專利名稱：由甘油高產(chǎn)率制備3-羥基丙酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)突變微生物而制備3-羥基丙酸的方法，所述突變微生物通過在具有產(chǎn)生輔酶B12能力且具有能夠以甘油作為碳源而產(chǎn)生3-羥基丙酸的能力的微生物中插入或擴(kuò)增丙二醇利用蛋白編碼基因而獲得。
背景技術(shù)：
3-羥基丙酸是一種與乳酸和琥珀酸一起作為生物質(zhì)衍生的平臺化學(xué)原料備受關(guān)注的物質(zhì)，可用作制備1，3-丙二醇、丙烯酸、丙烯酰胺、丙二酸或諸如聚羥基丙酸的生物聚合物的原料。因此，開發(fā)大量制備3-羥基丙酸的技術(shù)非常重要。已知作為用于 制備3-羥基丙酸的化學(xué)方法，有在鈀催化劑存在下由1，3_丙二醇制備3-羥基丙酸的方法(US 5321156);在鈀/鉬催化劑存在下由3-羥基丙醛制備3-羥基丙酸的方法(US 5831121);使用離子交換樹脂由丙烯酸制備3-羥基丙酸的方法(JP2000-159724)；以及在酸或堿催化劑存在下由環(huán)氧化物衍生物制備3-羥基丙酸的方法(KR10-0408806)等。就生物方法而言，威斯康星大學(xué)的Suthers等人報(bào)道了一種使用過表達(dá)源自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脫水酶基因和源自大腸桿菌(E. coli)或釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的醒脫氫酶基因的重組大腸桿菌菌株由甘油制備3-輕基丙酸的方法(US 6852517)。最近，Rathnasingh等人報(bào)道了一種由甘油制備增加量的3-輕基丙酸的新型重組大腸桿菌菌株(Rathnasingh等人，Biotechnol.Bineng. 104:729-39. 2009)。然而，使用重組大腸桿菌由甘油制備3-羥基丙酸的方法的缺點(diǎn)在于，需要向培養(yǎng)基供應(yīng)昂貴的輔酶腺甙鈷胺生素(輔酶B12)以使甘油脫水酶復(fù)活。同時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)當(dāng)在肺炎克雷伯菌中醛脫氫酶基因高表達(dá)時(shí)，能夠以高產(chǎn)率制備3-羥基丙酸而無需添加輔酶B12。因此，本發(fā)明的發(fā)明人等為了開發(fā)通過肺炎克雷伯菌由甘油制備增加量的3-羥基丙酸的方法進(jìn)行了多方面的努力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)羅伊乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的丙二醇利用蛋白編碼基因在肺炎克雷伯菌中過表達(dá)時(shí)，能夠以高產(chǎn)率制備3-羥基丙酸，由此實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種由甘油高產(chǎn)率制備3-羥基丙酸的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能夠由甘油高產(chǎn)率制備3-羥基丙酸的突變微生物。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種突變微生物，所述突變微生物通過在具有產(chǎn)生輔酶B12能力且具有能夠以甘油作為碳源而產(chǎn)生3-羥基丙酸的能力的微生物中插入或擴(kuò)增丙二醇利用蛋白編碼基因而獲得。
本發(fā)明還提供了一種制備具有產(chǎn)生3-羥基丙酸的高能力的突變微生物的方法，其特征在于，在具有產(chǎn)生輔酶B12能力且具有能夠以甘油作為碳源而產(chǎn)生3-羥基丙酸的能力的微生物中插入或擴(kuò)增丙二醇利用蛋白編碼基因。本發(fā)明還提供了一種制備3-羥基丙酸的方法，所述方法包括(a)在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述突變微生物，由此產(chǎn)生3-羥基丙酸的步驟；和(b)回收所產(chǎn)生的1，3-丙二醇的步驟。本發(fā)明還提供了一種肺炎克雷伯菌突變株，其特征在于，在肺炎克雷伯菌中，缺失甘油脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)以及甘油脫水酶復(fù)活因子II基因(DhaBA2)，而且引入了 1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因、醛脫氫酶編碼基因以及丙二醇利用蛋白基因。本發(fā)明還提供了一種制備肺炎克雷伯菌突變株的方法，其特征在于，在肺炎克雷伯菌中，使甘油脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)以及甘油脫水酶復(fù)活因子II基因(DhaBA2)缺失，而且引入1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因、醛脫氫酶編碼基因以及丙二醇利用蛋白基因。本發(fā)明還提供了一種制備3-羥基丙酸的方法，所述方法包括(a)在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述肺炎克雷伯菌突變株，由此產(chǎn)生3-羥基丙酸的步驟；和(b)回收所產(chǎn)生的3-羥基丙酸的步驟。通過下述具體實(shí)施方式
和所附權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和實(shí)施方式將更加明確。


圖1是表示重組質(zhì)粒pVOTLp的構(gòu)建方法圖。

圖2是表示重組質(zhì)粒pVOT的構(gòu)建方法圖。圖3是表示肺炎克雷伯菌AK突變株的構(gòu)建方法圖。
具體實(shí)施例方式除非另有定義，本說明書中所使用的所有科技術(shù)語均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同含義。總體上，下文所描述的本發(fā)明所用術(shù)語和試驗(yàn)方法是本領(lǐng)域公知和通常使用的方法。一方面，本發(fā)明涉及一種突變微生物及其制備方法，所述突變微生物通過在具有產(chǎn)生輔酶B12能力且具有能夠以甘油作為碳源而產(chǎn)生3-羥基丙酸的能力的微生物中插入或擴(kuò)增丙二醇利用蛋白編碼基因而獲得。在本發(fā)明中，上述丙二醇利用蛋白編碼基因可為羅伊乳桿菌(Lactobacillusreuteri)的丙二醇利用蛋白編碼基因(PduP);具有產(chǎn)生輔酶B12能力且具有能夠以甘油作為碳源而產(chǎn)生3-輕基丙酸的能力的微生物,可為克雷伯菌屬(Klebsiella)微生物。在本發(fā)明中，具有產(chǎn)生輔酶B12能力且具有能夠以甘油作為碳源而產(chǎn)生3-羥基丙酸的能力的微生物，可為甘油氧化途徑被阻斷的微生物。另一方面，本發(fā)明涉及一種制備3-羥基丙酸的方法，所述方法包括(a)在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述突變微生物，由此產(chǎn)生3-羥基丙酸的步驟；和(b)回收所產(chǎn)生的3-羥基丙酸的步驟。又一方面，本發(fā)明涉及一種肺炎克雷伯菌突變株及其制備方法，所述肺炎克雷伯菌突變株的特征在于，在肺炎克雷伯菌中，缺失甘油脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)U, 3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)以及甘油脫水酶復(fù)活因子II基因(DhaBA2)，并且引入了 1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因、醛脫氫酶編碼基因以及丙二醇利用蛋白基因而獲得。在本發(fā)明中，丙二醇利用蛋白編碼基因可為羅伊乳桿菌的丙二醇利用蛋白編碼基因(PduP)，上述肺炎克雷伯菌突變株可為肺炎克雷伯菌AK-VOTLp (KCTC 11689BP)。還一方面，本發(fā)明涉及一種制備3-羥基丙酸的方法，所述方法包括(a)在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述肺炎克雷伯菌突變株，由此產(chǎn)生3-羥基丙酸的步驟；和(b)回收所產(chǎn)生的3-羥基丙酸的步驟。在本發(fā)明中，由突變株的培養(yǎng)液回收3-羥基丙酸可利用傳統(tǒng)的分離技術(shù)實(shí)施，例如，包括蒸餾、電滲析、滲透蒸發(fā)、色譜、溶劑萃取、反應(yīng)萃取等，這些技術(shù)通?？陕?lián)合使用以分尚聞純度物質(zhì)。在本發(fā)明中，基因“擴(kuò)增”是指另外引入存在于個(gè)體染色體或質(zhì)粒中的基因以使得能夠被過表達(dá)；基因“引入”是指將基因插入個(gè)體染色體中或使用重組載體將基因轉(zhuǎn)化至個(gè)體中。在本發(fā)明中，作為上述將基因插入細(xì)胞染色體中的方法，可使用本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)基因操作方法實(shí)施。例如，可舉出使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體、單純皰疹病毒載體、 痘病毒載體、慢病毒載體或非病毒載體的方法。實(shí)施例在下文中，將通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是這些實(shí)施例僅用于例示本發(fā)明而并非解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 :過表達(dá)丙二醇利用蛋白編碼基因的肺炎克雷伯菌重組菌株的構(gòu)建(I)過表達(dá)丙二醇利用蛋白編碼基因的質(zhì)粒的構(gòu)建構(gòu)建了用于在肺炎克雷伯菌菌株中過表達(dá)丙二醇利用蛋白編碼基因的質(zhì)粒，所述丙二醇利用蛋白編碼基因被認(rèn)為參與在肺炎克雷伯菌菌株中由甘油產(chǎn)生3-羥基丙酸。將羅伊乳桿菌的染色體DNA作為模板，并使用下列引物序列擴(kuò)增丙二醇利用蛋白編碼基因(PduP) (GenBank數(shù)據(jù)庫號BAG26139)后，用pGEMTEasy載體進(jìn)行克隆并測序，然后構(gòu)建質(zhì)粒DNA (見圖1)。序列號1:5'-TCTAGAatgcagattaatgatattgaaagtgct-3' (PduP-F)序列號2:5'-GGATCCCTCGAGttaataccagttacgtactgagaatcc-3' (AldHk-R)如圖1所示，將羅伊乳桿菌的丙二醇利用蛋白編碼基因(PduP)引入IacZ啟動(dòng)子下游，然后將其插入含有DhaB復(fù)活酶基因(dhaT)和1，3_丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)的質(zhì)粒pVOT中，由此構(gòu)建含有丙二醇利用蛋白編碼基因和DhaB復(fù)活酶基因的質(zhì)粒pVOTLp。將所構(gòu)建的pVOTLp和質(zhì)粒pVOT各自引入消除質(zhì)粒DNA的肺炎克雷伯菌MGH78578菌株(稱為“Cu”)，由此構(gòu)建肺炎克雷伯菌Cu/pVOT和肺炎克雷伯菌Cu/pV0TLp。根據(jù)圖2所示的方法構(gòu)建pVOT質(zhì)粒。將質(zhì)粒pVOT引入肺炎克雷伯菌中，并命名為“肺炎克雷伯菌AK-V0T”。該重組菌株以保藏號KCTC 11421BP保藏于韓國生命工學(xué)研究院生物資源中心。(2)甘油氧化還原途徑被阻斷的肺炎克雷伯菌重組菌株的構(gòu)建通過同源重組方法，并使用消除質(zhì)粒DNA的肺炎克雷伯菌MGH78578菌株(稱為“Cu”)作為母體菌株，以安普霉素(apramycin)抗性基因取代dha調(diào)節(jié)子(圖2)的DhaB酶復(fù)活因子、DhaT基因、DhaR調(diào)節(jié)子以及DhaD基因，由此制備甘油氧化途徑和還原途徑均被阻斷的重組菌株AK。將肺炎克雷伯菌MGH78578菌株的染色體DNA作為模板，使用下列引物組，并通過PCR，擴(kuò)增用于制備同源重組質(zhì)粒的DNA片段。擴(kuò)增dhaBI基因片段用引物序列號3:5'-TCTAGAATGAAAAGATCAAAACGATTT-3' (dhaBI XbaI_480bpF)序列號4:5' -GGATCCGTCAGCGGCAATCTGCAC-3' (dhaBI BamH1-480bpR)擴(kuò)增dhaK基因片段用引物 序列號5:5'-AAGCTTCATGCTCTCCGGCGCCTGTC-3' (dhaK HindII1-200_700bpF)序列號6:5'-AGATCTATTTGGTCCAGCGAGCTGAAGC-3' (dhaK BglI1-200-700bpR)擴(kuò)增dhaR基因片段用引物序列號7:5'-AGATCTCCTGGGATTTCGCGACGGCA-3' (dhaR bglI1-200-700bpF)序列號8:5' -AAGCTTTCGACAATCGGTTTTAAGGTG-3 ' (dhaRHindII1-200-700bpR)擴(kuò)增Apr基因片段用引物序列號9:5'-GTTAACCTGACGCCGTTGGATACACC-3' AprHpaIF序列號10:5'-AGATCTAAAAGCTTATGAGCTCAGCCAATCGA-3' AprHindII1-BglIIR利用pGEM TEasy載體將擴(kuò)增的DNA片段克隆并進(jìn)行測序。然后，如圖3所示，構(gòu)建質(zhì)粒DNA。根據(jù)圖3所示的方法，構(gòu)建用于制備AK菌株的、DhaB基因的氨基末端(dhaB/ )-LacZ啟動(dòng)子(Plaez)_安普霉素抗性基因-DhaK基因的氨基末端(dhaK')被連接的質(zhì)粒DNA。使用BamH1-BglII處理上述質(zhì)粒，并通過電穿孔(電沖擊法)將所收集的DNA片段引入至肺炎克雷伯菌Cu菌株中。然后，將在添加有安普霉素的培養(yǎng)基中分離形成克隆的重組菌株。其結(jié)果，獲得了缺失dha調(diào)節(jié)子的DhaB酶復(fù)活因子、DhaT基因、DhaR調(diào)節(jié)子以及DhaD基因，并插入了 IacZ啟動(dòng)子和安普霉素抗性基因的重組肺炎克雷伯菌AK菌株(KCTC11419BP)。(3)甘油缺氧代謝氧化途徑被阻斷的突變菌株中丙二醇利用蛋白編碼基因的過表達(dá)通過電穿孔將含有丙二醇利用蛋白編碼基因的質(zhì)粒pVOTLp基因、以及含有DhaB復(fù)活酶基因和1，3-丙二醇氧化還原酶基因的質(zhì)粒DNA分別引入肺炎克雷伯菌Cu菌株和AK菌株中。本實(shí)施例中所構(gòu)建的重組菌株AK-VOTLp以保藏號KCTC 11689BP保藏于韓國生命工學(xué)研究院生物資源中心。表1:本發(fā)明所使用或構(gòu)建的重組菌株和質(zhì)粒DNA
權(quán)利要求
1.一種突變微生物，其是在具有產(chǎn)生輔酶B12能力且具有能夠以甘油作為碳源而產(chǎn)生3-羥基丙酸的能力的微生物中，插入或擴(kuò)增丙二醇利用蛋白編碼基因而獲得的突變微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變微生物，其中，所述丙二醇利用蛋白編碼基因是羅伊乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的丙二醇利用蛋白編碼基因(PduP)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變微生物，其中，所述具有產(chǎn)生輔酶B12能力且具有能夠以甘油作為碳源而產(chǎn)生3-羥基丙酸的能力的微生物是肺炎克雷伯菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變微生物，其中，甘油的氧化途徑被阻斷。
5.一種制備具有產(chǎn)生3-羥基丙酸高能力的突變微生物的方法，其特征在于，在具有產(chǎn)生輔酶B12能力且具有能夠以甘油作為碳源而產(chǎn)生3-羥基丙酸的能力的微生物中，插入或擴(kuò)增丙二醇利用蛋白編碼基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述丙二醇利用蛋白編碼基因是羅伊乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的丙二醇利用蛋白編碼基因(PduP)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述具有產(chǎn)生輔酶B12能力且具有能夠以甘油作為碳源而產(chǎn)生3-羥基丙酸的能力的微生物是肺炎克雷伯菌。
8.一種制備3-羥基丙酸的方法，所述方法包括 (a)在含有甘油的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的突變微生物，由此產(chǎn)生3-羥基丙酸的步驟；和 (b)回收所產(chǎn)生的1，3-丙二醇的步驟。
9.一種肺炎克雷伯菌突變株，其特征在于，在肺炎克雷伯菌中缺失甘油脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)以及甘油脫水酶復(fù)活因子II基因(DhaBA2)，并引入了 1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因、醛脫氫酶編碼基因以及丙二醇利用蛋白基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的肺炎克雷伯菌突變株，其中，所述丙二醇利用蛋白編碼基因是羅伊乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的丙二醇利用蛋白編碼基因(PduP)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的肺炎克雷伯菌突變株，其中，所述肺炎克雷伯菌突變株是肺炎 克雷伯菌 AK-VOTLp (KCTC 11689BP)。
12.—種制備肺炎克雷伯菌突變株的方法，其特征在于，在肺炎克雷伯菌中使甘油脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)以及甘油脫水酶復(fù)活因子II基因(DhaBA2)缺失，并將1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因、醛脫氫酶編碼基因以及丙二醇利用蛋白基因引入至肺炎克雷伯菌中。
13.—種制備3-羥基丙酸的方法，所述方法包括 (a)在含有甘油的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的肺炎克雷伯菌突變株，由此產(chǎn)生3-羥基丙酸的步驟；和 (b)回收所產(chǎn)生的3-羥基丙酸的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備3-羥基丙酸的方法，其特征在于，在具有產(chǎn)生輔酶B12能力且具有能夠以甘油作為碳源而產(chǎn)生3-羥基丙酸的能力的微生物中插入或擴(kuò)增丙二醇利用蛋白編碼基因而獲得突變微生物，并將該突變微生物在含有甘油的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明，能夠由甘油高產(chǎn)率制備3-羥基丙酸而無需添加昂貴的輔酶B12作為輔因子。
文檔編號C12P7/40GK103038335SQ201180025904
公開日2013年4月10日 申請日期2011年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者金哲鎬, 徐正又, 羅蓮花 申請人:韓國生命工學(xué)研究院