專利名稱：一種鑒定實蠅的試劑盒及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種鑒定實蠅的試劑盒及其專用引物。
背景技術：
實蠅屬雙翅目(Diptera)實蠅科(T印hritidae)，全世界廣泛分布，多發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū)。實蠅科約有500屬4500種，具有重要經(jīng)濟意義的實蠅達150余種，有些實蠅對水果生產會造成毀滅性災害。世界上具有經(jīng)濟重要性的實蠅主要有5個屬，分別是按實蠅屬(Anastr印ha)、果實蠅屬(Bactrocera)、小條實蠅屬(Ceratitis)、寡鬃實蠅屬 (Dacus)和繞實蠅屬(lihagoletis)。全國實蠅監(jiān)測調查結果顯示，我國大陸及臺灣地區(qū)所發(fā)生的具有重要經(jīng)濟意義的實蠅主要為果實蠅屬種類。根據(jù)我國新修訂的進境植物檢疫性有害生物名錄、全國農業(yè)植物檢疫性有害生物名單、我國口岸檢疫性實蠅的截獲信息及全國實蠅監(jiān)測情況，并結合國家質檢總局于2006 年發(fā)布的擴大臺灣水果、蔬菜和水產品準入大陸種類公告，橘小實蠅(B. (B.Morsalis)、辣椒實蠅(B. (B. )latifrons)、番石榴實蠅(B. (B.) correcta)、顏帶實蠅(B. (B.) cilifera)、 瓜實蠅(B. (Z. )cucurbitae)、南亞果實蠅(B. (Z. ) tau)、具條實蠅(B. (Z. ) scutellata)、黑紋實蠅(B. (Z. )caudata)、葫瓜實蠅(B. (Z. )nubila)、蜜柑大實蠅(B. (T.) tsuneoni)和橘大實蠅(B. (T.)minax)為主要經(jīng)濟類果實蠅屬種類。實蠅的種類鑒定通常以成蟲的形態(tài)學特征為主要依據(jù)，要求標本具有完整的形態(tài)結構，并需要工作人員具有豐富的種類鑒定經(jīng)驗。同時，實蠅能夠以卵、幼蟲、蛹、成蟲隨寄主果實、包裝物和運輸工具等進行遠距離人為傳播，在進境果蔬的檢疫中常有截獲，且以卵、幼蟲、蛹等非成蟲態(tài)樣品為主，需將其飼養(yǎng)至成蟲才能進行種類鑒定。因此，傳統(tǒng)的基于形態(tài)學特征的實蠅種類鑒定技術已不能滿足口岸檢疫和國內實蠅監(jiān)測工作的需要。隨著分子生物學技術的發(fā)展，利用現(xiàn)代分子生物學技術進行實蠅種類鑒定，不受實蠅樣品發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響，對非成蟲態(tài)的樣品及形態(tài)結構不完整的成蟲樣品，均可從DNA上得到準確、可靠的鑒定信息。特別對于非成蟲態(tài)的實蠅，無需將其飼養(yǎng)至成蟲，便可實現(xiàn)種類的準確鑒定，可大大提高口岸檢疫的運行速度和檢疫質量。PCR技術的誕生使分子生物學技術得到了前所未有的發(fā)展，該技術已成為分子生物學技術的基礎，廣泛應用于生物和醫(yī)學各個領域的研究和臨床應用當中，在實蠅的分子鑒定和系統(tǒng)進化研究中的應用也十分廣泛。PCR技術的原理類似于DNA在生物體內的自然復制過程，由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成，是在Taq DNA聚合酶的作用下，以 dNTP為原料，靶序列為模板，按照堿基互補配對原則和半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的鏈，每完成一次循環(huán)DNA鏈就擴增一倍，并可作為下次循環(huán)的模板，重復循環(huán)變性-退火-延伸三個過程，可獲得更多的DNA雙鏈。物種鑒定的特異引物PCR技術與普通PCR擴增相似，只是在根據(jù)靶序列進行引物設計時，需要充分考慮引物的特異性，用特異性強的引物擴增未知模板，通過檢測目標片段的有無，達到把目標種與非目標種鑒別開來的目的。
由于生物基因組數(shù)量龐大，不便于進行全面的核酸序列分析，需針對基因組中的個別特征基因片段進行重點研究。因此，選擇合適的分子標記基因片段是分子鑒定的關鍵所在。COI基因中一段長度為648bp的片段被用作動物分類學中最為常用的基因之一，即在動物分類學中被作為標準基因的DNA條形碼。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測實蠅的引物。本發(fā)明提供的檢測實蠅的引物，由如下11種引物對組成引物對1-引物對11 ；所述引物對1由引物1和引物2組成；所述引物對2由引物3和引物4組成；所述引物對3由引物5和引物6組成；所述引物對4由引物7和引物8組成；所述引物對5由引物9和引物10組成；所述引物對6由引物11和引物12組成；所述引物對7由引物13和引物14組成；所述引物對8由引物15和引物16組成；所述引物對9由引物17和引物18組成；所述引物對10由引物19和引物20組成；所述引物對11由引物21和引物22組成；所述引物1的核苷酸序列為序列表中的序列1 ；所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列4 ；所述引物5的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述引物6的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；所述引物7的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述引物8的核苷酸序列為序列表中的序列8 ；所述引物9的核苷酸序列為序列表中的序列9 ；所述引物10 的核苷酸序列為序列表中的序列10 ；所述引物11的核苷酸序列為序列表中的序列11 ；所述引物12的核苷酸序列為序列表中的序列12 ；所述引物13的核苷酸序列為序列表中的序列13 ；所述引物14的核苷酸序列為序列表中的序列14 ；所述引物15的核苷酸序列為序列表中的序列15 ；所述引物16的核苷酸序列為序列表中的序列16 ；所述引物17的核苷酸序列為序列表中的序列17 ；所述引物18的核苷酸序列為序列表中的序列18 ；所述引物19的核苷酸序列為序列表中的序列19 ；所述引物20的核苷酸序列為序列表中的序列20 ；所述引物21的核苷酸序列為序列表中的序列21 ；所述引物22的核苷酸序列為序列表中的序列 22。上述引物中，所述實蠅為橘小實蠅、辣椒實蠅、番石榴實蠅、顏帶實蠅、瓜實蠅、南亞果實蠅、具條實蠅、黑紋實蠅、葫瓜實蠅、蜜柑大實蠅和橘大實蠅中的至少一種。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測實蠅的PCR試劑。本發(fā)明提供的PCR試劑，由PCR試劑I-PCR試劑11組成；所述PCR試劑1由上述的引物對1、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；所述PCR試劑2由上述的引物對2、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；所述PCR試劑3由上述的引物對3、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；所述PCR試劑4由上述的引物對4、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；所述PCR試劑5由上述的引物對5、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；所述PCR試劑6由上述的引物對6、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；所述PCR試劑7由上述的引物對7、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；所述PCR試劑8由上述的引物對8、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；所述PCR試劑9由上述的引物對9、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；
所述PCR試劑10由上述的引物對10、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；所述PCR試劑11由上述的引物對11、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；上述引物對中的各引物在對應的上述PCR試劑中的濃度均為0. 6μΜ。上述PCR試劑中，所述實蠅為橘小實蠅、辣椒實蠅、番石榴實蠅、顏帶實蠅、瓜實蠅、南亞果實蠅、具條實蠅、黑紋實蠅、葫瓜實蠅、蜜柑大實蠅和橘大實蠅中的至少一種。本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測實蠅的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的PCR試劑；上述實蠅具體為橘小實蠅、辣椒實蠅、番石榴實蠅、顏帶實蠅、瓜實蠅、南亞果實蠅、具條實蠅、黑紋實蠅、葫瓜實蠅、蜜柑大實蠅和橘大實蠅中的至少一種。上述引物或上述PCR試劑或上述試劑盒在鑒定或輔助鑒定實蠅中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；所述實蠅具體為橘小實蠅、辣椒實蠅、番石榴實蠅、顏帶實蠅、瓜實蠅、南亞果實蠅、具條實蠅、黑紋實蠅、葫瓜實蠅、蜜柑大實蠅和橘大實蠅中的至少一種。本發(fā)明的第四個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測實蠅的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)用上述引物或上述PCR試劑或上述試劑盒中的所述11種引物對分別對待測實蠅進行PCR擴增，得到擴增產物，檢測擴增產物，若所述引物對1擴增產物的大小為216bp，則待測實蠅為或候選為橘小實蠅；若所述引物對2擴增產物的大小為211bp，則待測實蠅為或候選為辣椒實蠅；若所述引物對3擴增產物的大小為27^p，則待測實蠅為或候選為番石榴實蠅；若所述引物對4擴增產物的大小為159bp，則待測實蠅為或候選為顏帶實蠅；若所述引物對5擴增產物的大小為416bp，則待測實蠅為或候選為瓜實蠅；若所述引物對6擴增產物的大小為^4bp，則待測實蠅為或候選為南亞果實蠅；若所述引物對7擴增產物的大小為317bp，則待測實蠅為或候選為具條實蠅；若所述引物對8擴增產物的大小為181bp，則待測實蠅為或候選為黑紋實蠅；若所述引物對9擴增產物的大小為362bp，則待測實蠅為或候選為葫瓜實蠅；若所述引物對10擴增產物的大小為337bp，則待測實蠅為或候選為蜜柑大實蠅；若所述引物對11擴增產物的大小為499bp，則待測實蠅為或候選為橘大實蠅。上述方法中，所述引物對1擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列23或M ；所述引物對2擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列25或沈；所述引物對3擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列27或觀；所述引物對4擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列四或30 ；所述引物對5擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列31或32 ；所述引物對6擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列33或34 ；所述引物對7擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列35或36 ；所述引物對8擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列37 ；所述引物對9擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列38 ；所述引物對10擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列39或40 ；所述引物對11擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列41或42。上述方法中，在PCR擴增中，以待測實蠅的基因組DNA為模板；
上述PCR擴增的退火溫度為55°C。上述方法中，所述檢測PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳。上述檢測PCR擴增產物的方法也可以為測序。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(1)本研究結合監(jiān)測情況、口岸截獲信息、寄主信息等，涉及了包含中國大陸和臺灣地區(qū)主要經(jīng)濟實蠅種類，所包含的實蠅種類代表性強，確保了鑒定結果的準確性以及技術的實用性；本發(fā)明實現(xiàn)了針對我國大陸和臺灣地區(qū)11種主要經(jīng)濟類實蠅的種類快速鑒定，解決了非成蟲態(tài)實蠅樣品的種類鑒定問題，能夠為進出境植物檢疫和全國實蠅疫情監(jiān)測提供我國大陸和臺灣地區(qū)主要經(jīng)濟類實蠅的快速鑒定工具和技術，可有效預防危險性實蠅的入侵和擴散、保護農業(yè)生產和生態(tài)安全、促進海峽兩岸經(jīng)濟貿易發(fā)展；(2)以DNA條形碼COI基因作為目的基因序列，使該快速鑒定技術更具標準化；(3)技術通用性強，對儀器設備要求不高，在實際工作中容易推廣應用；(4)鑒定過程簡便、快速、經(jīng)濟，從樣品處理到出結果的整個鑒定過程只需7小時左右ο


圖1為橘小實蠅引物(弓丨物對1)PCR特異性檢測凝膠電泳結果圖2為辣椒實蠅引物(弓丨物對2)PCR特異性檢測凝膠電泳結果圖3為番石榴實蠅引物(引物對3)PCR特異性檢測凝膠電泳結果圖4為顏帶實蠅引物(引物對4)PCR特異性檢測凝膠電泳結果圖5為瓜實蠅引物(引物對5)PCR特異性檢測凝膠電泳結果圖6為南亞果實蠅引物(引物對6)PCR特異性檢測凝膠電泳結果圖7為具條實蠅引物(引物對7)PCR特異性檢測凝膠電泳結果圖8為黑紋實蠅引物(弓丨物對8)PCR特異性檢測凝膠電泳結果圖9為葫瓜實蠅引物(弓丨物對9)PCR特異性檢測凝膠電泳結果圖10為蜜柑大實蠅引物(弓丨物對10)PCR特異性檢測凝膠電泳結果圖11為橘大實蠅引物(弓丨物對11)PCR特異性檢測凝膠電泳結果圖12為橘小實蠅引物靈敏度檢測結果圖13為辣椒實蠅引物靈敏度檢測結果圖14為番石榴實蠅引物靈敏度檢測結果圖15為顏帶實蠅引物靈敏度檢測結果圖16為瓜實蠅引物靈敏度檢測結果圖17為南亞果實蠅引物靈敏度檢測結果圖18為具條實蠅引物靈敏度檢測結果圖19為黑紋實蠅引物靈敏度檢測結果圖20為葫瓜實蠅引物靈敏度檢測結果圖21為蜜柑大實蠅引物靈敏度檢測結果圖22為橘大實蠅引物靈敏度檢測結果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、引物的設計
1、實蠅DNA條形碼的獲得通過在BOLD和GenBank系統(tǒng)中查詢可以獲得橘小實蠅、辣椒實蠅、番石榴實蠅、瓜實蠅和南亞果實蠅的Barcode公開序列。模板序列的公開序列號分別為橘小實蠅 (DQl 16269)、辣椒實蠅(DQ116296)、番石榴實蠅(DQ116264)、瓜實蠅(DQ116242)、南亞果實蠅(GU323773. 1)。對在數(shù)據(jù)庫中未檢索到的目的基因序列，使用通用引物LC0-1490 (5’-GGTCAACAAA TCATAAAGATATTG-3，)和 HC0-2198 (5，_TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA_3，)對已提取出的實蠅基因組DNA進行目的片段擴增。2、引物的設計用DNAMAN軟件對目標種實蠅的DNA條形碼進行比對分析，根據(jù)分析結果，針對目的基因序列人工設計特異引物，并用Oligo軟件對引物進行評估，檢查引物Tm、GC%、錯配、 二聚體和發(fā)夾結構等，并用GenBank中提供的Blast程序檢查同源序列。設計的11種引物對如下表1所示表1為特異引物一覽表
權利要求
1.一種檢測實蠅的引物，由如下11種引物對組成引物對1-引物對11 ； 所述引物對1由引物1和引物2組成；所述引物對2由引物3和引物4組成； 所述引物對3由引物5和引物6組成； 所述引物對4由引物7和引物8組成； 所述引物對5由引物9和引物10組成； 所述引物對6由引物11和引物12組成； 所述引物對7由引物13和引物14組成； 所述引物對8由引物15和引物16組成； 所述引物對9由引物17和引物18組成； 所述引物對10由引物19和引物20組成； 所述引物對11由引物21和引物22組成； 所述引物1的核苷酸序列為序列表中的序列1 ； 所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列2 ； 所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列3 ； 所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列4 ； 所述引物5的核苷酸序列為序列表中的序列5 ； 所述引物6的核苷酸序列為序列表中的序列6 ； 所述引物7的核苷酸序列為序列表中的序列7 ； 所述引物8的核苷酸序列為序列表中的序列8 ； 所述引物9的核苷酸序列為序列表中的序列9 ； 所述引物10的核苷酸序列為序列表中的序列10 ； 所述引物11的核苷酸序列為序列表中的序列11 ； 所述引物12的核苷酸序列為序列表中的序列12 ； 所述引物13的核苷酸序列為序列表中的序列13 ； 所述引物14的核苷酸序列為序列表中的序列14 ； 所述引物15的核苷酸序列為序列表中的序列15 ； 所述引物16的核苷酸序列為序列表中的序列16 ； 所述引物17的核苷酸序列為序列表中的序列17 ； 所述引物18的核苷酸序列為序列表中的序列18 ； 所述引物19的核苷酸序列為序列表中的序列19 ； 所述引物20的核苷酸序列為序列表中的序列20 ； 所述引物21的核苷酸序列為序列表中的序列21 ； 所述引物22的核苷酸序列為序列表中的序列22。
2.根據(jù)權利要求1所述的引物，其特征在于所述實蠅為橘小實蠅、辣椒實蠅、番石榴實蠅、顏帶實蠅、瓜實蠅、南亞果實蠅、具條實蠅、黑紋實蠅、葫瓜實蠅、蜜柑大實蠅和橘大實蠅中的至少一種。
3.一種檢測實蠅的PCR試劑，由PCR試劑I-PCR試劑11組成；所述PCR試劑1由權利要求1或2所述的引物中的引物對1、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；所述PCR試劑2由權利要求1或2所述的引物中的引物對2、dNTP、DNA聚合酶及PCR 緩沖液組成；所述PCR試劑3由權利要求1或2所述的引物中的引物對3、dNTP、DNA聚合酶及PCR 緩沖液組成；所述PCR試劑4由權利要求1或2所述的引物中的引物對4、dNTP、DNA聚合酶及PCR 緩沖液組成；所述PCR試劑5由權利要求1或2所述的引物中的引物對5、dNTP、DNA聚合酶及PCR 緩沖液組成；所述PCR試劑6由權利要求1或2所述的引物中的引物對6、dNTP、DNA聚合酶及PCR 緩沖液組成；所述PCR試劑7由權利要求1或2所述的引物中的引物對7、dNTP、DNA聚合酶及PCR 緩沖液組成；所述PCR試劑8由權利要求1或2所述的引物中的引物對8、dNTP、DNA聚合酶及PCR 緩沖液組成；所述PCR試劑9由權利要求1或2所述的引物中的引物對9、dNTP、DNA聚合酶及PCR 緩沖液組成；所述PCR試劑10由權利要求1或2所述的引物中的引物對10、dNTP、DNA聚合酶及PCR 緩沖液組成；所述PCR試劑11由權利要求1或2所述的引物中的引物對ll、dNTP、DNA聚合酶及PCR 緩沖液組成；所述引物對中的各引物在對應的所述PCR試劑中的濃度均為0. 6 μ M。
4.根據(jù)權利要求3所述的試劑，其特征在于所述實蠅為橘小實蠅、辣椒實蠅、番石榴實蠅、顏帶實蠅、瓜實蠅、南亞果實蠅、具條實蠅、黑紋實蠅、葫瓜實蠅、蜜柑大實蠅和橘大實蠅中的至少一種。
5.一種檢測實蠅的試劑盒，包括權利要求3或4所述的PCR試劑；所述實蠅具體為橘小實蠅、辣椒實蠅、番石榴實蠅、顏帶實蠅、瓜實蠅、南亞果實蠅、具條實蠅、黑紋實蠅、葫瓜實蠅、蜜柑大實蠅和橘大實蠅中的至少一種。
6.權利要求1或2所述引物或權利要求3或4所述PCR試劑或權利要求5所述試劑盒在鑒定或輔助鑒定實蠅中的應用；所述實蠅具體為橘小實蠅、辣椒實蠅、番石榴實蠅、顏帶實蠅、瓜實蠅、南亞果實蠅、具條實蠅、黑紋實蠅、葫瓜實蠅、蜜柑大實蠅和橘大實蠅中的至少一種。
7.一種鑒定或輔助鑒定實蠅的方法，包括如下步驟1)用權利要求1或2所述引物或權利要求3或4所述PCR試劑或權利要求5所述試劑盒中的引物中的所述11種引物對分別對待測實蠅進行PCR擴增，得到擴增產物，檢測擴增產物，若所述引物對1擴增產物的大小為216bp，則待測實蠅為或候選為橘小實蠅；若所述引物對2擴增產物的大小為211bp，則待測實蠅為或候選為辣椒實蠅；若所述引物對3擴增產物的大小為27^p，則待測實蠅為或候選為番石榴實蠅；若所述引物對4擴增產物的大小為159bp，則待測實蠅為或候選為顏帶實蠅； 若所述引物對5擴增產物的大小為416bp，則待測實蠅為或候選為瓜實蠅； 若所述引物對6擴增產物的大小為^4bp，則待測實蠅為或候選為南亞果實蠅； 若所述引物對7擴增產物的大小為317bp，則待測實蠅為或候選為具條實蠅； 若所述引物對8擴增產物的大小為181bp，則待測實蠅為或候選為黑紋實蠅； 若所述引物對9擴增產物的大小為362bp，則待測實蠅為或候選為葫瓜實蠅； 若所述引物對10擴增產物的大小為337bp，則待測實蠅為或候選為蜜柑大實蠅； 若所述引物對11擴增產物的大小為499bp，則待測實蠅為或候選為橘大實蠅。
8.根據(jù)權利要求7的方法，其特征在于所述引物對1擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列23或M ； 所述引物對2擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列25或沈； 所述引物對3擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列27或觀； 所述引物對4擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列四或30 ； 所述引物對5擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列31或32 ； 所述引物對6擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列33或34 ； 所述引物對7擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列35或36 ； 所述引物對8擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列37 ； 所述引物對9擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列38 ； 所述引物對10擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列39或40 ； 所述引物對11擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列41或42。
9.根據(jù)權利要求7或8的方法，其特征在于 所述PCR擴增中，以待測實蠅的基因組DNA為模板； 所述PCR擴增的退火溫度為55°C。
10.根據(jù)權利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于 所述檢測PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定實蠅的試劑盒及其專用引物。本發(fā)明提供的引物，由如下11種引物對組成引物對1-引物對11；本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明的方法具有如下等優(yōu)點本研究結合監(jiān)測情況、口岸截獲信息、寄主信息等，涉及了包含中國大陸和臺灣地區(qū)主要經(jīng)濟實蠅種類，所包含的實蠅種類代表性強，確保了鑒定結果的準確性以及技術的實用性。
文檔編號C12N15/11GK102517388SQ20111043070
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權日2011年12月20日
發(fā)明者劉海軍, 吳佳教, 姜帆, 李志紅, 胡學難, 顧渝娟 申請人:中國農業(yè)大學, 廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心