下游外部引物SEQ ID N0.14、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.15和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.16組成)，能在40分鐘內(nèi)檢出含有松材線蟲的木樣，加上環(huán)引物后可在35分鐘內(nèi)檢出；其次是8號(hào)和18號(hào)引物組，均能在50分鐘內(nèi)檢出含有松材線蟲的木樣，加上環(huán)引物后可在40分鐘內(nèi)檢出。
[0021 ] 本發(fā)明以4號(hào)引物組為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增弓丨物進(jìn)行了 7個(gè)溫度梯度(57-63°C )下的LAMP擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4號(hào)引物組在60°C下擴(kuò)增松材線蟲的效果為最好，加入環(huán)引物在35min左右即可出峰。
[0022]為了檢測(cè)4號(hào)引物組擴(kuò)增松材線蟲的特異性，本發(fā)明選取34個(gè)樣品進(jìn)行了特異性檢測(cè)試驗(yàn)。樣品具體為:八種傘滑刃屬線蟲,包括九個(gè)松材線蟲種群、七個(gè)擬松材線蟲種群、兩個(gè)豆傘滑刃線蟲種群及五種傘滑刃屬線蟲各一個(gè)種群；三種屬外線蟲；六種真菌，其中灰葡萄孢和柿盤多毛孢是兩種用于人工培養(yǎng)松材線蟲的真菌，另外四種真菌分別屬于木霉、青霉、輪枝霉和鐮刀菌，在馬尾松和黑松樹干內(nèi)曾經(jīng)分離獲得過(guò)這四個(gè)屬的真菌；兩種易感病松樹(表1)。特異性驗(yàn)證結(jié)果表明，所有松材線蟲樣品均能得到陽(yáng)性結(jié)果，其他樣品結(jié)果為陰性，特異性高。同時(shí)，本發(fā)明運(yùn)用Kikuchi (2008)等針對(duì)松材線蟲ITS區(qū)設(shè)計(jì)的LAMP引物組擴(kuò)增34個(gè)樣品，偽傘滑刃線蟲和豆傘滑刃線蟲在50min左右開始能被檢出，擬松材線蟲在90min左右也開始能被檢出，其引物組特異性明顯低于4號(hào)引物組。
[0023]表1供試線蟲、真菌和植物種群和株系的詳細(xì)信息
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)松材線蟲的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (I)從待檢測(cè)的松樹木材樣品中提取松材線蟲基因組DNA ；(2)以提取的DNA為模板，加入包括LAMP引物組、Bst DNA聚合酶在內(nèi)的組分建立LAMP反應(yīng)體系，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；(3)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物熒光的有無(wú)或濁度的變化，判定待檢測(cè)的松樹木材樣品中是否存在松材線蟲。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)采用2-10%的Chelex-1OO作為提取緩沖液提取松樹木材樣品中松材線蟲DNA，優(yōu)選的，采用5%的Chelex-100作為提取緩沖液提取松樹木材樣品中的松材線蟲DNA ;更優(yōu)選的，先用異硫氰酸胍提取緩沖液處理松樹木材樣品，再加入2-10%的Chelex-100提取松樹木材樣品中的松材線蟲DNA。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中所述的從待檢測(cè)的松樹木材樣品中提取松材線蟲DNA的方法，包括以下步驟: (O向待檢測(cè)的松樹木材樣品中加入異硫氰酸胍提取緩沖液攪拌混勻，冰上放置后，沸水煮3-10min ;(2)按w/v計(jì),加入2-10%Chelex-100攪拌混勻,沸水煮5_15min,離心,取上清液，即得；其中，步驟(1)中所述的冰上放置時(shí)間優(yōu)選為3-10min，更優(yōu)選為5min，沸水煮的時(shí)間優(yōu)選為5min ;步驟(2)中所述的沸水煮的時(shí)間優(yōu)選為8min。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的LAMP引物組選自以下5組引物中的任意一組: 4號(hào)引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.13、下游外部引物SEQ ID N0.14、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.15和下游 內(nèi)部引物SEQ ID N0.16組成； 18號(hào)引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.17、下游外部引物SEQ ID N0.18、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.19和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.20所示的引物組成； IF引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.21、下游外部引物SEQ ID N0.22、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.23和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.24所示的引物組成； 8號(hào)引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.25、下游外部引物SEQ ID N0.26、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.27和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.28所示的引物組成； 13號(hào)引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.29、下游外部引物SEQ ID N0.30、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.31和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.32所示的引物組成。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:在所述5組引物組中還含有一條SEQIDN0.33所示的環(huán)引物。
6.用于檢測(cè)松材線蟲的LAMP引物組，其特征在于，選自以下5組引物中的任意一組: 4號(hào)引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.13、下游外部引物SEQ ID N0.14、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.15和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.16組成； 18號(hào)引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.17、下游外部引物SEQ ID N0.18、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.19和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.20所示的引物組成； IF引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.21、下游外部引物SEQ ID N0.22、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.23和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.24所示的引物組成； 8號(hào)引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.25、下游外部引物SEQ ID N0.26、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.27和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.28所示的引物組成； 13號(hào)引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.29、下游外部引物SEQ ID N0.30、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.31和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.32所示的引物組成。
7.一種檢測(cè)松材線蟲的LAMP試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括以下各組分:LAMP引物組，LAMP反應(yīng)緩沖液，DNA鏈置換酶和熒光染料； 其中，所述的LAMP引物組選自以下5組引物中的任意一組: 4號(hào)引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.13、下游外部引物SEQ ID N0.14、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.15和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.16組成； 18號(hào)引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.17、下游外部引物SEQ ID N0.18、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.19和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.20所示的引物組成； IF引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.21、下游外部引物SEQ ID N0.22、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.23和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.24所示的引物組成； 8號(hào)引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.25、下游外部引物SEQ ID N0.26、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.27和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.28所示的引物組成； 13號(hào)引物組:由上游外部引物SEQ ID N0.29、下游外部引物SEQ ID N0.30、上游內(nèi)部引物SEQ ID N0.31和下游內(nèi)部引物SEQ ID N0.32所示的引物組成。
8.按照權(quán)利要求7所述的LAMP試劑盒，其特征在于:所述5組LAMP引物組中各含有一條SEQ ID N0.33所示的環(huán)引物。
9.權(quán)利要求7或8所述LAMP試劑盒在檢測(cè)松材線蟲中的應(yīng)用，包括:(I)建立LAMP反應(yīng)體系；(2)將LAMP反應(yīng)體系在57-63°C的溫度下水浴60到120min，最后在80°C溫度下溫育3-10min ；(3)將LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)濁度儀實(shí)時(shí)檢測(cè)白色沉淀以判別待檢測(cè)樣品中是否含有松材線蟲。
10.按照權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:步驟(2)中將所建立的LAMP反應(yīng)體系在60°C的溫度下反應(yīng)60到120min，最后在80°C溫度下溫育3_10min ;其中，所述的LAMP反應(yīng)體系參照以下方式建立:待檢測(cè)的DNA提取液2 μ L，上游外部引物和上游內(nèi)部引物各5pmol，下游內(nèi)部引物和下游外部引物各40pmol，環(huán)引物20pmol，2XLAMP反應(yīng)mixl2.5yL，DNA鏈置換酶I μ L，熒光染料I μ L0
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103555840SQ201310538469
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】汪來(lái)發(fā), 王曦茁, 茍大平, 田國(guó)忠, 樸春根 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所