專利名稱：高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術領域的提高青蒿素含量的方法，特別是涉及一種高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產(chǎn)方法。
背景技術：
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是從其地上部分分離的一種含有過氧橋結構的倍半職內(nèi)酯化合物,是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾的藥物，特別是對于腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有速效和低毒的特點。目前，世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯(lián)合療法(ACTs)。另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)的功能，可見青蒿素是一種極具潛力的天然藥物。 目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，使得這種藥物的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。由于青蒿素結構復雜，人工合成難度大，產(chǎn)量低，成本高，不具有可行性。有人嘗試用組織培養(yǎng)和細胞工程的方法來生產(chǎn)青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中含量低于干重的0. 1%，在芽中最高也只有干重的0. 16%，而大多數(shù)研究在根中沒有檢測到青蒿素。因此利用組織培養(yǎng)及細胞工程來生產(chǎn)青蒿素的可行性也不高。經(jīng)對現(xiàn)有技術文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Pravej Alam等在2011年的《Plant Cell Rep》(《植物細胞報道》)發(fā)表了題為 “Over-expression of HMG-CoA reductase and amorpha-4,11-dienesynthase genes in Artemisia annua Land its influence on artemisinincontent^ “在青蒿中過表達HMGR和ADS基因對青蒿素含量的影響”)的論文，報道通過共同轉化青蒿素合成途徑關鍵酶基因HMGR和ADS，得到的轉基因植株青蒿素含量得到明顯提高的轉基因株系。通過基因工程方法提高青蒿植株中青蒿素的含量為規(guī)?；a(chǎn)青蒿素提供一條新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產(chǎn)方法。在非轉化普通青蒿含量為6. 43mg/g DW時，本發(fā)明得到的轉基因青蒿株系中青蒿素的含量最高達到15. 09mg/g DW，其含量是非轉化青蒿含量的2. 35倍，本發(fā)明的方法對于為青蒿素的規(guī)?；a(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)定新藥源具有重要意義。本發(fā)明是通過以下的技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明涉及一種高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產(chǎn)方法，包括如下步驟從青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三個基因，構建含ADS, CYP71AV1和CPR三基因的植物表達載體，用根癌農(nóng)桿菌介導，將ADS，CYP71AV1和CPR三基因轉入青蒿并再生出植株，篩選，獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。優(yōu)選地，所述篩選包括如下步驟PCR檢測外源目的基因ADS，CYP71AV1和CPR基因的整合情況，高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器測定轉基因青蒿中青蒿素的含量。
優(yōu)選地，所述PCR檢測為設計合成35S和ADS，CYP71AV1和CPR基因的引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的株系即為轉基因青蒿植株。優(yōu)選地，所述高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器測定青蒿植株中青蒿素含量，測定條件為色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相為甲醇水，甲醇水的體積比為70 30，柱溫30°C，流速I. OmL/min,進樣量10 u L，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大系數(shù)為7，載氣壓力5bar。本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明的共轉ADS，CYP71AV1和CPR三基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，將關鍵酶基因ADS，CYP71AV1和CPR三基因導入青蒿植株中，獲得了青蒿素含量顯著提高的轉基因青蒿株系，在非轉化普通青蒿含量為6. 43mg/g DW時，共轉ADS，CYP71AV1和CPR三基因青蒿中青蒿素的含量最高達到15. 09mg/g DW，其含量是非轉化青蒿含量的2. 35倍，該發(fā)明對于為青蒿素的規(guī)模化生產(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)定新藥源具有重要意義。


圖I為植物雙元表達載體pCAMBIA2300-cyp71avl-cpr_ads的構建示意圖；圖2為實施例中轉基因青蒿植株的PCR檢測結果圖；圖3為實施例中青蒿植株中青蒿素的含量檢測結果圖。
具體實施例方式下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。對本發(fā)明的過程概述如下(I)采用基因克隆方法獲得青蒿關鍵酶基因ADS，CYP71AV1和CPR ；(2)把ADS，CYP71AV1和CPR三基因可操作性地連接于表達調(diào)控序列，形成含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表達載體；(3)將含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表達載體轉化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉化青蒿的含ADS，CYP71AV1和CPR三基因植物表達載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；(4)利用所構建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉化青蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉基因青蒿植株；(5)對獲得的轉基因青蒿中青蒿素含量進行HPLC-ELSD測定，篩選獲得青蒿素含量顯著提高的轉基因青蒿植株。實施例I、青蒿ADS, CYP71AV1和CPR三基因的克降I. I青蒿基因組總RNA的提取取青蒿葉片組織，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的I. 5mL Eppendorf(EP)離心管中，充分振蕩后，按照TIANGEN試劑盒的說明書抽提總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。I. 2青蒿ADS，CYP71AV1和CPR三基因的克隆將所獲的青蒿基因組總RNA通過反轉錄酶XL (AMV)反轉錄獲得第一鏈cDNA，根據(jù)所述青蒿ADS，CYP7IAVl和CPR三基因的編碼序列(分別如SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQID NO. 3所示)，設計擴增出完整編碼框的上下游引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點，以便構建表達載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增后進行測序。DNA序列測定由上海英駿生物技術服務有限公司采用3730自動測序儀完成。測序結果表明，所克隆的序列與GenBank中所報道的青蒿ADS，CYP71AV1和CPR三基因的編碼序列一致。本實施例采用基因克隆方法從青蒿中獲得序列正確的青蒿素生物合成關鍵酶基因ADS，CYP71AV1和CPR，為通過共轉ADS，CYP71AV1和CPR三基因提高青蒿中青蒿素含量提供了重要的關鍵酶基因。實施例2、含ADS, CYP71AV1和CPR三某閔的棺物雙元表汰載體的構律2. I 中間載體 pMDl8_p35S-gfp-gus-nos 的構建 選用pMD18-T和pCAMBIA1304為基本元件，構建中間載體pMD18-p35S-gfp-gus_nos。具體地，根據(jù) pCAMBIA1304 上 p35S-gfp-gus_nos 的序列設計一對引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點，以便構建表達載體。以PCAMBIA1304質粒為模版，PCR擴增gfp-gus融合基因的表達盒，連接到pMD18_T載體，轉化篩選，挑取單克隆測序確認無誤。2. 2中間載體的構建構建pMD18-p35S-ads_nos， pMD18-p35S-cyp71avl-nos, pMD18-p35S-cpr-nos,以所述的 pMD18-p35S-gfp-gus_nos 為基礎，用重組載體 pMD18_ads pMD18_cyp71avl和pMD18-cpr中的ADS，CYP71AV1和CPR三基因分別替換其上的gfp-gus融合基因。具體步驟為用SpeI和BstEII雙酶切pMD18_ads pMD18_cyp71avl，pMD18-cpr 和 pMD18-p35S-gfp-gus-nos,回收 ADS，CYP71AV1, CPR 三基因片段和pMD18-p35S-gfp-gus-nos大片段，ADS，CYP71AV1，CPR三基因片段分別與大片段連接，轉化大腸桿菌，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。2. 3植物雙元表達載體pCAMBIA2300_cyp71avl的構建以所述的pMD18-p35S-cyp71avl_nos為基礎，將含有cyp71avl融合基因的表達盒置于植物雙元表達載體PCAMBIA2300中，構建成植物雙元表達載體pCAMBIA2300-cyp71avlo具體操作如下用SmaI和PstI雙酶切pCAMBIA2300，回收大片段，用 SwaI 和 PstI 雙酶切 pMD18-p35S-cyp71avl_nos,回收 cyp71avl 的表達盒。將 cyp71avl表達盒與PCAMBIA2300大片段連接，轉化大腸桿菌，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。2. 4植物雙元表達載體pCAMBIA2300-cyp71avl_cpr的構建以所述的pMD18-p35S-cpr-nos為基礎，將含有cpr基因的表達盒插入植物雙元表達載體 pCAMBIA2300_cyp71avl 中，構建成植物雙元表達載體 pCAMBIA2300-cyp71avl-cpr。具體操作如下用SmaI和PstI雙酶切pCAMBIA2300_cyp71avl，回收大片段，用SwaI和PstI雙酶切pMD18-p35S-cpr-nos，回收CPR基因的表達盒。將CPR基因的表達盒與pCAMBIA2300-cyp71avl大片段連接，轉化大腸桿菌，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證，獲得含有CYP71AV1基因和CPR基因的植物雙元表達載體pCAMBIA2300-cyp7lavI-Cpr02. 5 植物雙元表達載體 pCAMBIA2300-cyp71avl-cpr_ads 的構建(圖 I)
以所述的pMD18-p35S-ads_nos為基礎，將含有ads基因的表達盒插入植物雙元表達載體pCAMBIA2300-cyp71avl-cpr中，構建成植物雙元表達載體 pCAMBIA2300-cyp71avl-cpr_ads。具體操作如下用 SmaI 和 PstI 雙酶切pCAMBIA2300-cyp71avl-cpr,回收大片段，用 SwaI 和 PstI 雙酶切 pMD18-p35S-ads_nos，回收ADS基因的表達盒。將ADS基因的表達盒與pCAMBIA2300-cyp71avl-cpr大片段連接，轉化大腸桿菌，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證，獲得含有CYP71AV1基因，CPR基因和ADS基因的植物雙元表達載體pCAMBIA2300-cyp71avl-cpr-ads。本實施例將青蒿素生物合成途徑關鍵酶基因ADS，CYP71AV1和CPR三基因可操作性地連接于表達調(diào)控序列，形成含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表達載體，該表達載體可用于通過代謝工程策略來提高青蒿中青蒿素的含量。實施例3、根癌農(nóng)桿菌介導ADS，CYP71AV1和CPR三基因遺傳轉化青蒿獲得轉基因 青蒿植株3. I含ADS，CYP71AV1和CPR三基因雙元植物表達載體根癌農(nóng)桿菌工程菌的獲得將實施例2中含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物雙元表達載體轉入根癌農(nóng)桿菌(如EHA105，為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為Gambar I)，并進行PCR驗證。結果表明，含ADS，CYP71AV1和CPR三基因植物雙元表達載體已成功構建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。3. 2根癌農(nóng)桿菌介導ADS，CYP71AV1和CPR三基因載體轉化青蒿(I)外植體的預培養(yǎng)青蒿種子用75%乙醇浸泡lmin，再用20% NaClO浸泡20min，無菌水沖洗3_4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS(Murashige and Skoog, 1962)固體培養(yǎng)基中，25°C、16h/8h (light/dark)光照培養(yǎng)，即可獲得青蒿無菌苗。待苗長至5cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉化。(2)農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)將所述的葉片外植體，轉到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS+AS 100umol/L)中，滴加含活化好的所述含ADS，CYP71AV1和CPR三基因植物雙元表達載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28°C暗培養(yǎng)3d。以滴加在不帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對照。(3)抗性再生植株的篩選將所述的共培養(yǎng)3d的青蒿外植體轉入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 0. 5mg/L+NAAO. 05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于 25°C、16h/8h 光照培養(yǎng)，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉入生根培養(yǎng)基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培養(yǎng)至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。3. 3轉基因青蒿植株的PCR檢測根據(jù)35s啟動子序列設計正向引物p35S (SEQ ID NO. 4)，根據(jù)目的基因所在表達盒 p35s-ADS_nos 序列，p35s-CYP7lAVl-nos 序列，p35s-Cpr_nos 序列，分別設計 ADSR,CYP71AV1R和CPRR的反向引物(分別如SEQ ID NO. 6、7、8所示)，對目的基因進行檢測。結果表明，利用所設計的PCR特異引物，分別能擴增出1027bp，580bp和634bp的特異DNA片段(圖2)。而以非轉化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。
本實施例將所述的植物表達載體轉化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉化青蒿的含ADS，CYP71AV1和CPR三基因植物表達載體的根癌農(nóng)桿菌菌株，利用所構建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉化青蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉基因青蒿植株。轉基因青蒿植株的獲得為篩選獲得較高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。實施例4、利用HPLC-ELSD測定轉基因青蒿中青蒿素含暈4. 1HPLC-ELSD條件及系統(tǒng)適用性以及標準溶液的配制HPLC 采用water alliance 2695系統(tǒng)，色譜柱為C-18反相娃膠柱(SymmetryShieldTM C18, 5 u m, 250 X 4. 6mm, Waters),流動相為甲酉享:水，甲醇:水的體積比為70 30，柱溫300C，流速I. OmL/min,進樣量10 u L，靈敏度(AUFS =1.0)，理論塔板數(shù)按青蒿素峰計算不低于2000。
ELSD :采用water alliance 2420系統(tǒng)，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大系數(shù)(gain)為7,載氣壓力5bar ；精密稱取青蒿素標準品(Sigma公司)2. Omg用ImL甲醇完全溶解,得到2mg/mL青蒿素標準品溶液，保存于_20°C備用。本發(fā)明中流動相為甲醇(methanol)水，比例為70% 30%時，青蒿素的保留時間為5. lmin，峰型良好。理論塔板數(shù)按青蒿素計算不低于2000。4. 2標準曲線的制作將所述對照品溶液在相應色譜條件下分別進樣2ia，4ia，6ia，8ia，i0ia記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對標準品含量(X，u g)進行回歸分析。通過研究，本發(fā)明中青蒿素在4-20 Ug范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的Iog-Iog線性關系。青蒿素對照品的Iog-Iog線性回歸方程為Y = I. 28e+000X+4. 71e+000, R = O. 979546。4. 3樣品的制備和青蒿素含量的測定在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鮮的青蒿葉片，于45°C烘箱中烘至恒重。然后從烘干的枝條上敲下葉和花蕾，磨成粉末。稱取約0. Ig干粉于2mL Eppendorf管中，力口A 2mL乙醇,用40W超聲波處理30min, 5000rpm離心IOmin,取上清用0. 22 y m濾膜過濾，即可用于HPLC-ELSD測定青蒿素的含量。采用HPLC-ELSD測定青蒿素含量，樣品進樣體積為20 U I，根據(jù)峰面積代入線形回歸方程計算出樣品中的青蒿素含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉干重(g)，從而計算出青蒿植株中青蒿素的含量。本實施例共轉ADS，CYP71AV1和CPR三基因顯著提高了青蒿中青蒿素含量，在非轉化普通青蒿含量為6. 43mg/g Dff時，共轉ADS，CYP71AV1和CPR三基因青蒿中青蒿素的含量最高達到15. 09mg/g DW，其含量是非轉化青蒿含量的2. 35倍(圖3)。本實施例采用HPLC-ELSD法測定了轉基因青蒿中青蒿素含量，采用共轉化ADS，CYP71AV1和CPR三基因的代謝工程策略獲得了青蒿素高產(chǎn)的青蒿植株，為規(guī)?；a(chǎn)青蒿素提供了一種理想方法。
權利要求
1.一種高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟從青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三個基因，構建含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表達載體，用根癌農(nóng)桿菌介導，將ADS，CYP71AV1和CPR三基因轉入青蒿并再生出植株，篩選，獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。
2.如權利要求I所述的高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述篩選包括如下步驟PCR檢測外源目的基因ADS，CYP71AV1和CPR三基因的整合情況，高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器測定轉基因青蒿中青蒿素的含量。
3.如權利要求2所述的高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述PCR檢測為設計合成35S和ADS，CYP71AV1和CPR基因的引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的株系即為轉基因青蒿植株。
4.如權利要求2所述的高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器測定青蒿植株中青蒿素含量，測定條件為色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相為甲醇水，甲醇水的體積比為70 30，柱溫為30°C，流速1.0mL/min，進樣量10 μ L，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大系數(shù)為7，載氣壓力5bar。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物技術領域的高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產(chǎn)方法，包括如下步驟從青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三個基因，構建含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表達載體，用根癌農(nóng)桿菌介導，將ADS，CYP71AV1和CPR三基因轉入青蒿并再生出植株，篩選，獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。在非轉化普通青蒿含量為6.43mg/g DW時，本發(fā)明得到的轉基因青蒿株系中青蒿素的含量最高達到15.09mg/g DW，其含量是非轉化青蒿含量的2.35倍，本發(fā)明的方法對于為青蒿素的規(guī)?；a(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)定新藥源具有重要意義。
文檔編號C12N15/52GK102776212SQ201110430810
公開日2012年11月14日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權日2011年12月20日
發(fā)明者呂宗友, 唐克軒, 張凌, 張芳源, 江偉民, 沈乾, 陸續(xù), 高爾娣 申請人:上海交通大學