專利名稱：胰島素樣生長因子1受體結(jié)合肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胰島素樣生長因子I受體結(jié)合肽、編碼該多肽的多核苷酸、以及制備和使用上述物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
生物醫(yī)學(xué)研究和高通量藥物篩選中的新發(fā)展已產(chǎn)生用于治療CNS相關(guān)疾病的眾多潛在治療劑。然而，許多治療劑由于通過血腦屏障(BBB)的轉(zhuǎn)運(yùn)不足而未能完成體內(nèi)測試。
治療劑可以使用多種途徑橫跨BBB，包括可飽和的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，其中待轉(zhuǎn)運(yùn)的治療劑通過BBB中的細(xì)胞內(nèi)在化且發(fā)送到離腔表面用于沉積到腦細(xì)胞內(nèi)液隔室中的吸附轉(zhuǎn)胞吞作用，其中治療劑溶解到構(gòu)成BBB包含的細(xì)胞的膜的脂質(zhì)雙層內(nèi)的跨膜擴(kuò)散，和其中治療劑利用BBB的殘留泄漏的細(xì)胞外途徑。
已嘗試改進(jìn)治療劑以改變其BBB滲透性的多種方法，包括與天然橫跨BBB的蛋白質(zhì)綴合，所述蛋白質(zhì)為例如胰島素、胰島素樣生長因子I和2(IGF-l、IGF-2)、瘦蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白(美國專利申請No. US2007/0081992)，使多肽與結(jié)合某些細(xì)胞受體的陽離子化抗體連接，所述細(xì)胞受體為例如胰島素受體(美國專利No. 7，388, 079)或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(美國專利 No. 6，329，508 ；Zhang 和 Pardridge, Brain Res. 889 :49-56, 2001);使治療劑與合成聚合物例如覆蓋有聚山梨酸酯80的聚(氰基丙烯酸丁酯)或聚丙烯酰胺偶聯(lián)(美國專利申請 No. 2002/0009491 ;美國專利申請 No. 2002/0013266 ;美國專利申請 No. 2006/0051317)， 以及使用脂質(zhì)體或免疫脂質(zhì)體。
目前改善治療劑橫跨BBB的轉(zhuǎn)運(yùn)的方法包括由于與內(nèi)源配體競爭的無效、治療劑轉(zhuǎn)運(yùn)至腦實(shí)質(zhì)的缺乏和由于溶酶體靶向的治療劑降解。
因此，需要開發(fā)轉(zhuǎn)運(yùn)治療劑通過BBB的方法。


圖1示出選擇噬菌體溶解物與IGFlR和IR的結(jié)合。
圖2示出肽-AP融合物與IGFlR的結(jié)合。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面是包含具有SEQ ID NOs :1-13中所示序列的多肽的分離的多肽。
本發(fā)明的另一個方面是包含編碼多肽的多核苷酸的分離的多核苷酸，所述多肽包含SEQ ID NOs :1-13中所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一個方面是包含具有SEQ ID NOs :14-26中所示序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸的分離的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個方面是包含具有SEQ ID NOs :14-26中所示序列的多核苷酸的分離的載體。
本發(fā)明的另一個方面是包含本發(fā)明載體的分離的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個方面是包含融合至第二多肽的具有SEQ ID NOs :1-13中所示序列的多肽的分離的融合蛋白。
本發(fā)明的另一個方面是表達(dá)多肽的方法，其包括以下步驟
a.提供本發(fā)明的宿主細(xì)胞；以及
b.在足以表達(dá)具有SEQ ID NOs :1-13中所示序列的多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個方面是用于在整個內(nèi)皮細(xì)胞上遞送治療劑的方法，其包括
a.使所述治療劑與包含具有SEQ ID NOs :1、2、4、8或12中所示序列的多肽的多肽綴合以形成綴合物；
b.使所述綴合物與所述內(nèi)皮細(xì)胞接觸；以及
c.測量在整個所述內(nèi)皮細(xì)胞上遞送的綴合物的量。
具體實(shí)施方式
本說明書中所引用的所有出版物(包括但不限于專利和專利申請)均以引用方式并入本文，如同在本文中完整給出。
說明書和權(quán)利要求書中所用的“一種”、“該”和“所述”等單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)指代， 除非上下文清楚表明并非如此。因此，例如提及“一種多肽”是指一種或多種多肽并包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解 的含義相同。本文描述了示例性的組合物和方法，不過類似或等同于本文所述的組合物和方法的任何組合物和方法都可用于本發(fā)明實(shí)踐或測試。
術(shù)語“多肽”是指包含至少兩個由肽鍵連接形成多肽的氨基酸殘基的分子。小于 50個氨基酸的小多肽可稱為“肽”。多肽也可稱為“蛋白質(zhì)”。
術(shù)語“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主鏈或其它等同的共價化學(xué)方式所共價連接的核苷酸鏈的分子。雙鏈DNA和單鏈DNA以及雙鏈RNA和單鏈RNA是多核苷酸的典型例子。
術(shù)語“互補(bǔ)序列”是指反向平行于第一分離的多核苷酸序列并包含與第一多核苷酸序列中的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸的第二分離的多核苷酸序列。通常，當(dāng)這種“互補(bǔ)序列”在適當(dāng)?shù)臈l件下與第一分離的多核苷酸序列結(jié)合時，能夠形成雙鏈多核苷酸分子，例如雙鏈 DNA或雙鏈RNA。
術(shù)語“載體”是指能夠在生物系統(tǒng)內(nèi)復(fù)制或可以在此類系統(tǒng)間移動的多核苷酸。 載體多核苷酸通常含有諸如復(fù)制起點(diǎn)、聚腺苷酸化信號或選擇標(biāo)記之類的元件，其功能是促進(jìn)這些多核苷酸在生物系統(tǒng)中的復(fù)制或保持。此類生物系統(tǒng)的例子可包括細(xì)胞、病毒、動物、植物和用能夠復(fù)制載體的生物組分再造的生物系統(tǒng)。包含載體的多核苷酸可以是DNA 或RNA分子或這些分子的雜合體。
術(shù)語“表達(dá)載體”是指能夠用于在生物系統(tǒng)或再造生物系統(tǒng)中以指導(dǎo)由存在于表達(dá)載體中的多核苷酸序列所編碼的多肽的翻譯的載體。
如本文中所用的術(shù)語“血腦屏障”或“BBB”是指在外周循環(huán)以及腦和脊髓之間的屏障，其通過在腦毛細(xì)管內(nèi)皮質(zhì)膜內(nèi)的緊密連接形成，產(chǎn)生限制分子(即使與具有60Da分子量的脲一樣小的分子)傳輸?shù)侥X內(nèi)的非常緊密的屏障。腦內(nèi)的血腦屏障、脊髓內(nèi)的血脊髓屏障和視網(wǎng)膜內(nèi)的血視網(wǎng)膜屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)的鄰接毛細(xì)管屏障，并且統(tǒng)稱為血腦屏障。
術(shù)語“抗體”是指與抗原特異性結(jié)合的分子，并且包括二聚抗體、三聚抗體和多聚抗體，以及嵌合抗體、人源化抗體和全人抗體。此外，抗體可以是完整抗體或抗體分子的功能片段，例如保留至少其抗原結(jié)合功能的片段，并且包括Fab、F(ab' )、F(ab' )2、scFv、 dsFv和雙抗體。例如，抗體片段可以使用蛋白水解酶獲得(例如，用木瓜蛋白酶消化完整抗體，以產(chǎn)生Fab片段，并且胃蛋白酶處理導(dǎo)致F(ab' )2片段的產(chǎn)生)。關(guān)于制備和使用多種抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(Ausubel等人等人編輯，Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.，NY 1987-2001 (《分子生物學(xué)現(xiàn)行規(guī)范》,約翰·威利父子出版公司，紐約，1987-2001 年)；Sambrook 等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (Sambrook 等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》，
第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，1989年)；Harlow and Lane, Antibodies, a LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (Harlow 和 Lane,《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，1989年);Colligan等人編輯，CurrentProtocols in Immunology, John Wiley & Sons,Inc.,NY 1994-2001 (《免疫學(xué)現(xiàn)行規(guī)范》，約翰 威利父子出版公司，紐約，1994-2001 年)；ColIigan等人，Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons,NY,NY, 1997-2001 (Colligan等人,《蛋白質(zhì)科學(xué)現(xiàn)行規(guī)范》,約翰 威利父子出版公司，紐約，1997-2001 年);Kohler 等人，Nature 256 :495-497,1975 (Kohler 等人，《自然》256 =495-497,1975 年)；US 4，816，567，Queen 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. 86 10029-10033，1989 (Queen等人，《美國國家科學(xué)院院刊》86 :10029-10033，1989年)。例如， 缺乏任何非人序列的全人單克隆抗體可以由人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠或噬菌體展示文庫制備(Lonberg 等人，Nature 368 :856_859，1994 (Lonberg 等人，《自然》368 =856-859,1994 年);Fishwild 等人,Nature Biotech. 14 :845-851,1996 (Fishwild 等人，《自然生物技術(shù)》 14 :845-851,1996 年);Mendez 等人，Nature Genetics 15 :146-156,1997 (Mendez 等人，《自然遺傳學(xué)》15 :146-156，1997 年);Knappik 等人，J. Mol. Biol. 296 :57-86, 2000 (Knappik 等人，《美國分子生物學(xué)期刊》296 :57-86，2000 年);Krebs 等人，J.1mmunol. Meth. 265 :67-84, 2001 (Krebs等人，《免疫學(xué)方法雜志》265 =67-84, 2001年))。
抗體分子或制備物當(dāng)相對于結(jié)合第二非相同抗原而言以更高的親和力和以特異性方式而不是非特異性方式結(jié)合給定抗原時，則它“特異性結(jié)合”這個給定抗原。換句話說， 抗體分子或制備物的“特異性結(jié)合”可用于區(qū)分兩種不同的多肽。
如本文中所用的術(shù)語“胰島素樣生長因子受體I”或“IGF1R”是指具有SEQ ID NO 27中所示氨基酸序列的人IGFlR(GenBank登記號NP_000866)。IGFlR前多肽被切割成α 和β鏈，以形成成熟蛋白質(zhì)。α鏈具有SEQ ID NO :27的氨基酸殘基31-740，并且β鏈具有SEQ ID NO :27的氨基酸殘基741-1367。如本文中所用的“可溶的IGF1R”或“sIGFIR” 是指IGFlR的細(xì)胞外域(SEQ ID NO 27的氨基酸殘基31-932)?？扇艿腎GFlR可以是未切割的前多肽的細(xì)胞外域、或成熟IGFlR的細(xì)胞外域(形成α鏈的氨基酸殘基31-740，和形成β鏈的細(xì)胞外部分的氨基酸殘基741-932)。
如本文中所用的術(shù)語“綴合物”是指包含具有SEQ ID NOs :1_13中所示氨基酸序列的本發(fā)明肽和治療劑的嵌合分子。術(shù)語“綴合的”或“綴合”意指本發(fā)明的肽和一種或多種治療劑通過例如通過共價化學(xué)鍵，物理力例如范德華力(van der Waals)或疏水作用，封裝，包埋或其組合進(jìn)行物理連接。本發(fā)明的肽和一種或多種治療劑可以通過化學(xué)鍵經(jīng)由醇、酸、羰基、硫醇或胺基使用熟知的化學(xué)合成方法進(jìn)行連接(參見例如美國專利申請 NO.US2010/0028370)。治療劑可以通過連接基連接至本發(fā)明的肽。示例性連接基是富含甘氨酸的連接基例如 Gly3SerGly3Ser (SEQ ID NO 28)或 Gly4SerGly4SerGly4Ser (SEQ ID NO: 29)。當(dāng)本發(fā)明的治療劑和肽經(jīng)由共價鍵綴合，或者肽和治療劑為多肽時，則整個綴合物是 “融合蛋白”。因此，術(shù)語“融合蛋白”是指由通常在單個氨基酸序列中不融合在一起的兩種 (或更多種)異源多肽組成的多肽。融合蛋白一般可以使用重組核酸法即由于重組基因融合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行制備，所述融合物包含編碼本發(fā)明多肽的片段和編碼異源多肽的片段。
如本文中所用的術(shù)語“治療劑”是指為了在受試者中引起所需治療效果而施用的分子。受試者是人或非人動物，包括哺乳動物或靈長類動物。示例性治療劑是蛋白質(zhì)、抗體、 肽、小分子或多核苷酸。治療劑還可以是毒素或放射性同位素，其中預(yù)期的治療效果是例如殺死癌細(xì)胞。
本發(fā)明提供結(jié)合IGFlR的分離的多肽、編碼該多肽的多核苷酸、包含該多核苷酸的載體、分離的宿主細(xì)胞、可從該多核苷酸的表達(dá)獲得的多肽、用于表達(dá)本發(fā)明多肽的方法、以及使用本發(fā)明的多核苷酸和多肽的方法。本發(fā)明的多肽與IGFlR結(jié)合，并且在整個內(nèi)皮細(xì)胞上轉(zhuǎn)胞吞。因?yàn)镮FGlR在血腦屏障(BBB)內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，所以本發(fā)明的多肽可以提供用于橫跨BBB遞送治療劑的裝置。
本發(fā)明的一個方面是包含具有SEQ ID NOs :1_13中所示序列的多肽的分離的多肽。
本發(fā)明的多肽可以通過化學(xué)合成產(chǎn)生，例如在自動化肽合成儀上進(jìn)行的固相肽合成。作為另外一種選擇，本發(fā)明的多肽可以通過使用無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)從編碼這些多肽的多核苷酸獲得，無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)為例如基于網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的表達(dá)系統(tǒng)、基于麥胚提取物的表達(dá)系統(tǒng)以及基于大腸桿菌提取物的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的多肽還可以用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)通過從含有本發(fā)明核酸序列的細(xì)胞的表達(dá)和分離來獲得，所述技術(shù)為例如易分離的親和標(biāo)記多肽的重組表達(dá)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到其他用于獲得本發(fā)明多肽的技術(shù)。
本發(fā)明的另一個方面是包含融合至第二多肽的具有SEQ ID NOs : 1_13中所示序列的多肽的分離的融合蛋白。此類第二多肽可以是前導(dǎo)序列或分泌信號序列。此類第二多肽可以是融合至本發(fā)明的肽的治療劑。本發(fā)明的治療劑和肽可以按多種方式彼此融合。本發(fā)明的肽的C末端或N末端可以經(jīng)由酰胺鍵或肽連接基分別直接連接至治療劑的N末端或C 末端。治療劑可以使用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)交聯(lián)連接至本發(fā)明的肽。
本發(fā)明的另一個方面是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的分離的多核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸可以通過化學(xué)合成產(chǎn)生，例如在自動化多核苷酸合成儀上進(jìn)行的固相多核苷酸合成。作為另外一種選擇，本發(fā)明的多核苷酸可以通過其他技術(shù)產(chǎn)生，如基于PCR的復(fù)制、基于載體的復(fù)制或基于限制性酶的DNA操作技術(shù)。產(chǎn)生或獲得具有給定的已知序列的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
本發(fā)明的多核苷酸還可以包含至少一個非編碼序列，例如轉(zhuǎn)錄但不翻譯的序列、 終止信號、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、mRNA穩(wěn)定序列、內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號。多核苷酸序列還可以包含編碼附加氨基酸的附加序列。這些附加的多核苷酸序列可以(例如)編碼標(biāo)記或標(biāo)簽序列(例如六組氨酸肽)(Gentz 等人,Proc. Natl. Acad. Sc1. (USA)86 :821-284, 1989 (Gentz等人，《美國國家科學(xué)院院刊》86 =821-284,1989年))，或促進(jìn)融合多肽的純化的 HA 肽標(biāo)簽(Wilson 等人，Cell 37 :767_778，1984 (Wilson 等人，《細(xì)胞》37 :767-778,1984 年))。示例性多核苷酸是具有SEQ ID NOs 14-26中所示序列的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個實(shí)施例是包含具有SEQ ID NOs :14_26中所示序列的分離的多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體可用于保持多核苷酸、復(fù)制多核苷酸或驅(qū)使由本發(fā)明載體編碼的多肽在生物系統(tǒng)(包括再造生物系統(tǒng))中的表達(dá)。載體可以為染色體載體、附加型載體和病毒衍生載體，例如衍生自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體兀件、桿狀病毒、乳多空病毒(例如SV40)、牛痘病毒、腺病毒、雞痘病毒、偽狂犬病病毒、小核糖核酸病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的載體，以及衍生自它們的組合的載體，例如粘粒和噬菌粒。
可以用佐劑、脂質(zhì)、緩沖劑或其他適用于具體應(yīng)用的賦形劑將本發(fā)明的載體配制在微粒中。
在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，載體是表達(dá)載體。表達(dá)載體通常包含可控制、調(diào)節(jié)、引起或允許由這種載體編碼的多肽的表達(dá)的核酸序列元件。此類元件可包含轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子結(jié)合位點(diǎn)、RNA聚合酶起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及有利于被編碼多肽在給定表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)的其他位點(diǎn)。此類表達(dá)系統(tǒng)可以是本領(lǐng)域熟知的基于細(xì)胞的系統(tǒng)或無細(xì)胞系統(tǒng)。適用于所編碼多肽的表達(dá)的核酸序列元件和親本載體序列也是熟知的。用于 表達(dá)本發(fā)明多肽的示例性質(zhì)粒衍生的表達(dá)載體包含大腸桿菌(E. coli)復(fù)制起點(diǎn)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因、噬菌體T7啟動子、pelB信號序列和T7終止序列。
本發(fā)明的另一個實(shí)施例是包含本發(fā)明載體的分離的宿主細(xì)胞。代表性的宿主細(xì)胞例子包括古細(xì)菌細(xì)胞；細(xì)菌細(xì)胞例如鏈球菌屬(Streptococci)、葡萄球菌屬 (Staphylococci)、腸球菌屬(Enterococci)、大腸桿菌、鏈霉菌屬(Streptomyces)、藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)、枯草芽抱桿菌(B. subtilis)和金黃色葡萄球菌(S. aureus)； 真菌細(xì)胞，例如克魯維酵母屬(Kluveromyces)、酵母菌屬(Saccharomyces)、擔(dān)子菌屬 (Basidomycete)、白色念珠菌(Candida albicans)或曲霉屬(Aspergillus);昆蟲細(xì)胞例如果蠅屬(Drosophila) S2 和夜蛾屬(Spodoptera) Sf9 ;動物細(xì)胞，例如 CHO、COS、HeLa, C127、3T3、BHK、293、CV-U Bowes黑素瘤和骨髓瘤；以及植物細(xì)胞，例如裸子植物細(xì)胞或被子植物細(xì)胞。本發(fā)明方法中的宿主細(xì)胞可以單個細(xì)胞或細(xì)胞群體的形式提供。細(xì)胞群體可以包括分離的或培養(yǎng)的細(xì)胞群體或存在于基質(zhì)(例如組織)中的細(xì)胞群體。
多核苷酸例如載體至宿主細(xì)胞中的引入可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法實(shí)現(xiàn)(Davis 等人，Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed. , Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994 (Davis等人，《分子生物學(xué)中的基本方法》，第2版，阿普爾頓和蘭格出版社，諾瓦克市，康奈提格州，1994 年);Sambrook 等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual,3rd ed. , ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001 (Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》，第3版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，2001年))。這些方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、顯微注射、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、刮擦荷載(scrapeloading)、基因槍法導(dǎo)入(ballistic introduction)和感染。
為了諸如增強(qiáng)底物特異性、穩(wěn)定性、可溶性等的此類目的修飾本發(fā)明多肽或片段的結(jié)構(gòu)是可能的。例如，可以產(chǎn)生修飾的多肽，其中氨基酸序列已例如通過氨基酸置換、缺失或加成得以改變?？紤]亮氨酸由異亮氨酸或纈氨酸，天冬氨酸由谷氨酸，蘇氨酸由絲氨酸的分開置換，或氨基酸由結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸的相似置換(即保守突變)，在一些情況下但并非所有情況下對所得到的分子的生物學(xué)活性不具有主要作用。保守置換是在其側(cè)鏈中相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的那些。遺傳編碼的氨基酸可以分成四個家族(I)酸性的(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)堿性的(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)；(3)非極性的(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；和(4)不帶電的極性的(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時被共同分類為芳族氨基酸。作為另外一種選擇，氨基酸儲庫可以分組為(I)酸性的(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)堿性的(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)；(3)脂族的(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸)，其中絲氨酸和蘇氨酸任選地獨(dú)立地分組為脂族的-羥基；(4)芳族的(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；(5)酰胺(天冬酰胺、谷氨酰胺)；和(6)含硫的(半胱氨酸和甲硫氨酸)(Stryer (編輯)，Biochemistry, 2nd ed,WH Freeman and Co.， 1981(《生物化學(xué)》，第2版，W. H.弗里曼公司，1981年))。可以使用本文描述的測定通過評估修飾的多肽或片段以類似于未經(jīng)修飾的多肽或片段的方式產(chǎn)生應(yīng)答的能力，容易地測定多肽或其片段的氨基酸序列中的變化是否導(dǎo)致功能同系物。其中已發(fā)生超過一個置換的肽、多肽或蛋白質(zhì)可以容易地以相同方式進(jìn)行測試。
本發(fā)明的多肽還可配制在配藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中。可以使用多種含水載體，如O. 4%鹽水、O. 3%甘氨酸等。這些溶液是無菌的，通常不含顆粒物質(zhì)。這些溶液可以通過常規(guī)的、熟知的消毒技術(shù)(例如過濾)進(jìn)行滅菌。組合物可以包含模擬生理?xiàng)l件所需的 配藥學(xué)上可接受的輔助性物質(zhì)，例如PH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑。本發(fā)明的多肽在這種藥物制劑中的濃度可以差別很大，即從小于約O. 5重量％ (通常為約I重量％或至少約I重量％ ) 至高達(dá)15重量％或20重量％，并且根據(jù)所選的具體施用方式基于流體體積、粘度和其他因素進(jìn)行選擇。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地確定適當(dāng)?shù)闹委熡行┝?。如果必要的話?確定的劑量可以在治療期過程中以通過醫(yī)生或相關(guān)領(lǐng)域的其他技術(shù)人員(例如護(hù)士、獸醫(yī)或獸醫(yī)技術(shù)員)適當(dāng)?shù)剡x擇的合適時間間隔進(jìn)行重復(fù)。
本發(fā)明的多肽可以凍干用于儲存且在使用之前在合適的載體中再造。已證實(shí)該技術(shù)對常規(guī)的蛋白質(zhì)制備物是有效的。凍干和再造技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的。
本發(fā)明的另一個實(shí)施例是用于表達(dá)多肽的方法，所述方法包括以下步驟提供本發(fā)明的宿主細(xì)胞；在足以表達(dá)本發(fā)明的至少一種多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
宿主細(xì)胞可以在任何適合保持或增殖給定類型的宿主細(xì)胞并足以表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)。足以表達(dá)多肽的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基和相關(guān)方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，許多哺乳類細(xì)胞類型可以在37°C下用適當(dāng)緩沖的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行有氧培養(yǎng)，而細(xì)菌、酵母和其他細(xì)胞類型可以在37°C和適當(dāng)?shù)拇髿鈼l件下于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
在本發(fā)明的方法中，可以使用多種熟知方法確認(rèn)多肽的表達(dá)。例如，多肽的表達(dá)可以使用檢測試劑例如抗體使用例如FACS或免疫熒光技術(shù)或使用SDS-PAGE或HPLC得到確認(rèn)。
本發(fā)明的另一個方面是用于在整個內(nèi)皮細(xì)胞上遞送治療劑的方法，其包括
a.使所述治療劑與包含具有SEQ ID NOs :1、2、4、8或12中所示序列的多肽的多肽綴合以形成綴合物；
b.使所述綴合物與所述內(nèi)皮細(xì)胞接觸；以及
c.測量在整個所述內(nèi)皮細(xì)胞上遞送的綴合物的量。
通過本發(fā)明的多肽與IGFlR的結(jié)合，本發(fā)明的多肽促進(jìn)治療劑在整個內(nèi)皮細(xì)胞上的遞送。肽被選擇成使得綴合的治療劑不干擾本發(fā)明的多肽與IGFlR的結(jié)合。本發(fā)明描述了具有約IOOkD分子量的蛋白質(zhì)(921個氨基酸)與本發(fā)明的多肽的綴合，而不喪失轉(zhuǎn)胞吞作用活性。具有可比較大小的其他多肽還可能成功地與本發(fā)明的多肽綴合且在整個內(nèi)皮細(xì)胞上遞送至腦。
綴合物在整個內(nèi)皮細(xì)胞上的遞送可以使用熟知的體外或體內(nèi)方法進(jìn)行測量。示例性體外測量可以使用極化單層內(nèi)皮細(xì)胞且使用例如針對該綴合物的抗體測量該綴合物的轉(zhuǎn)胞吞作用來完成。體內(nèi)測量可以在受試者中使用例如反應(yīng)活性的綴合物且測量其在施用后在腦中的分布來完成。在體外和體內(nèi)方法之間已觀察到良好相關(guān)性。例如，Perrier等人使用星形細(xì)胞和大鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)物，證實(shí)在一系列化合物的滲透系數(shù)及其相應(yīng)的體內(nèi)嚙齒類血腦轉(zhuǎn)移系數(shù)之間的良好相關(guān)性(R = O. 94) (Perrier等人，Bra in Res. 1150 1-13, 2007 (Perrier 等人，《腦研究》1150 :1-13,2007 年))。
本發(fā)明現(xiàn)結(jié)合以下具體的非限制性實(shí)例進(jìn)行描述。
實(shí)例I
IGFlR結(jié)合肽的鑒定
嗤菌體淘選
根據(jù)美國專利申請No. US2010/0021477中所述的方法生成展示隨機(jī)肽的pIX噬菌體文庫，并且用作人IGFlR結(jié)合肽的來源。這個文庫在溶液中針對具有羧基末端六組氨酸標(biāo)簽的生物素?；问降募兓目扇苄訧GFlR(sIGFlR)(明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯市的安迪生物技術(shù)公司(R&D Systems,Minneapolis,MN))淘選三個回合。使用EZ-Link No-Weigh Sulfo-NHS-LC-Biotin Microtubes (依利諾斯州洛克福特市的皮亞斯公司(Pierce, Rockford, IL))完成sIGFIR的生物素?；Ｒ?yàn)閟IGFIR的大尺寸( 330kDa)，Tetralink 抗生物素蛋白珠由于其比Dynal磁珠大 10倍的結(jié)合能力而用于第I輪選擇。
就在固相噬菌體ELISA中針對sIGFIR的結(jié)合特異性測試來自淘選的總共384種個別噬菌體裂解物。簡而言之，使100 μ I/孔的5 μ g/ml SIGF1R(明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯市的安迪生物技術(shù)公司)與Black Maxisorp Plates (紐約州羅徹斯特市的能肯公司 (Nunc, Rochester, NY))結(jié)合，加入25 μ I噬菌體裂解物，并且使用抗M13-HRP抗體(新澤西州吉布斯敦市的 EMDBiosciences 公司(EMD Biosciences, Gibbstown, NJ))和 POD 底物 (印地安那州印第安納波利斯市的羅氏公司(Roche, Indianapolis, IN))檢測反應(yīng),并且使用TEKAN讀板機(jī)(plate reader)檢測信號。經(jīng)證實(shí)不橫跨BBB的無關(guān)蛋白質(zhì)用作陰性對照。陽性裂解物被定義為具有sIGFIR特異性信號的克隆，所述sIGFIR特異性信號超過陰性對照的本底三倍。獲得已證實(shí)與sIGFIR的結(jié)合的具有獨(dú)特肽序列的總共13個克隆(表I)。在這13個克隆中，3個(克隆5、13和16)與胰島素受體交叉反應(yīng)。
將來自克隆5-14、16和17的肽作為肽-堿性磷酸酶_His6 (肽-AP)融合蛋白在框內(nèi)克隆到修飾的pET20b+載體內(nèi)，所述pET20b+載體具有在其內(nèi)克隆的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 (CAT)基因。根據(jù)制造商的說明書，使用N1-NTA(新澤西州吉布斯敦市的EMD Biosciences 公司)在細(xì)菌中表達(dá)且純化所得肽-AP融合物。使用的堿性磷酸酶的氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO 30 中。
表Ia :鑒定的IGFlR結(jié)合肽的多肽序列
肽序列克隆編號肽 SEQ ID NO TGCDFPELCRGCHP5IAECEffPffLTLELCQS62PFCYSGGPLPYPCTY73PVCP SFCYDQYVCPT84FTCAVY SLSELDCRD95LSCYDPTLRTLYCHV106HTCFYPTLMPPELCFD117SNCPPLDMRLTELCVM128 WHCTPLTQIADPGSIIHLECTV139VECDTPSITFSPGLEALFWNTCSP1410MTCAffHTLHTDPGLTPQLTLPCIY1511AGCPSPMPPVDPGFYSAIVQLCRE1612DDIDEFLHQLHNLVNNVH1713
使用ELISA針對固定的sIGFIR對純化的肽-AP融合蛋白與sIGFIR的結(jié)合進(jìn)行評價。簡而言之，使由每種肽-AP融合物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌生長過夜，并且第二天通過4°C 下以4，500rpm離心使培養(yǎng)物澄清。收集上清液并且測定75 μ I每種上清液與固定在ELISA 板上的2 μ g/ml sIGFIR的結(jié)合。遵循制造商的建議，使用Attophos底物(印地安那州印第安納波利斯市的羅氏公司)檢測結(jié)合的肽，并且使用Molecular Devices M5讀板機(jī)進(jìn)行讀數(shù)。具有肽克隆7和10的融合物并未良好表達(dá)。所有其他肽-AP融合物都顯示與sIGFIR 的結(jié)合活性(圖2)。
表Ib =IGFlR結(jié)合肽的多核苷酸序列
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，包含具有SEQ ID NOs: 1-13中所示序列的多肽。
2.—種包含編碼多肽的多核苷酸的分離的多核苷酸，所述多肽包含SEQ ID NOs: 1-13中所示的氨基酸序列。
3.一種分離的多核苷酸，包含具有SEQ ID NOs: 14-26中所示序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。
4.一種分離的載體,包含具有SEQ ID NOs: 14-26中所不序列的多核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其中所述載體是表達(dá)載體。
6.—種分離的宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求4所述的載體。
7.一種分離的融合蛋白，包含融合至第二多肽的具有SEQ ID NOs: 1_13中所示序列的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的融合蛋白，其中所述第二多肽編碼免疫球蛋白或其片段。
9.一種表達(dá)多肽的方法，包括以下步驟a.提供權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞；以及b.在足以表達(dá)具有SEQID NOs: 1_13中所示序列的多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
10.一種用于在整個內(nèi)皮細(xì)胞上遞送治療劑的方法，包括a.使所述治療劑與包含具有SEQID NOs: 1、2、4、8或12中所示序列的多肽的多肽綴合以形成綴合物；b.使所述綴合物與所述內(nèi)皮細(xì)胞接觸；以及c.測量在整個所述內(nèi)皮細(xì)胞上遞送的綴合物的量。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞形成血腦屏障。
全文摘要
本發(fā)明公開了胰島素樣生長因子1受體結(jié)合多肽，和編碼該多肽的多核苷酸。還公開了使用細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和無細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生多肽的方法，和使用多肽用于融合蛋白生產(chǎn)的方法。本發(fā)明所公開的多肽能夠提供用于在整個血腦屏障(BBB)上遞送治療劑的裝置。
文檔編號C12P21/04GK103025341SQ201180025866
公開日2013年4月3日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者M.迪姆, K.T.奧奈爾 申請人:詹森生物科技公司