專利名稱：一種禽用融合型口服干擾素的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體地說是一種禽用融合型干擾素的制備其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，對(duì)我國(guó)禽類養(yǎng)殖業(yè)危害最大、也最難控制的一類疾病是傳染性的病毒性疾病。針對(duì)于禽類該類疾病，一直沒有有效的治療方法和手段，其中疫苗接種是當(dāng)前防止禽類病毒性疾病暴發(fā)和流行的主要措施和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但隨著疫苗預(yù)防失敗或接種不及時(shí)，一些病毒性疾病在禽類養(yǎng)殖中的時(shí)常爆發(fā)，傳染性和死亡率極高，有些可達(dá)100%。一旦爆發(fā)病毒性疾病時(shí)，干擾素等生物制劑是目前市場(chǎng)上治療的首選藥物。但當(dāng)前市場(chǎng)應(yīng)用的干擾素以單價(jià)型為主，并多屬于注射型，其使用起來操作繁瑣、成本高、費(fèi)工費(fèi)時(shí)，效果不太理想。并且，當(dāng)前禽類干擾素的生產(chǎn)主要以原核表達(dá)系統(tǒng)為主，也有利用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)存在不能進(jìn)行蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾功能，且表達(dá)產(chǎn)物多是不溶性的胞內(nèi)包涵 體，產(chǎn)量低，需要復(fù)雜的加工純化等過程；真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)存在著成本昂貴、條件要求苛亥IJ、蛋白質(zhì)產(chǎn)物易受到污染、且純化困難和難以規(guī)?；热秉c(diǎn)，均限制了二者系統(tǒng)的應(yīng)用。因此，尋找新的生物反應(yīng)器生產(chǎn)多價(jià)復(fù)合型的干擾素成為目前干擾素的主要研發(fā)方向。鹽藻{J)unediella salina)是生活在咸水中的一種單細(xì)胞真核藻類,其自身具有許多其它反應(yīng)器無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如1)鹽藻本身營(yíng)養(yǎng)豐富，富含￠-胡蘿卜素、維生素和蛋白質(zhì)等成份，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)用價(jià)值；2)鹽藻屬于光能自養(yǎng)型生物，可直接采用開放式大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)成本廉價(jià)，生產(chǎn)費(fèi)用低；3)鹽藻本身無毒無害，是一種天然的保健品，可以提高機(jī)體免疫力和抵抗力；4)鹽藻是一種天然的原生質(zhì)體，對(duì)其進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作簡(jiǎn)單；5)鹽藻培養(yǎng)安全可靠，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。6)鹽藻屬于真核生物，具有轉(zhuǎn)錄和翻譯后對(duì)蛋白的加工能力，能產(chǎn)生近天然的高活性蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于目前禽用干擾素的生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種禽用融合型口服干擾素的制備方法，所制備的融合型口服干擾素能夠抗病毒治療疾病，提高機(jī)體的免疫力、改善禽類機(jī)體肉質(zhì)品質(zhì)。該產(chǎn)品的研制成功對(duì)禽類病毒性疾病的預(yù)防和治療都具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義，存在巨大的經(jīng)濟(jì)效益和商業(yè)價(jià)值。一種禽用融合型口服干擾素的制備及其應(yīng)用，其具體步驟如下
步驟一、禽a、Y干擾素基因的制備對(duì)全球公共序列數(shù)據(jù)庫GenBank已登錄的雞、鴨和鵝三種動(dòng)物的a、Y干擾素基因分別進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)合鹽藻細(xì)胞基因組密碼子的偏愛性，對(duì)三種動(dòng)物二者基因的堿基序列進(jìn)行改造修飾，人工合成了三種禽類通用的a干擾素序列(序列表序列I)、Y干擾素序列(序列表序列2)。依據(jù)基因序列，分別設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR的方法擴(kuò)增禽a、y干擾素基因；
步驟二、轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞真核表達(dá)載體構(gòu)建通過PCR擴(kuò)增的禽a、y干擾素基因片段分別與PMD18-T克隆載體連接，通過各自的雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定后分別切下a、Y基因片段，通過T4連接酶先后將二者基因連接到真核表達(dá)載體pBI-上；將構(gòu)建好的重組載體pBI-a + y用于對(duì)鹽藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；
步驟三、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過高效的玻璃珠轉(zhuǎn)化法，或通過現(xiàn)有的基因槍法、電擊法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法或超聲波導(dǎo)入法轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的鹽藻細(xì)胞經(jīng)選擇培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，最終獲得陽性轉(zhuǎn)化株。挑取陽性藻落分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，供后續(xù)分子生物學(xué)鑒定所用；
步驟四、對(duì)轉(zhuǎn)化藻株的篩選與分子生物學(xué)鑒定提取轉(zhuǎn)基因藻株的基因組總RNAjf-合到鹽藻基因組中的目的基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增鑒定，以期查明目的基因整合與表達(dá)狀態(tài)。同時(shí)，利用western blot技術(shù)對(duì)表達(dá)得蛋白產(chǎn)物進(jìn)行生化活性分析；
步驟五、融合型口服干擾素的制備將鑒定正確的轉(zhuǎn)基因藻株按1%的接種量接種于天然海水藻類養(yǎng)殖池，進(jìn)行開放式的規(guī)?；B(yǎng)殖。培養(yǎng)約10-14天，當(dāng)藻細(xì)胞濃度達(dá)到10 6個(gè) /ml時(shí)，通過靜止沉淀或離心收集藻體，即得到融合型口服干擾素，可根據(jù)不同的用途進(jìn)行下一步步驟六或步驟七工藝；
步驟六、在預(yù)防或治療禽類病毒性疾病中的應(yīng)用為達(dá)到此用途，可采用以下技術(shù)方案低溫條件下采用超聲波粉碎，裂解的鹽藻體按占雞飲水體積的5%的比例加入，現(xiàn)配現(xiàn)用，控制在0. 5-2h內(nèi)飲完；
步驟七、作為一種功能性飼料添加劑在禽類養(yǎng)殖業(yè)和飼料加工業(yè)中的應(yīng)用為達(dá)到此用途，可采用以下技術(shù)方案將該轉(zhuǎn)基因藻株直接或經(jīng)過濃縮、低溫干燥、制粒、粉碎或與其它營(yíng)養(yǎng)成分混合等加工后，添加到禽類動(dòng)物養(yǎng)殖飼料中。添加量為1_7%，添加形態(tài)可以為粉齊U、顆粒劑等固體形式、也可以是糊劑、丸劑等半固體形式，也可以是液體形式。有益效果
I、本發(fā)明所制備的干擾素為融合型的二價(jià)干擾素，是利用禽類保守性較強(qiáng)的干擾素a、Y基因序列為基礎(chǔ)，a基因具有強(qiáng)的抗病毒作用，能夠起到治療病毒性疾病的目的；Y基因能夠調(diào)節(jié)機(jī)體體質(zhì)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，將二者基因進(jìn)行融合表達(dá)a+ Y，能夠起到上述二者作用的協(xié)同效果，治療作用更佳。2、本發(fā)明克服了當(dāng)前干擾素生產(chǎn)系統(tǒng)存在的不足，利用了集多種優(yōu)點(diǎn)為一身的鹽藻細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)。將干擾素a + Y基因轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞制備得到轉(zhuǎn)基因藻株。該轉(zhuǎn)基因藻株不需要誘導(dǎo)、分離和提純等復(fù)雜的加工過程，可直接作為活性干擾素制劑投喂家禽，操作過程簡(jiǎn)便，省時(shí)省力。同時(shí)，鹽藻自身的優(yōu)點(diǎn)也得以利用，能夠起到“一株多用”的效果，即能夠起到抗病毒、提高機(jī)體免疫力外,還能夠加快機(jī)體的生長(zhǎng)速度、改善肉質(zhì)品質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的綠色抗病毒制劑。3、本發(fā)明所制備的干擾素制劑能夠采用天然開放式工廠化養(yǎng)殖，其不僅產(chǎn)量高、成本低廉，而且不易受外界微生物的污染，生物安全性好。4、本發(fā)明巧妙利用了鹽藻、家禽、干擾素三者之間存在的密切聯(lián)系干擾素具有較強(qiáng)的抗病毒作用，病毒能夠感染家禽，家禽又能以鹽藻作為飼料組分，而鹽藻又是一個(gè)理想的綠色表達(dá)系統(tǒng)。為此，通過轉(zhuǎn)基因手段制備的工程藻株無需提純加工便可通過口服方式直接投喂，方便快捷，避免了注射等方式的不利影響。這種天然綠色的活性干擾素制劑直接通過口服給藥方式進(jìn)行，在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。5、本發(fā)明制備的干擾素制劑不僅能作為禽用抗病毒藥物得以應(yīng)用，而且又可作為一種多功能的飼料添加劑在禽類養(yǎng)殖業(yè)和飼料加工業(yè)中得以應(yīng)用，且該添加劑具有無任何毒副殘留、無抗藥性、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。


圖I為禽a基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠檢測(cè)電泳 圖中左側(cè)為分子量2000 Marker，右側(cè)為PCR產(chǎn)物樣品
圖2為禽Y基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠檢測(cè)電泳 圖中M為分子量2000 Marker ；B為空白對(duì)照；P為兩個(gè)重復(fù)的PCR產(chǎn)物樣品；
圖3為pBI-a重組質(zhì)粒的取BernH雙酶切瓊脂糖凝膠檢測(cè)電泳 圖中左側(cè)為pBI-a重組質(zhì)粒雙酶切后DNA片段，右側(cè)為Marker ；
圖4為pBI-a + Y重組質(zhì)粒的及 "和fee雙酶切瓊脂糖凝膠檢測(cè)電泳 圖中左側(cè)為pBI-a + Y重組質(zhì)粒雙酶切后DNA片段，右側(cè)為Marker ；
圖5為轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞的真核表達(dá)載體pBI-a +Y結(jié)構(gòu)示意圖 圖6為轉(zhuǎn)基因藻株的固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)結(jié)果 圖中左側(cè)平皿為陰性對(duì)照組，即野生型鹽藻細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，無單藻落出現(xiàn)；右側(cè)平皿為轉(zhuǎn)化藻株的生長(zhǎng)情況，可見有多個(gè)單藻落的生長(zhǎng)；
圖7為對(duì)陽性轉(zhuǎn)化株進(jìn)行a基因的PCR擴(kuò)增鑒定 圖中M為分子量2000 Marker ;W為陰性對(duì)照，即野生型的鹽藻株；T1、T2分別為兩株陽性轉(zhuǎn)化株；
圖8為對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析結(jié)果 圖中左側(cè)為蛋白Marker，右側(cè)為融合的干擾素蛋白條帶。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用的基因工程基本操作技術(shù)按科學(xué)出版2005年出版的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第四版)》中提供的方法進(jìn)行，或按照所購買試劑、產(chǎn)品的使用說明書進(jìn)行操作。本發(fā)明實(shí)施例涉及以下材料
PMD18-T克隆載體、pBI-真核表達(dá)載體購買于大連寶生物有限公司；大腸桿菌感受態(tài)購買于大連寶生物有限公司；限制性內(nèi)切酶油a、BamH、Sac購自大連寶生物有限公司；T4 DNA連接酶購自大連寶生物有限公司；Trizol試劑購買于美國(guó)Invitrogen公司；PCR清潔試劑盒和膠回收試劑盒購自美國(guó)Axygene公司；特異性引物的合成由上海生工生物有限公司合成；
一種禽用融合型口服干擾素的制備及其應(yīng)用，其具體步驟如下
步驟一、禽a、Y干擾素基因的擴(kuò)增
I)禽a干擾素基因的制備
對(duì)全球公共序列數(shù)據(jù)庫GenBank已登錄的雞、鴨和鵝的a干擾素基因(登錄號(hào)分別為DQ226092、EF053034和AY524422)進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)合鹽藻表達(dá)系統(tǒng)基因組的密碼子偏愛性，對(duì)三種動(dòng)物的基因序列進(jìn)行改造修飾，將出現(xiàn)頻率較高的氨基酸分配到相應(yīng)的位置，避免終止和非編碼堿基組合的出現(xiàn)，人工合成了三種動(dòng)物通用的啟動(dòng)子為ATG，終止子為TAA的a干擾素序列(序列表序列1)，依據(jù)此序列設(shè)計(jì)出一對(duì)引物，上游引物5，TCTAGAATGGCTGGGCCATCAGCCCC3，，下游引物5 ’ GGATCCCGTGTTGGTGCGGGT 3 ’，下劃線所指為上下游引物分別引入的油a酶切位點(diǎn)。然后采用以下反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增
94°C預(yù)變性 5min，30 個(gè)循環(huán)(94°C變性 40S，53°C退火 40S，72°C延伸 70S)，72°C延伸 IOmin后終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示出大小約600bp的基因片段(結(jié)果如圖I所示)；
2)禽Y干擾素基因的制備
對(duì)全球公共序列數(shù)據(jù)庫已GenBank登錄的雞、鴨和鵝的、干擾素基因(登錄號(hào)分別為AY163160、AY166850和AY524421)進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)合鹽藻表達(dá)系統(tǒng)基因組的密碼子 偏愛性，將出現(xiàn)頻率較高的氨基酸分配到相應(yīng)的位置，人工合成了三種動(dòng)物通用的啟動(dòng)子為ATG，終止子為TAA的Y干擾素序列(序列表序列2)，依據(jù)此序列設(shè)計(jì)出一對(duì)引物，上游引物5 ’ GGATCCACTTGCACTACCCAGACTTAC3，，下游引物5 ’ GAGCTCTTACGTGTTGGTGCGGGTGA3’，下劃線所指為上下游引物分別引入的和fee酶切位點(diǎn)。然后采用以下條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增:94°C預(yù)變 4 min，28 個(gè)循環(huán)(94°C變性 45 S，56°C退火 50S，72°C延伸 100S),72°C延伸IOmin后終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示出大小約500bp的基因片段(結(jié)果如圖2所示)。步驟二、PCR產(chǎn)物的克隆及鑒定 I)干擾素a、y基因片段的克隆
在PCR產(chǎn)物連接pMD18-T克隆載體之前，先進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化回收。采用PCR清潔試劑盒進(jìn)行分別回收a、Y基因片段，按照所附說明書進(jìn)行操作。將回收得到a片段基因片段采用限制性內(nèi)切酶油a和及_7進(jìn)行雙酶切，Y基因片段采用限制性內(nèi)切酶及_7和Sac進(jìn)行雙酶切，然后分別與經(jīng)過相同雙酶切的PMD18-T克隆載體連接，連接體系如下2U I 10倍T4 DNA連接酶緩沖液，I u I pMD18-T載體，7 a或Y基因片段，I u I T4DNA連接酶，補(bǔ)充ddH20至總體積20 U I，然后連接反應(yīng)體系于16°C水浴放置過夜。
2)重組pMD18-T- a (或Y )克隆載體的酶切及測(cè)序鑒定
采用CaCl2熱激法將克隆載體pMD18-T_a (或Y )轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)，采用藍(lán)白斑篩選，37°C過夜培養(yǎng)。然后挑取陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切鑒定(重組質(zhì)粒PMD18-T- a采用限制性內(nèi)切酶^BamH進(jìn)行雙酶切，重組質(zhì)粒PMD18-T-Y使用限制性內(nèi)切酶及麗7和5^進(jìn)行雙酶切)，檢測(cè)能否切出預(yù)期的基因片段。然后選取酶切鑒定正確的陽性克隆寄送上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。步驟三、轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞pBI-a + Y真核表達(dá)載體的構(gòu)建
將酶切和測(cè)序鑒定均正確的重組載體PMD18-T- a (或Y )分別進(jìn)行雙酶切(重組質(zhì)粒PMD18-T- a采用限制性內(nèi)切酶油a取BamH進(jìn)行雙酶切，重組質(zhì)粒pMD18_T_ y限制性內(nèi)切舊BamH和fee進(jìn)行雙酶切)，然后采用Axygene公司膠回收試劑盒回收干擾素a、y基因片段，按照其所附說明書進(jìn)行操作；先將真核載體PBI-進(jìn)行限制性內(nèi)切酶取BamH雙酶切，酶切體系為1. 5 ill Xba酶，I. 5 ill及_7酶，7111 pBI-載體，2yl buffer，補(bǔ)加水至總體積20 ii 1，于37°C水浴酶切過夜，然后通過膠回收試劑盒回收載體片段。將回收的a基因片段和載體片段PBI-連接。連接體系為2 ill 81-載體，10111 a基因片段，2 ill10倍T4 DNA連接酶緩沖液，T4 DNA連接酶I. 5 y 1，補(bǔ)加水至總體積20 U 1，然后于16°C水浴連接過夜；
次日采用CaCl2熱激法分別將該連接體系轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)，采用藍(lán)白斑篩選，挑取陽性菌落培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒的提取。提取質(zhì)粒采用限制性內(nèi)切酶取BamH進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系和條件同上，結(jié)果如圖3所示，切出了約600bp的片段。鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行及 "和雙酶切，酶切體系為1. 5 ii I fee酶，I. 5 ill BamH酶，7 ii I pBI-a載體，2iil 10倍限制性內(nèi)切酶buffer，補(bǔ)加水至總體積20iU，于37°C水浴酶切過夜，然后通過膠回收試劑盒回收載體片段。將回收的載體片段與Y基因片段連接，連接體系和條件同a基因片段的連接，然后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶和fee雙酶切鑒定(圖4所示)，最終成功構(gòu)建pBI-a + Y真核表達(dá)載體，該載體的結(jié)構(gòu)如圖5所示。步驟四、鹽藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化株的篩選培養(yǎng)
采用玻璃珠轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pBI-a+ Y轉(zhuǎn)化藻細(xì)胞，主要操作步驟如下收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鹽藻細(xì)胞800 W，細(xì)胞濃度為IO6個(gè)細(xì)胞/ml，然后加入150 W 20%聚乙二醇和90耵重組質(zhì)粒(濃度為0.55吒/耵)，在300 mg玻璃珠存在的條件下，于轉(zhuǎn)速2400 rpm渦旋12 S，完成轉(zhuǎn)化過程。待玻璃珠完全沉降后，將轉(zhuǎn)化體系用PKS培養(yǎng)基暗培養(yǎng)12h，然后正常光照培養(yǎng)3天(光暗比為12:12)。采用2000rpm離心5min收集鹽藻細(xì)胞，將細(xì)胞涂布固體選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，直至可見單藻落的出現(xiàn)(如圖6所示)。同時(shí)，轉(zhuǎn)化過程中設(shè)有陰性對(duì)照組，即不加入重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化操作組，該組的實(shí)驗(yàn)操作過程相同。步驟五、表達(dá)a + Y融合干擾素轉(zhuǎn)化藻株的分子生物學(xué)鑒定
首先從篩選的固體培養(yǎng)板中挑取陽性單藻落，接種5ml PKS液體培養(yǎng)基試管培養(yǎng)7天。然后按10%的接種量接種三角燒瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞濃度達(dá)到IO5個(gè)/ml時(shí)，離心收集鹽藻體。利用Trizol試劑，按照其所附說明書進(jìn)行操作，提取轉(zhuǎn)化后鹽藻的總RNA，采用RT-PCR的方法進(jìn)行a基因的擴(kuò)增，以查明目的基因的整合與表達(dá)情況。將PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，能夠得到特異性較強(qiáng)、大小符合預(yù)期的基因片段(如圖7所示)。結(jié)果說明目的基因整合到了鹽藻的基因組中，并且得到了有效的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。同時(shí)，利用Westernblot對(duì)融合的目的蛋白進(jìn)行生物活性分析。結(jié)果顯示，在分子量為40KD處顯示出特異的條帶，說明表達(dá)的a + Y融合干擾素保持其天然的生物學(xué)功能(如圖8所示)。步驟六、轉(zhuǎn)基因藻株作為抗病毒藥物在禽類病毒性疾病預(yù)防和治療中的應(yīng)用
I)以裂解的轉(zhuǎn)基因鹽藻體通過飲水方式作用于雞體，進(jìn)行抗病毒的預(yù)防保護(hù)實(shí)驗(yàn)
分別對(duì)轉(zhuǎn)基因鹽藻和未轉(zhuǎn)化的野生鹽藻細(xì)胞進(jìn)行離心收集，低溫條件下采用超聲波粉碎，參數(shù)為400W，破碎IOS間隔3S，共破碎20次。裂解的鹽藻體按占雞飲水體積的5%的比例加入，現(xiàn)配現(xiàn)用，最好控制在0. 5-2h內(nèi)飲完。在正常飼喂條件下給予全天多次飲水，連續(xù)應(yīng)用3天。選擇15日齡健康的SPF雞，隨機(jī)分成三組，每組20只，每組設(shè)三組重復(fù)。A組空白對(duì)照組，在雞養(yǎng)殖過程中，給予正常的一般飲用水，沒有加入鹽藻細(xì)胞組陰性對(duì)照組，在雞的養(yǎng)殖過程中，給予含5%野生型鹽藻體的飲用水；(組，治療比較組，在雞的養(yǎng)殖過程中，給予含5%轉(zhuǎn)基因鹽藻體的飲用水。所用組別在連續(xù)3天多次飲水的基礎(chǔ)上，第4天開始，三組動(dòng)物統(tǒng)一投喂含傳染性法氏囊病料，飲水方式如上述進(jìn)行，連續(xù)飲用7天，每天記錄每組雞發(fā)病情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如表I所示)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組雞的發(fā)病率達(dá)到100%，二者的累計(jì)死亡率分別是56. 5%和53. 5%，而治療組雞沒有發(fā)病和死亡，表明轉(zhuǎn)基因鹽藻株通過飲水方式作用雞體，對(duì)其進(jìn)行預(yù)防病毒性疾病的有效保護(hù)率達(dá)到100%。治療組保護(hù)率的計(jì)算方法保護(hù)率=(I-治療組死亡數(shù)/治療組動(dòng)物總數(shù))*100% 空白對(duì)照組死亡率的計(jì)算方法死亡率=(空白對(duì)照組死亡數(shù)/空白對(duì)照組動(dòng)物總數(shù))
*100%
陰性對(duì)照組雞死亡率的計(jì)算方法死亡率=(陰性對(duì)照組死亡數(shù)/陰性對(duì)照組動(dòng)物總數(shù))*100%
權(quán)利要求
1.一種禽用融合型口服干擾素的制備，其特征在于其具體制備步驟如下 1)禽α、Y干擾素基因的制備分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物禽α干擾素基因引物序列為上游引物5 ’ TCTAGAATGGCTGGGCCATCAGCCCC3，，下游引物5 ’ GGATCCCGTGTTGGTGCGGGT3’，下劃線所指為上下游引物分別引入的油a 和ifeMl 酶切位點(diǎn)；Y干擾素基因基因引物序列為上游引物5’ GGATCCACTTGCACTACCCAGACTTAC3 ,下游引物5’GAGCTCTTACGTGTTGGTGCGGGTGA 3 ’，下劃線所指為上下游引物分別引入的BanM 和Sac酶切位點(diǎn)，然后通過PCR的方法分別擴(kuò)增出禽α干擾素基因和禽Y干擾素基因 ’禽α干擾素基因序列如序列表序列1，禽Y干擾素基因序列如序列表序列2 ； 2)轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞真核表達(dá)載體構(gòu)建通過PCR擴(kuò)增的禽α、Y干擾素基因片段分別與PMD18-T克隆載體連接，通過各自的雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定后分別切下α、y基因片段，通過T4連接酶先后將二者基因連接到真核表達(dá)載體pBI-上；將構(gòu)建好的重組載體pBI-α + y用于對(duì)鹽藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)化； 3)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過玻璃珠轉(zhuǎn)化法，或通過基因槍法、電擊法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法或超聲波導(dǎo)入法轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞；轉(zhuǎn)化后的鹽藻細(xì)胞經(jīng)固體選擇培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，最終獲得陽性轉(zhuǎn)化藻株；挑取陽性藻株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，供后續(xù)分子生物學(xué)鑒定所用； 4)對(duì)轉(zhuǎn)化藻株的篩選與分子生物學(xué)鑒定提取轉(zhuǎn)基因藻株的基因組總RNA，對(duì)整合到鹽藻基因組中的目的基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增鑒定，以期查明目的基因整合與表達(dá)狀態(tài)，同時(shí)，利用western blot技術(shù)對(duì)表達(dá)得蛋白產(chǎn)物進(jìn)行生化活性分析； 5)融合型口服干擾素的制備將鑒定正確的轉(zhuǎn)基因藻株按1%的接種量接種于天然海水藻類養(yǎng)殖池，進(jìn)行開放式的規(guī)模化養(yǎng)殖，培養(yǎng)10-14天，當(dāng)藻細(xì)胞濃度達(dá)到IO6個(gè)/ml時(shí)，通過靜止沉淀或離心收集藻體，即得到融合型口服干擾素。
2.權(quán)利要求I所制備的禽用融合型口服干擾素的應(yīng)用，其特征在于作為一種抗病毒藥物應(yīng)用于禽類病毒性疾病的預(yù)防或治療。
3.權(quán)利要求I所制備的禽用融合型口服干擾素的應(yīng)用，其特征在于作為一種功能性飼料添加劑應(yīng)用于家禽養(yǎng)殖。
全文摘要
一種禽用融合型口服干擾素的制備及其應(yīng)用，利用禽類干擾素α、γ基因保守序列為基礎(chǔ)，將具有較強(qiáng)抗病毒作用的干擾素α基因和能夠提高機(jī)體免疫力、增強(qiáng)機(jī)體體質(zhì)的干擾素γ基因融合表達(dá)，表達(dá)的α+γ融合干擾素兼有二者協(xié)同功能。同時(shí)，利用鹽藻生物反應(yīng)器作為表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)除能表外源基因外，鹽藻自身的營(yíng)養(yǎng)豐富、無毒無害等優(yōu)點(diǎn)也得以利用，制備得到“一株多用”的基因藻株，應(yīng)用該轉(zhuǎn)基因藻株制備出的禽用融合型口服干擾素，可應(yīng)用于禽類病毒性疾病的預(yù)防或治療、禽類養(yǎng)殖業(yè)和相關(guān)飼料加工業(yè)等領(lǐng)域，效果好且綠色環(huán)保、成本低廉。
文檔編號(hào)C12N15/79GK102776222SQ20111043119
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者馮書營(yíng), 李光大, 李愛芳, 王臣, 王艷鴿, 祁松楠 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)