專利名稱：用于轉(zhuǎn)基因玉米Mon810檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因工程技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用為農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域開辟了一個(gè)全新的發(fā)展時(shí)代。自 1983年首例轉(zhuǎn)基因煙草作物問世以來，基因工程技術(shù)發(fā)展日新月異，轉(zhuǎn)基因作物新品種不斷涌現(xiàn)，在短短20多年時(shí)間內(nèi)得到了飛躍發(fā)展，據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用署(ISAAA)的最新資料表明，自1996年到2010年，全球的轉(zhuǎn)基因作物種植總面積增加了 87倍，達(dá)到了 1.48億公頃。與此同時(shí)，大量的遺傳改良農(nóng)產(chǎn)品涌入我國(guó)市場(chǎng)，我國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理辦公室已經(jīng)為棉花、玉米、大豆、油菜四種作物頒發(fā)了安全進(jìn)口證書。轉(zhuǎn)基因玉米有11 個(gè)品系允許進(jìn)口用于加工原料，其中包括轉(zhuǎn)基因玉米Mon810。隨著遺傳改良作物的廣泛種植，轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，可能帶來的環(huán)境問題、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品作為食品、飼料對(duì)人類及動(dòng)物的可能帶來健康問題、國(guó)際貿(mào)易問題、知識(shí)產(chǎn)權(quán)問題等生物安全性問題已引起世界性的廣泛關(guān)注，國(guó)際組織和國(guó)家紛紛制定相應(yīng)的安全管理法規(guī)，加強(qiáng)遺傳改良作物的規(guī)范管理，并對(duì)遺傳改良作物及其產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識(shí)制度。為了應(yīng)對(duì)遺傳改良作物管理相關(guān)的法律法規(guī)和制度，建立高效、快速、特異的檢測(cè)技術(shù)十分必要，它是各國(guó)際組織和國(guó)家管理遺傳改良作物的有力技術(shù)支撐?；诤怂岬木酆厦告湻磻?yīng)(PCR)檢測(cè)技術(shù)因具有高靈敏度和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，已成為目前最重要、應(yīng)用最廣泛的遺傳改良作物及其產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)。PCR檢測(cè)方法建立的主要依據(jù)是特異性的擴(kuò)增遺傳改良植物的外源基因片段。在轉(zhuǎn)基因植物中，穩(wěn)定表達(dá)的外源DNA插入片段一般包括啟動(dòng)子、目的基因和終止子三類元件。針對(duì)擴(kuò)增的外源DNA片段差異，PCR檢測(cè)策略可以分為四種，即通用元件篩選PCR檢測(cè)、基因特異性PCR檢測(cè)、構(gòu)建特異性PCR檢測(cè)和品系特異性 PCR檢測(cè)。篩選PCR檢測(cè)主要是以轉(zhuǎn)基因植物的通用元件和標(biāo)記基因作為特異性擴(kuò)增片段， 由于相同的通用元件和標(biāo)記基因經(jīng)常被用于多種轉(zhuǎn)基因植物的研究與生產(chǎn)中，從而大大降低了篩選PCR檢測(cè)的特異性，但可用于轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)的初步篩選，檢測(cè)到這些通用元件也預(yù)示著檢測(cè)樣品中存在有轉(zhuǎn)基因成分?；蛱禺愋訮CR檢測(cè)以插入外源基因的特異性 DNA片段作為目的檢測(cè)片段，相比篩選PCR特異性增強(qiáng)。但是，由于相同的外源基因可能在相同或不同的植物中表達(dá)形成新的具有相似農(nóng)藝性狀的品系或新的轉(zhuǎn)基因植物，因此基因特異性PCR檢測(cè)方法不能異性的區(qū)分具有相似農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因植物及其品系。構(gòu)建特異性PCR檢測(cè)是通過檢測(cè)外源插入載體中兩個(gè)元件的連接區(qū)DNA序列實(shí)現(xiàn)的。這種方法具有相對(duì)較高的特異性，在轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測(cè)中使用較多。但是由于相同的轉(zhuǎn)基因外源表達(dá)載體在基因轉(zhuǎn)化過程中，可能以一個(gè)、兩個(gè)或者多個(gè)拷貝的形式插入到不同或者相同的植物基因組中，形成具有相同農(nóng)藝性狀的不同的轉(zhuǎn)基因品系，因此構(gòu)建特異性PCR檢測(cè)不能區(qū)分具有相同農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因植物和不同培育品系。品系特異性PCR檢測(cè)是通過檢測(cè)外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列實(shí)現(xiàn)的。由于每個(gè)遺傳改良作物品系，都具有特異性的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，并且連接區(qū)序列是單拷貝的，因此品系特異性檢測(cè)方法具有較篩選、基因特異性和構(gòu)建特異性PCR檢測(cè)方法更高的特異性和準(zhǔn)確性，能夠特異性的檢測(cè)專一的遺傳改良作物品系。雖然，四種PCR檢測(cè)策略特異性有所差異，但各有所長(zhǎng)，目前所建立并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)的PCR方法主要圍繞這四種策略。在實(shí)際檢測(cè)中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)十分重要。然而，由于專利權(quán)和現(xiàn)有技術(shù)的限制，遺傳改良作物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的獲得相對(duì)較難。目前，用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要是用純合的轉(zhuǎn)基因植物材料配置的，到目前為止僅得到了十幾種遺傳改良作物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在市場(chǎng)上銷售。但這類來源于農(nóng)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其必須有專門的研究機(jī)構(gòu)來制備，貯存和測(cè)定過程受很多因素影響，很難維持恒定的量，而且，這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因含量范圍一般是從0. 1% 到5%，而實(shí)際檢測(cè)的樣品中的轉(zhuǎn)基因含量可能會(huì)超出這個(gè)范圍。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的缺乏已成為檢測(cè)方法建立和應(yīng)用的瓶頸，阻礙了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度的順利實(shí)施。標(biāo)準(zhǔn)分子的概念由日本科學(xué)家Kuribara等于2002年提出，它是指一種含有轉(zhuǎn)基因檢測(cè)目的外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性片段的線性化重組質(zhì)粒分子。經(jīng)驗(yàn)證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在遺傳改良作物鑒定檢測(cè)中是很好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)替代物。質(zhì)粒分子的優(yōu)點(diǎn)主要是可以通過微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，純度較高；且操作容易，穩(wěn)定性高，同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分子可以同時(shí)包含多個(gè)外源目的基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，經(jīng)濟(jì)高效。近年來，越來越受到各國(guó)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)專家和學(xué)者們的重視，并逐漸取代傳統(tǒng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品用于轉(zhuǎn)基因品系及其加工產(chǎn)品的定量PCR檢測(cè)。現(xiàn)在文獻(xiàn)報(bào)道的用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子中，涉及轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的有 pMul5、pMD-ZM、p3SNTM_9和ERM-AD413等，但是它們有的只能用于檢測(cè)構(gòu)建特異與篩選特異性，有的只能用于檢測(cè)品系特異性，不能滿足一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)篩選特異性檢測(cè)、基因特異性檢測(cè)、構(gòu)建特異性檢測(cè)和品系特異性檢測(cè)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法，具體涉及轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO篩選特異性檢測(cè)、基因特異性檢測(cè)、構(gòu)建特異性檢測(cè)和品系特異性檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法，使其可以代替轉(zhuǎn)基因玉米 MonSlO的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于遺傳改良玉米的定性、定量PCR檢測(cè)。根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的品系特異性序列、構(gòu)建特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因序列， 首先利用重疊PCR反應(yīng)的原理設(shè)計(jì)特異PCR引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的品系特異性序列和構(gòu)建特異性序列的重組DNA片段，利用分子克隆技術(shù)將重組DNA片段克隆到PMD18-T載體中。然后，利用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因^的一段序列，按照設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)連接到PMD18-T質(zhì)粒中重組DNA片段的上游，獲得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，命名為PMHZ。本發(fā)明構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMHZ可代替轉(zhuǎn)基因玉米Mon810原有的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于定性和定量PCR檢測(cè)，徹底解決轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題。同時(shí)，該質(zhì)粒含有和序列，可以用于其他含有
啟動(dòng)子和(b)的轉(zhuǎn)基因品系的定性和定量檢測(cè)。本發(fā)明所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMHZ，同時(shí)含有轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的品系特異性序列、 構(gòu)建特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的一段序列，用以代替轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，
5可用于轉(zhuǎn)基因玉米Mon810定性和定量PCR檢測(cè)。本發(fā)明所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMHZ構(gòu)建方法，包括如下步驟
①利用GenBank等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的品系特異性序列、構(gòu)建特異性序列和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb特異性序列。所述的轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的品系特異性序列，指的是轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO外源插入載體與玉米基因組鄰接區(qū)的一段DNA序列，其序列如^^ ID No:l所示。所述的構(gòu)建特異性序列，指的是外源插入載體的#^770和cryIA (b)兩個(gè)元件的連接區(qū)的一段DNA序列，其序列如kq ID No:2所示。所述的玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因ζ5^/Λ，指的是編碼玉米淀粉合酶異構(gòu)體^JM II ~2的基因，其在玉米基因組中高度保守，具有種間特異性、種內(nèi)非特異性和單拷貝數(shù)的特點(diǎn)；玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb GenBank中登錄號(hào)為AF019297。所述的玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb特異性序列，指的是玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的^6nt-536nt，其序列如kq ID No:3所示。②設(shè)計(jì)PCR特異引物。所述的PCR特異性引物，指的是與玉米遺傳改良品系MonSlO的品系特異性序列、 構(gòu)建特異性序列和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因基因序列完全相同或互補(bǔ)的寡聚核苷酸鏈，分別為
MT--F,其序列如^^ ID No:4所示，MT--R,其序列如^^ ID No:5所示，用于擴(kuò)增MonSlO玉米的品系特異性序列；HC-"F,其序列如^^ ID No:6所示，HC--R,其序列如^^ ID No:7所示，用于擴(kuò)增MonSlO玉米的構(gòu)建特異性序列；ZB-"F,其序列如^^ ID No:8所示，ZB--R,其序列如％(1 ID No:9所示，用于擴(kuò)增玉米的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSUb基因的特異性序列。③特異性擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的品系特異性序列、構(gòu)建特異性序列和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因^的特異性序列。所述的特異性擴(kuò)增，指的是利用設(shè)計(jì)的PCR引物分別擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的品系特異性序列(Seq ID No: 1)、構(gòu)建特異性序列(Seq ID No2)和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSUb的特異性序列(Seq ID No:3)。③轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的品系特異性序列和構(gòu)建特異性序列的拼接。所述的拼接，指的是利用重疊PCR技術(shù)將轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的品系特異性序列和構(gòu)建特異性序列連接融合成一個(gè)重組的DNA片段，其序列如％(1 ID No: 10所示。④重組DNA片段及玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因^的特異性片段克隆進(jìn)入pMDIS-T載體
首先將上述得到的重組DNA片段用酶切位點(diǎn)I和歷^d III連接到質(zhì)粒載體 PMD18-T (TAKARA公司)中；然后將PCR特異性擴(kuò)增的玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的DNA片段 (Seq ID No: 11)用酶切位點(diǎn)召a H I和I連接到pMD18_T質(zhì)粒中重組DNA片段的上游，因此獲得將轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的品系特異性序列、構(gòu)建特異序列以及玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性序列融合在pMD18-T上的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMHZ，其序列如kq ID No: 12所
7J\ ο
⑤標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMHZ的定性和定量PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證。所述的定性PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證，是指利用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMHZ構(gòu)建的品系特異性片段只能在轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO基因組DNA中擴(kuò)展獲得，而不能在其他玉米品系，和其他遺傳改良作物基因組中擴(kuò)增得到。所述的定量PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證，是指檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMHZ在進(jìn)行定量PCR分析時(shí)的特異性、靈敏度、重復(fù)性和重演性等特性，以鑒定該標(biāo)準(zhǔn)分子替代轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO 陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的能力，以及實(shí)際應(yīng)用于定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的測(cè)定有效性。本發(fā)明的有益效果在于，利用重疊PCR和分子亞克隆的方法首次構(gòu)建了含有玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因特異性序列和轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的品系特異性序列和構(gòu)建特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMHZ。本發(fā)明中制備的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMHZ可以代替轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，很好的解決了該品系檢測(cè)過程中陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的問題。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子 PMHZ對(duì)實(shí)際樣品分析的結(jié)果比較準(zhǔn)確，檢測(cè)結(jié)果的偏差在ISO遺傳改良食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)允許的0-0. 25范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子完全適用于對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO 樣品及其加工產(chǎn)品中的遺傳改良成分進(jìn)行定量分析。


圖1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMHZ的示意圖中PMD-18T表示構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的載體；FcoR I表示該位點(diǎn)含有限制性內(nèi)切酶 EcoR I的酶切位點(diǎn).,BeuM I表示該位點(diǎn)含有限制性內(nèi)切酶漢3 H I的酶切位點(diǎn)-’Η η III表示該位點(diǎn)含有限制性內(nèi)切酶歷id III的酶切位點(diǎn)，“zSSnb”表示玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb 的一段特異性序列；“品系特異性序列”表示轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO外源插入載體與玉米基因組鄰接區(qū)的一段DNA序列；“構(gòu)建特異性序列”表示外源插入載體的/&/770和以O(shè)J兩個(gè)元件的連接區(qū)的一段DNA序列。
具體實(shí)施例方式下面以實(shí)施例為例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1 標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建
1、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子PMHZ的PCR引物序列設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank中公布的轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO外源插入載體與玉米基因組鄰接區(qū)的基因序列(登錄號(hào)AF434709 )，外源載體主要元件的序列信息(登錄號(hào)AY326434 )以及玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb的序列信息(登錄號(hào)AF019297)，利用軟件I^rimer 5. O設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物 (如表1)，分別為
MT-F,其序列如^^ ID No 4所示，序列3-8堿基對(duì)處為漢3 H I的酶切位點(diǎn)， MT-R,其序列如^^ ID No:5所示；MT-F位于玉米基因組上，MT-R位于轉(zhuǎn)基因玉米 MonSlO的外源插入載體的dK 仍啟動(dòng)子序列上，用于擴(kuò)增MonSlO玉米的品系特異性序列；
HC-F,其序列如^^ ID No:6所示，
HC-R,其序列如^^ ID No:7所示，序列3-8堿基對(duì)處為歷·/ (! III的酶切位點(diǎn)；HC-F\好HsP70序列上，HC-R位于cryIA (b)序列上，用于擴(kuò)增Mon810玉米的外源插入載體的 HsP70熱cryIA 兩個(gè)元件的連接區(qū)的構(gòu)建特異性序列；
ZB-F,其序列如^^ ID No 8所示，序列3-8堿基對(duì)處為I的酶切位點(diǎn)， ZB-R,其序列如^^ ID No:9所示，序列3-8堿基對(duì)處為漢3 H I的酶切位點(diǎn)，用于擴(kuò)增玉米的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的特異性序列。 2、轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因序列、品系特異性序列和構(gòu)建特異性序列的擴(kuò)增
以轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO基因組DNA為模板，利用以下設(shè)計(jì)的三對(duì)引物分別對(duì)玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的特異性序列(位于玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb 296nt-536nt)、品系特異性序列和構(gòu)建特異性序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件均為 PCR反應(yīng)體積為50 μ 1，包括以下成分 IOXPCR緩沖液5μ1dNTPs
上游引物(20 μ M) 下游引物(20 μ Μ) 模板
Taq DNA聚合酶 (MH9O
4μ 1 1 μ 1 1 μ 1 5 μ 1 0. 5μ 1 33. 5μ 1
PCR反應(yīng)條件為94°C 5分鐘；然后進(jìn)入以下循環(huán)94°C 50秒，55°C 50秒，72°C 60 秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后得到了長(zhǎng)257bp的玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因片段(其序列如kq ID No:10 所示)、長(zhǎng)392bp的品系特異性序列片段(其序列如kq ID No: 13所示)和長(zhǎng)440bp的外源插入載體的構(gòu)建特異性序列片段(其序列如^^ ID No:14所示)，將上述PCR擴(kuò)增得到的品系特異性序列片段和構(gòu)建特異性序列片段產(chǎn)物分別記為PMT和PHC。對(duì)擴(kuò)增得到的條帶進(jìn)行回收純化，通過測(cè)序分析表明獲得的序列與目的擴(kuò)增片段序列一致。表1.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMHZ的PCR引物序列
權(quán)利要求
1.一種用于轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其特征在于其核苷酸序列如％(1 ID No: 12 所示。
2.一種如權(quán)利1所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟①利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得遺傳改良玉米品系MonSlO品系特異性序列，其序列如kq ID No:l所示；和構(gòu)建特異性序列，其序列如kq ID No:2所示；和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSnb的特異性序列，其序列如kq ID No:3所示；②設(shè)計(jì)PCR特異性引物；上游引物MT-F，其序列如^^ ID No:4所示，下游引物MT-R，其序列如^^ ID No:5所示，用于擴(kuò)增MonSlO玉米的品系特異性序列；上游引物HC-F，其序列如^^ ID No:6所示，下游引物HC-R，其序列如％(1 ID No:7所示，用于擴(kuò)增MonSlO玉米的構(gòu)建特異性序列；上游引物JB-F，其序列如^^ ID No:8所示，下游引物ZB-R，其序列如^^ ID No:9所示，用于擴(kuò)增玉米的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSnb基因的特異性序列；③利用步驟②中所述的特異性引物分別擴(kuò)增遺傳改良玉米品系MonSlO品系特異性序列、構(gòu)建特異性序列和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性序列擴(kuò)增條件均為PCR反應(yīng)體積為50 μ 1，包括以下成分 IOXPCR緩沖液5μ1PCR反應(yīng)條件為94°C 5分鐘；然后進(jìn)入以下循環(huán)94°C 50秒，55°C 50秒，72°C 60 秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘；將PCR擴(kuò)增得到的品系特異性序列片段和構(gòu)建特異性序列片段產(chǎn)物分別命名為為PMT 禾口 PHC ；④遺傳改良玉米品系MonSlO品系特異性序列和構(gòu)建特異性序列的拼接 用上述PCR得到的品系特異性序列產(chǎn)物PMT和構(gòu)建特異序列產(chǎn)物PHC為模板，以MT-F 和HC-R作為重疊PCR的引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)品系特異性序列和構(gòu)建特異序列的重組拼接；重疊PCR分兩步擴(kuò)增 第一步擴(kuò)增的條件為 PCR反應(yīng)體積為50 μ 1，包括以下成分dNTPs上游引物(20 μ M) 下游引物(20 μ Μ) 模板Taq DNA聚合酶 (MH9O4μ 1 1 μ 1 1 μ 1 5 μ 1 0. 5μ 1 33. 5μ 1`10XPCR緩沖液 dNTPs PMT PHCTaq DNA聚合酶 ddH90`5 μ 1`4μ 1 5 μ 1 5 μ 1 0. 5μ 1 30. 5μ 1PCR反應(yīng)條件為94°C 4分鐘；然后進(jìn)入以下循環(huán)94°C 1分鐘，60°C 4分鐘，共7 1 循環(huán)；第二步擴(kuò)增條件為 PCR反應(yīng)體積為100 μ 1，包括以下成分 10XPCR緩沖液5μ1dNTPsMT-F (20 μ Μ) HC-R (20 μ Μ)4μ 1 1 μ 1 1 μ 1 50 μ 1`0. 5μ 1上步PCR反應(yīng)產(chǎn)物 Taq DNA聚合酶ddH2038. 5 μ 1PCR反應(yīng)條件為94°C 4分鐘；然后進(jìn)入以下循環(huán)94°C 1分鐘，55°C 2分鐘72°C 2 分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘；經(jīng)過重疊PCR擴(kuò)增得到814bp的品系特異性序列和構(gòu)建特異序列的重組片段，其序列如 Seq ID No: 10 所示；⑤重組DNA片段及玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的特異性片段克隆進(jìn)入pMDIS-T載體首先用限制性內(nèi)切酶漢3 H I和歷^d III將上述得到的重組DNA片段kq ID No:10 和pMDIS-T載體分別進(jìn)行雙酶切；然后用T4連接酶將二者連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α細(xì)胞， 并在含氨芐青霉素的LB固體平板上培養(yǎng)，篩選陽性克??；使用Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒抽提獲得含重組DNA片段的pMD18-T重組質(zhì)粒；接著用限制性內(nèi)切酶漢3 Η I和feoR I將PCR 特異性擴(kuò)增的玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因^的DNA片段(Seq ID No: 11)和含有重組DNA片段的 PMD18-T重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切；然后用T4連接酶將二者連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α細(xì)胞，并在含氨芐青霉素的LB固體平板上培養(yǎng)，篩選陽性克??；使用Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒抽提獲得將遺傳改良玉米品系MonSlO的品系特異性序列、構(gòu)建特異序列以及玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的特異性序列融合在pMD18-T上的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMHZ。
3.如權(quán)利要求1所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子在定量PCR檢測(cè)遺傳改良玉米品系MonSlO中的應(yīng)用，其特征在于可以代替遺傳改良玉米品系MonSlO的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)遺傳改良玉米品系MonSlO樣品及其加工產(chǎn)品中的遺傳改良成分進(jìn)行定量分析。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種遺傳改良玉米品系Mon810檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法。所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子包含遺傳改良玉米品系Mon810的品系特異性序列、構(gòu)建特異性序列和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb特異性片段；通過對(duì)遺傳改良玉米品系Mon810的外源插入載體邊界序列及Hsp70和cryIA(b)兩個(gè)元件的連接區(qū)的序列分析，設(shè)計(jì)品系特異性和構(gòu)建特異性PCR引物，擴(kuò)增獲得遺傳改良玉米品系Mon810的品系特異性片段和構(gòu)建特異性片段，以及玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因特異性序列；通過分子克隆的方法構(gòu)建到一個(gè)質(zhì)粒分子中，獲得人工重組質(zhì)粒分子pMHZ。本發(fā)明構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子完全可以替代遺傳改良玉米品系Mon810陽性標(biāo)準(zhǔn)品，用于對(duì)遺傳改良玉米品系Mon810樣品的定量PCR分析和檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102492777SQ201110430440
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者李文華, 楊正友, 田園, 趙鳳春, 郭燕風(fēng) 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)