專利名稱：新型全人源抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及全人源抗體，其包含經(jīng)改造的重鏈和輕鏈。具體而言，本發(fā)明所述的全人源抗體為經(jīng)改造的全人源單克隆抗體，具體為針對(duì)已經(jīng)上市的全人源抗體帕尼單抗，利用抗體工程技術(shù)平臺(tái)，改變抗體亞型，形成全新序列的抗EGFR全人源抗體分子，從而提高抗體ADCC及抗腫瘤活力。本發(fā)明還涉及制備所述全人源抗體的方法以及所述抗體在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowth factor receptor, EGFR, HERl, c-ErbBl)是由1186個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子量為170kD的一種跨膜糖蛋白。EGFR分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū) 3 部分(Jorissen RN, Walker F, Pouliot N,等人，Epidermal growth factorreceptor:mechanisms of activation and signaling.Exp Cell Res,2003 ;284:31-53)。EGFR屬于I型酪氨酸激酶受體亞族(ErbB 1_4)，具有酪氨酸激酶的活性。EGFR穩(wěn)定的表達(dá)于許多上皮組織，以及間質(zhì)和神經(jīng)源性組織。不同器官發(fā)生的實(shí)體瘤也高表達(dá)EGFR，如頭頸部癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌和食管癌等(Mendelsohn J,Baselga J.Status of epidermalgrowth factor receptor antagonists in the biology and treatment of cancer.JClin Oncol, 2003 ; 21:2787-2799)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 a (transforming growth factor a ,TGF a )和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)等生長(zhǎng)因子是EGFR的配體。這些配體與EGFR的結(jié)合導(dǎo)致EGFR 二聚化，激活了受體胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶的活性，使C末端特異的酪氨酸殘基磷酸化，為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子提供結(jié)合位點(diǎn)，由此啟動(dòng)She，Grb2,Ras/MAPK, PI3K 及 JAKs/STATs 等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Mendelsohn J, Baselga J.Statusof epidermal growth factor receptor antagonists in the biology and treatmentof cancer.J Clin Oncol, 2003 ;21:2787-2799 ;以及 Olayioye MA, Neve RM, Lane HA,等人.The EerbB Signaling network:receptor heterodimerzation in developmentand cancer.The EMBO J，2000 ; 19:3159-3167)。EGFR通過介導(dǎo)這些通路調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力、促進(jìn)血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡(CastilloL, Etienne-Grimaldi MC, Fischel JL, et al.Pharmacological background of EGFRtargeting.Ann Oncol, 2004 ;15:1007-1012)。EGFR在腫瘤中的高度表達(dá)及其在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分化中起著重要作用的這些特點(diǎn)，使EGFR成為具有良好前景的腫瘤診斷和治療的靶點(diǎn)。近年來有越來越多證據(jù)表明表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factorreceptor, EGFR)與許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。在各種實(shí)體腫瘤中EGFR表達(dá)率最高的是頭頸部腫瘤，達(dá)95%-100%。結(jié)直腸癌則為第2位，表達(dá)率高達(dá)72%-89%。EGFR表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤具有惡性度高、侵襲力強(qiáng)的特點(diǎn)，而且EGFR表達(dá)水平的高低與預(yù)后相關(guān)。因而同樣成為當(dāng)前腫瘤分子靶向治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。有依據(jù)證實(shí)HER1/EGFR在實(shí)體腫瘤中表達(dá)異常，其臨床體現(xiàn)為轉(zhuǎn)移，生存期縮短，預(yù)后差，對(duì)化療及激素治療耐受。阻斷HER1/EGFR后能抑制腫瘤的形成，同時(shí)改善上述狀況。目前用于EGFR靶向性治療腫瘤的藥物主要分為兩類:EGFR單克隆抗體和小分子化合物酪氨酸激酶拮抗劑。酪氨酸激酶拮抗劑主要為小分子喹啉類化合物，能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制ATP與EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，進(jìn)而影響酪氨酸殘基磷酸化，抑制EGFR下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。EGFR單克隆抗體是與內(nèi)源性配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EGFR，通過抑制酪氨酸激酶的激活、促進(jìn)EGFR內(nèi)化等作用產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)外已有3種抗EGFR單克隆抗體上市，與其他化療藥相比，這些抗體作用特異性強(qiáng)，副作用小，在臨床上取得了較好的療效。EGFR是抗體藥物開發(fā)的成熟靶點(diǎn)，作為抗腫瘤抗體藥物開發(fā)的三個(gè)最大的成熟靶點(diǎn)(HER2，EGFR，VEGF)之一，EGFR靶點(diǎn)相關(guān)的靶向治療藥物包括抗體藥物在腫瘤治療中地位非常重要。由于目前已經(jīng)上市的抗EGFR抗體藥物的局限性，研究開發(fā)高效低毒的新型抗EGFR抗體藥物一直是國(guó)際醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)。體外分析和動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)表明，EGFR單克隆抗體愛必妥(cetuximab) —方面與EGFR結(jié)合阻斷磷酸化，抑制配體激活EGFR的酪氨酸激酶活性，并促進(jìn)EGFR的內(nèi)吞和降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡；另一方面，愛必妥(cetuximab)通過招募自然殺傷(NK)等細(xì)胞至腫瘤表面,進(jìn)一步通過細(xì)胞毒作用抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(Bleeker WK7Lammertsvan Bueren JJ, van Ojik HH，Gerritsen AF，Pluyter M，Houtkamp M，Halk E，GoldsteinJ，Schuurman J，van Dijk MA, van de Winkel JG, Parren PW.Dual mode of action ofa human ant1-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for cancertherapy.J Immunol.2004 ；173:4699-707.)。通過對(duì)抗體藥物分子及其在疾病治療過程中作用機(jī)制研究結(jié)果的總結(jié)，可以發(fā)現(xiàn)，各種抗EGFR單克隆抗體在體內(nèi)發(fā)揮治療作用不但與其與EGFR的親和力相關(guān)，同時(shí)還與ADCC活性相關(guān)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，與IgG2相比，IgGlADCC(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)等生物學(xué)活性明顯更強(qiáng)(Patel D, Guo X, Ng S, Melchior M, Balderes P, Burtrum D,Persaud K,Luna X,Ludwig DL,Kang X.1gG isotype,glycosylation,and EGFR expressiondetermine the induction of antibody-dependent cellular cytotoxicity in Vitro bycetuximab.Hum Antibodies.2010 ；19:89-99)。目前，治療性單克隆抗體隨著技術(shù)的發(fā)展分成約70%人源序列的嵌合抗體、90-94%人源序列的人源化抗體，以及100%人源序列的全人源抗體三個(gè)種類。人源序列比例的多少意味抗體用于人體治療時(shí)潛在產(chǎn)生免疫原性可能性的高低，所以，全人源抗體產(chǎn)生免疫原性的可能性低于嵌合抗體，用作治療性藥物時(shí)全人源抗體優(yōu)于嵌合和人源化抗體。ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用)是指表達(dá)IgG-Fc受體的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等，通過與已結(jié)合在病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等靶細(xì)胞表面的IgG抗體的Fe段結(jié)合，而殺傷這些靶細(xì)胞的作用。IgG抗體可介導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)揮ADCC作用，其中NK細(xì)胞是能發(fā)揮ADCC作用的主要細(xì)胞。在抗體介導(dǎo)的ADCC作用的發(fā)生過程中，抗體只能與靶細(xì)胞上的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合，而NK細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞可殺傷任 何已與抗體結(jié)合的靶細(xì)胞，故抗體與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合是特異性的，NK細(xì)胞等對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用是非特異性的。
已經(jīng)上市的幾種抗EGFR單克隆抗體藥物都有一定的局限性，愛必妥為人鼠嵌合IgGl抗體，其有免疫原性，容易產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生副作用，降低藥效；帕尼單抗為全人源IgG2亞型抗體，缺乏ADCC (抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)相關(guān)的生物學(xué)活性，只能依靠阻斷EGFR信號(hào)通路來抑制腫瘤生長(zhǎng)，缺乏另一種ADCC的腫瘤抑制作用機(jī)制，相比愛必妥的兩種機(jī)制，抗腫瘤效應(yīng)減弱。帕尼單抗是IgG2亞型抗體，而愛必妥是IgGl亞型抗體，研究數(shù)據(jù)表明愛必妥有更強(qiáng)的ADCC活力。在不改變抗體三維立體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，可以通過抗體工程技術(shù)，針對(duì)IgG2抗體鉸鏈區(qū)進(jìn)行氨基酸替換，可以將IgG2抗體改變成為IgGl亞型(Z Steplewski,L K Sun，C W Shearman，J Ghrayeb, PDaddona，and H Koprowsk1.Biological activityof human-mouse IgGl， IgG2， IgG3， and IgG4 chimeric monoclonal antibodies withanti tumor specificity.PNAS 1988;85:4852-4856)。本發(fā)明針對(duì)已經(jīng)上市的全人源抗體帕尼單抗，利用抗體工程技術(shù)平臺(tái)，改變抗體亞型，由IgG2亞型改變成為IgGl亞型，形成全新序列的抗EGFR全人源抗體分子,該抗體分子具有與帕尼單抗相同的靶點(diǎn)結(jié)合特性，同時(shí)由于抗體亞型不同，該抗體分子有更強(qiáng)的ADCC生物學(xué)活性，與帕尼單抗相比抗腫瘤作用更強(qiáng)。此外，由于該抗體為完全人源的抗體分子，其免疫原性低于嵌合抗體愛必妥，潛在的臨床應(yīng)用副作用更低。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有上市EGFR抗體的優(yōu)缺點(diǎn)，基于抗體工程和抗體結(jié)構(gòu)理論知識(shí)，本發(fā)明提供一種新的全人源EGFR抗體，一方面減少嵌合抗體的免疫原性副作用，另一方面通過改變IgG抗體的亞型，提高抗體的抑制腫瘤效應(yīng)。為了保持全人源抗體低免疫原性、以及已證明的抑制EGFR信號(hào)通路的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明選擇通過對(duì)全人源EGFR抗體帕尼單抗進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，提高ADCC活力，進(jìn)一步優(yōu)化帕尼單抗的抗腫瘤療效。

本發(fā)明提供了以下方案:1.一種改造的全人源抗體及其片段，其包含如SEQ ID N0.:1或SEQ IDN0.:2所示的重鏈序列。2.改造的全人源抗體及其片段，其含如SEQ ID N0.:1或SEQ ID N0.:2所示的重鏈序列以及SEQ ID N0.:3或SEQ ID N0.:4所示的輕鏈序列。3.在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種全人源抗體，其包含如SEQ IDN0.:1所示的重鏈序列和SEQ ID N0.:3所示的輕鏈序列。4.在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供了一種全人源抗體，其包含如SEQ IDN0.:2所示的重鏈序列和SEQ ID N0.:4所示的輕鏈序列。5.在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供了一種DNA分子，它編碼如上方案1-4所述的全人源抗體。6.在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供了一種用于哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)的表達(dá)載體，其為病毒的或非病毒的，并含有上述方案5所述的序列的DNA分子。7.在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供了一種宿主細(xì)胞,它含有上述方案6中所述的載體。
8.本發(fā)明還提供了本發(fā)明的全人源抗體在制備用于提高全人源抗體的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性活力的藥物中的用途。9.在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供了一種提高全人源抗體ADCC (抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)活力的方法，其特征在于采用上述方案1-4中任一項(xiàng)所述的全人源抗體序列。10.在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供了上述方案1-4任一項(xiàng)所述的全人源抗體，其用于提高全人源抗體ADCC (抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)活力。在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，提供了一種組合物，所述的組合物含有:⑴如上所述的本發(fā)明的全人源抗體；和/或(ii)藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的全人源抗體在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明所述全人源抗體的方法，其包括如下步驟:I)根據(jù)SEQ ID N0.:1_4的抗體序列，設(shè)計(jì)應(yīng)的DNA序列；2)合成DNA序列，可以通過分成幾個(gè)片斷合成后再連接成完整片斷，或采用不同的引物，通過PCR方法合成；3)將合成的抗體DNA片段克隆至表達(dá)質(zhì)粒中；4)轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞；5)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清，純化獲得目的抗體。`


圖1所示為確定重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的PCR產(chǎn)物結(jié)果。圖2所示為SDS-PAGE凝膠確定所述抗體的蛋白電泳圖。圖3所示為ELISA測(cè)定永卓EGFR抗體與EGFR-Fc結(jié)合的示意圖。其結(jié)果表明永卓EGFR抗體I和2都與帕尼單抗(SY-puni) —樣，有一致的EGFR直接結(jié)合活力。說明永卓EGFR抗體I和2識(shí)別EGFR且親和力與帕尼單抗相似。圖4所示為ADCC活力測(cè)定示意圖。其結(jié)果表明永卓EGFR抗體I和2都與愛必妥(cetuximab)有相似的ADCC活力，都顯著高于帕尼單抗。圖5所示為EGFR抗體對(duì)EGFR下游磷酸化的抑制作用的示意圖，本實(shí)驗(yàn)通過Western Blot的方法檢測(cè)總(Total)EGFR和磷酸化后EGFR。下圖Total EGFR顯示總EGFR含量，包括磷酸化和磷酸后EGFR。上圖pEGFR顯示磷酸化后的EGFR含量。泳道1:為分子量標(biāo)記；2:PBS加EGF ；3:PBS未加EGF (2，3為PBS陰性對(duì)照)；4:愛必妥(erbitux)未加EGF ；5:愛必妥加EGF ；6:加永卓EGFR抗體I ；7:加永卓EGFR抗體2 ；8:加帕尼單抗(SY-puni)。結(jié)果說明總EGFR不變的情況下(下圖)，永卓EGFR抗體I和2、愛必妥(erbitux)及帕尼單抗(SY-puni)都能夠顯著抑制EGFR下游磷酸化，從而阻止信號(hào)途徑，進(jìn)一步證明永卓EGFR抗體I和2具有EGFR結(jié)合、抑制下游信號(hào)通路以及潛在的腫瘤細(xì)胞抑制作用。總抗體的陽(yáng)性對(duì)照和PBS的陰性對(duì)照說明本實(shí)驗(yàn)的有效性。
具體實(shí)施例方式提供了以下實(shí)施例以證明并進(jìn)一步解釋本發(fā)明的一些優(yōu)選的實(shí)施方式和方面，不應(yīng)被解釋為限制其范圍。
實(shí)施例1:YZ_EGFR Vl和YZ-EGFR V2抗體序列的設(shè)計(jì)和表達(dá)本發(fā)明可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的基因工程的方法制備目的全人源抗體，本實(shí)施例中僅描述采用通過293-F細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)、獲得分析檢定用抗體樣品的方法，然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，也可以通過細(xì)菌、酵母、病毒和其它真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來制備目的抗體，其中最優(yōu)化的的制備系統(tǒng)是采用中華卵巢倉(cāng)鼠細(xì)胞(CHO)穩(wěn)定細(xì)胞系，來制備、生產(chǎn)本全人源抗體。1.以下為帕尼單抗的重鏈可變區(qū)的序列(SEQ ID No:5)，下劃線部分為框架序列:QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSS⑶YYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIffGQGTMVTVSS以下為IgG2的重鏈恒定區(qū)序列(SEQ ID No:7):ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK以下為IgGl的重鏈恒定區(qū)序列(SEQ ID No:8):ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK將其原有的重鏈IgG2恒定區(qū)序列改換成IgGl恒定區(qū)序列，形成YZ_EGFRvl重鏈序列(SEQ ID No:1) ο將其原有的重鏈可變區(qū)的未優(yōu)化框架序列改換成優(yōu)化框架序列(SEQ IDNo:6),EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSVSS⑶YYWTWIRQAPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRDRVTGAFDIffGQGTLVTVSS再與重鏈IgGl序列結(jié)合，形成YZ-EGFR v2重鏈序列(SEQ ID No:2)。2.以下為帕尼單抗的輕鏈可變區(qū)的序列(SEQ ID No:9)，下劃線部分為框架序列:PIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNffYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIK以下為輕鏈恒定區(qū)CL(k)序列(SEQ ID No:11)RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC將其與輕鏈恒定區(qū)CL(k)序列結(jié)合，即形成YZ-EGFR vl輕鏈序列(SEQID No:3)。將其原有的輕鏈可變區(qū)的未優(yōu)化框架序列改換成優(yōu)化框架序列(SEQ IDNo:10)DIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCQASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQHFDHLPLAFGQGTKVEIK
將其與輕鏈恒定區(qū)CL(k)序列結(jié)合，即形成YZ-EGFR v2的輕鏈序列(SEQID No:4)。3.抗 EGFR 抗體 YZ-EGFR Vl 和 YZ-EGFR V2 的制備本實(shí)施例描述采用通過293-F細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)、獲得分析檢定用抗體樣品的方法，也可以通過細(xì)菌、酵母、病毒和其它真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來制備目的抗體，其中最優(yōu)化的的制備系統(tǒng)是采用中華卵巢倉(cāng)鼠細(xì)胞(CHO)穩(wěn)定細(xì)胞系，來制備、生產(chǎn)本全人源抗體。根據(jù)抗體YZ-EGFR Vl和YZ-EGFR V2重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列，設(shè)計(jì)并合成編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的PCR引物寡核苷酸片段。相鄰寡核苷酸片段約有18個(gè)堿基重疊，PCR引物寡核苷酸片段一般長(zhǎng)約54個(gè)堿基?；旌贤攘康母鱾€(gè)PCR引物片段，進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)。引物片段的核酸序列:每個(gè)抗體 序列有8個(gè)(4對(duì))引物序列，每對(duì)引物序列用來制備YZ-EGFRV1和YZ-EGFRV2 抗體的 VH 和 VL 小外顯子(min1-exon)。YZ-EGFR Vl 重鏈(V1-HC):引物A5’:CAGGTGCAGTTGCAGGAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGAAGCCCTCCGAGACGTTG引物B5’:GCGGCGACTACTACTGGACGTGGATCAGGCAAAGCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGG引物C5’:TACAACCCCAGCCTGAAATCCAGGTTGACCATCTCCATCGACACGAGCAAGACGCAGT引物D5’:ACACCGCCATCTATTACTGCGTGAGGGACAGGGTGACAGGCGCCTTCGACATCTGCT引物A3’:TGGATACGCTGCCGCCGCTCACGGTACAGGTCAGGCTCAACGTCTCGGAGGGCT引物B3’:GTTCGTGTTGCCTGAGTAATAGATGTGGCCGATCCACTCCAGGCCCTTGCCGGGG引物C3’:AGTCACGCTGGACAGTTTCAGGCTGAACTGCGTCTTGCTCGTGTCGATGGAGATG引物D3’:GCTGGACACGGTCACCATCGTTCCCTGGCCCAGCAGATGTCGAAGGCGCCTGTCAYZ-EGFR V2 重鏈(V2-HC):引物A5，:GAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGCTCCCTGA引物B5’:TGGCGATTACTATTGGACCTGGATCAGGCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTG引物C5，:TATAACCCCTCCCTCAAGAGCAGACTGACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAAC引物D5’:ACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGAGATCGAGTGACTGGTGCTTTTGACATCT
權(quán)利要求
1.全人源抗體，其包含如SEQID N0.:1或SEQ ID N0.:2所示的重鏈序列。
2.如權(quán)利要求1所述的全人源抗體，其還包含如SEQID N0.:3或SEQ IDN0.:4所示的輕鏈序列。
3.權(quán)利要求1的全人源抗體，其包含如SEQID N0.:1所示的重鏈序列和SEQ ID N0.:3所示的輕鏈序列。
4.權(quán)利要求1的全人源抗體，其包含如SEQID N0.:2所示的重鏈序列和SEQ ID N0.:4所示的輕鏈序列。
5.DNA分子，其編碼如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的全人源抗體。
6.用于哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)的表達(dá)載體，其為病毒的或非病毒的，并含有編碼權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的全人源抗體的DNA分子。
7.宿主細(xì)胞,其含有如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體。
8.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的全人源抗體在制備用于提高全人源抗體的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性活力的藥物中的用途。
9.組合物，其特征在于，所述的組合物含有: (i)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng) 所述的全人源抗體；和/或 ( )藥學(xué)上可接受的載體。
10.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的全人源抗體在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
11.制備如權(quán)利要求1所述的全人源抗體的方法，其包括以下步驟: 1)根據(jù)權(quán)利要求1-4的全人源抗體，設(shè)計(jì)相應(yīng)的DNA序列； 2)合成DNA序列； 3)將合成的抗體DNA片段克隆至表達(dá)質(zhì)粒中； 4)轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞 5)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清，純化獲得目的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及全人源抗體，其包含經(jīng)改造的重鏈和輕鏈。具體而言，本發(fā)明所述的全人源抗體為經(jīng)改造的全人源單克隆抗體，具體為針對(duì)已經(jīng)上市的全人源抗體帕尼單抗，利用抗體工程技術(shù)平臺(tái)，改變抗體亞型，形成全新序列的抗EGFR全人源抗體分子，從而提高抗體ADCC及抗腫瘤活力。本發(fā)明還涉及制備所述全人源抗體的方法以及所述抗體在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/85GK103172741SQ20111043038
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者劉頡, 張卓兵, 單繼寬, 索偉 申請(qǐng)人:永卓博濟(jì)(上海)生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司, 上海眾合醫(yī)藥科技有限公司