專利名稱：幾丁質(zhì)酶的四膜蟲(chóng)表達(dá)載體及其在表達(dá)幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種幾丁質(zhì)酶的四膜蟲(chóng)表達(dá)載體及其在表達(dá)幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
幾丁質(zhì)(Chitin)又稱甲殼素或殼多糖，是以N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)為單體，通過(guò)β _1，4糖苷鍵連接而成的生物多聚體，是自然界中除纖維素外儲(chǔ)量最大的生物多聚糖，每年生物合成量達(dá)100億噸。幾丁質(zhì)至今已陸續(xù)在微生物、植物、動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，尤其是在真菌細(xì)胞壁、節(jié)肢動(dòng)物外骨骼、甲殼類動(dòng)物的外殼中，幾丁質(zhì)維系其穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)物質(zhì)， 是絕大部分真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，占細(xì)胞壁干重的40% -60%。
幾丁質(zhì)具有良好的生物相容性、生物降解性，在生物化工、食品、環(huán)保、農(nóng)藥等各種領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用前景。幾丁質(zhì)同時(shí)也具有抗菌、降膽固醇和抗腫瘤的活性。幾丁質(zhì)及相關(guān)材料也被應(yīng)用于污水處理、藥物輸送、傷口的治愈以及作日常的膳食纖維。但因?yàn)榉肿恿看?、晶體結(jié)構(gòu)緊密、不溶于水和普通溶劑，限制了幾丁質(zhì)的應(yīng)用。目前一般用化學(xué)降解的方法來(lái)制取幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物，但該方法造成較嚴(yán)重的環(huán)境污染，而用幾丁質(zhì)酶降解法能克服這個(gè)缺點(diǎn)，而且能控制降解的程度。
廣義的幾丁質(zhì)酶是指所有與幾丁質(zhì)降解有關(guān)的酶，除了狹義的幾丁質(zhì)酶，還包括脫乙酰酶、殼聚糖酶、幾丁寡糖酶、幾丁二糖酶等。狹義的幾丁質(zhì)酶是指催化水解至少含有一個(gè)Ν2乙酰葡萄糖胺基團(tuán)糖苷鍵的酶，包括幾丁內(nèi)切酶和幾丁外切酶。幾丁質(zhì)酶 (Chitinases)廣泛的存在于病毒、細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)、高等植物和動(dòng)物中，并且發(fā)揮著作不同的作用。從微生物中分離篩選幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的報(bào)道最近越來(lái)越多，絕大多數(shù)的細(xì)菌性幾丁質(zhì)酶屬于第18家族，其主要功能是分解周圍環(huán)境中的幾丁質(zhì)，以滿足其自身對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求，而對(duì)真菌的抑制能力較弱或無(wú)。植物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶大部分為第19族糖基化水解酶類，其功能主要是抑制病原真菌的生長(zhǎng)，進(jìn)行自我防御。
現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)很多。動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)因成本高，使其應(yīng)用受到限制。常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然具有外源基因表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)，但是因其缺乏真核生物轉(zhuǎn)錄后加工及翻譯后加工等功能，其表達(dá)的產(chǎn)物往往活性不高或是無(wú)活性等，特別是用其表達(dá)真核蛋白時(shí)。酵母表達(dá)系統(tǒng)與動(dòng)物細(xì)胞一樣具有真核生物轉(zhuǎn)錄、翻譯后的多種加工過(guò)程，能夠表達(dá)出多種具有活性的外源蛋白而備受關(guān)注，但也存在著明顯的局限，如以釀酒酵母為主體的表達(dá)系統(tǒng)中缺乏強(qiáng)有力的啟動(dòng)子、分泌效率差、質(zhì)粒不穩(wěn)定、難以達(dá)到很高發(fā)酵密度、只能分泌少量蛋白、表達(dá)的蛋白質(zhì)容易降解、其翻譯后加工與高等真核生物有所不同等。
四膜蟲(chóng)(Tetrahymena)隸屬于原生動(dòng)物亞門、纖毛亞門、寡膜綱、膜口目、四膜科屬，是單細(xì)胞真核生物。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種幾丁質(zhì)酶的四膜蟲(chóng)表達(dá)載體及其在表達(dá)幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的DNA片段(幾丁質(zhì)酶的編碼基因的表達(dá)盒)，自5’至3’方向依次包括HSP70-2基因啟動(dòng)子、幾丁質(zhì)酶的編碼基因和HSP70-1基因終止信號(hào)；所述HSP70-2基因啟動(dòng)子如序列表的序列1自5’末端第9至11 位核苷酸所示；所述HSP70-1基因終止信號(hào)如序列表的序列1自5’末端第3835至4304位核苷酸所示；所述幾丁質(zhì)酶如序列表的序列2所示。四膜蟲(chóng)的HSP70-2基因啟動(dòng)子能高效啟動(dòng)幾丁質(zhì)酶的編碼基因(CBD3基因)的表達(dá)。
所述幾丁質(zhì)酶的編碼基因具體可如序列表的序列1自5’末端第1142至3820位核苷酸所示。
所述DNA片段具體可如序列表的序列1自5，末端第9至4304位核苷酸所示。
含有所述DNA片段的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。 翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于鑒定及篩選，可對(duì)所用表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。
所述重組表達(dá)載體具體可為在質(zhì)粒pD5H8的多克隆位點(diǎn)插入所述DNA片段得到的重組質(zhì)粒(幾丁質(zhì)酶的四膜蟲(chóng)rDNA表達(dá)載體)。該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到四膜蟲(chóng)后，在巴龍霉素藥物篩選作用下，能替換掉四膜蟲(chóng)體內(nèi)原有的大部分rDNA，使外源基因在四膜蟲(chóng)體內(nèi)大量倍增，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化，在熱激條件下(39°C熱激誘導(dǎo)1小時(shí))，HSP70-2強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)CBD3基因的高效表達(dá)，而且表達(dá)的幾丁質(zhì)酶具有生物活性(能水解幾丁質(zhì))。
所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系具體可為將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入四膜蟲(chóng)得到的轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)。
所述轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)具體可通過(guò)如下方法得到將分別饑餓處理18-24小時(shí)的嗜熱四膜蟲(chóng)B2086株系和嗜熱四膜蟲(chóng)CU^S株系按等數(shù)量混合結(jié)合10小時(shí)后與所述重組質(zhì)?；靹颍M(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，得到表達(dá)所述幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)。
所述電擊轉(zhuǎn)化的具體參數(shù)為300V，25yF，50Q。
所述重組表達(dá)載體或所述轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)可用于生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶。
本發(fā)明還保護(hù)一種制備幾丁質(zhì)酶的方法，是培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)，使所述轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)表達(dá)幾丁質(zhì)酶。所述方法中還包括熱激處理的步驟，具體可為39°C熱激1小時(shí)。 所述方法具體可包括如下步驟將所述轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)在SPP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá) 2X105個(gè)/ml，然后39°C熱激1小時(shí)，收集細(xì)胞并超聲波破碎(超聲破碎的具體參數(shù)為Φ2 探頭，功率200W，破碎10s、間歇30s，共超聲破碎5min)，過(guò)濾并收集濾液，即為含有幾丁質(zhì)酶的溶液。
本發(fā)明提供的制備幾丁質(zhì)酶的方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)
(1)四膜蟲(chóng)廣泛分布于全球各地的淡水環(huán)境中，以攝取水中的細(xì)菌與其他有機(jī)質(zhì)維生，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)造成人體疾病或?qū)θ祟惤】翟斐晌：Γ运哪はx(chóng)為表達(dá)系統(tǒng)，安全性可罪。
(2)嗜熱四膜蟲(chóng)作為真核生物，具有原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所缺乏的真核生物轉(zhuǎn)錄后加工及翻譯后加工等功能。
(3)與其它細(xì)胞系(如哺乳動(dòng)物體細(xì)胞)相比，四膜蟲(chóng)為單細(xì)胞生物，作為第一種實(shí)現(xiàn)細(xì)胞同步化的真核生物可以進(jìn)行無(wú)菌純培養(yǎng)，培養(yǎng)更簡(jiǎn)單、快速和經(jīng)濟(jì)，操作精確度和可控制性強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)室中，四膜蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)快速小時(shí)一代)；同時(shí)四膜蟲(chóng)生活周期短且具備真核生物基本生命過(guò)程，并且不具有類似于酵母的復(fù)雜胞壁結(jié)構(gòu)，卻含有可觀的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)；四膜蟲(chóng)中表達(dá)蛋白只有簡(jiǎn)單的N-糖基化，不存在如酵母中豐富的甘露糖殘基修飾，植物中豐富的木糖殘基修飾等非哺乳動(dòng)物中的修飾類型，其獨(dú)特的生物學(xué)使其能夠作為理想的表達(dá)系統(tǒng)。
(4)只需將含有外源蛋白編碼基因的四膜蟲(chóng)表達(dá)載體經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)染到四膜蟲(chóng)體內(nèi)即可。
綜上所述，本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1為質(zhì)粒pD5H8的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為重組質(zhì)粒pD5H8-CBD3的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖3為重組質(zhì)粒pD5H8-CBD3的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4為轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)的PCR鑒定電泳圖。
圖5為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例中采用Beckman庫(kù)爾特細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算細(xì)胞密度。實(shí)施例中均采用水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)(湘儀TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī))進(jìn)行四膜蟲(chóng)細(xì)胞的離心。實(shí)施例中所用的 Tris緩沖液為IOmM, ρΗ7· 5的Tris緩沖液。實(shí)施例中所用的Hepes緩沖液為IOmM, ρΗ7· 5 的!fepes緩沖液(Sigma公司產(chǎn)品)。四膜蟲(chóng)中密碼子TAA、TAG非終止子，均編碼谷氨酰胺。
質(zhì)粒pD5H8(結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1)嗜熱四膜蟲(chóng)的rDNA載體；參考文獻(xiàn)Gaertig J, Gorovsky MA. Efficient mass transformation of Tetrahymena thermophila by electroporation of conjugants. Proc Natl Acad Sci USA. 1992,89(19) :9196_9200。
嗜熱四膜蟲(chóng)CTetrahymena thermophila)B2086 株系和嗜熱四膜蟲(chóng) CTetrahymena thermophila) CU428 株系參考文獻(xiàn)Hamilton 與 Orias (Hamilton EP, Orias Ε. Genetic crosses setting up crosses, testing progeny, and isolating phenotypicassortants. Method Cell Biol :Tetrahymena thermophila. Academic press. 2000, vol 62 :219-228)。
SPP 培養(yǎng)基配方參考 Orias 等(Orias Ε, HamiIton EP, Orias JD. Tetrahymena as a laboratory organism :useful strains, cell culture, and cell line maintenance. Method Cell Biol :Tetrahymena thermophila. Academic press. 2000. vol 62:194·。SPP 培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成；溶劑為水；溶質(zhì)及其在SPP培養(yǎng)基中的濃度如下(質(zhì)量比) Proteose peptore (Difco 公司產(chǎn)品)、0· 1 % (質(zhì)量比)yeast extract (Oxoid 公司產(chǎn)品)、 0. 2% (質(zhì)量比)glucose (分析純，廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品)、0· 003% Ferriccitrate (Sigma 公司產(chǎn)品)。
電穿孑L技術(shù)方法參考 Gaertig J 等(Gaertig J, Gorovsky MA. Gene transfer by electroporation in Tetrahymena. Methods Mol Biol. 1995 ；47 :331-48 ；J Gaertig, L Gu, B Hai, and M A Gorovsky. High frequency vector-mediated transformation and gene replacement in Tetrahymena. Nucleic Acids Res. 1994 December 11 ；22 (24) 5391-5398.)。
四膜蟲(chóng)細(xì)胞的固定、計(jì)數(shù)方法參考章宗涉、黃祥飛編著的《淡水浮游生物研究方法》(北京科學(xué)出版社。1991 :334-339。)。
實(shí)施例1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
1、制備序列表的序列1所示的DNA片段0312bp)，用限制性內(nèi)切酶Not I酶切并回收酶切產(chǎn)物。
序列表的序列1所示的DNA片段中，自5’末端第1至8位核苷酸為Not I酶切識(shí)別序列、第9至1126位核苷酸為HSP70-2基因啟動(dòng)子(HSP70_25，UTR)、第1142至3820位核苷酸為幾丁質(zhì)酶的編碼基因(CBD3基因)、第3835至4304位核苷酸為HSP70-1基因終止信號(hào)(HSP70-13，UTR)、第4305至4312位核苷酸為Not I酶切識(shí)別序列。
序列表的序列1所示的DNA片段可以人工合成。
序列表的序列1所示的DNA片段也可以按如下方法制備
(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒 T-HSP702-HGFP
①以質(zhì)粒Pet23a-hgfp (湖北大學(xué)馬立新教授惠贈(zèng))為模板，用hgfp_F和hgfp-R 組成的弓I物對(duì)PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并用限制性內(nèi)切酶Bgl II和Biol I雙酶切，回收約1. 2kb的HGFP片段。
hgfp-F :5’ -CGGAAGATCTACCAAACCTGACTTGGCTGCAGAATTGTGAGCGCTCTAGAGGATAC T-3，；
hgfp-R 5’ -CCGCCGCTCGAGTCAGCCAAACCTCACTTGGCGATCCCGCGAAATTAATACG-3’。
②限制性內(nèi)切酶Bgl II和Xhol I雙酶切HSP702-GFP_Bgl II載體(實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)，回收約4. 71Λ的載體骨架。
③將步驟①的HGFP片段和步驟②的載體骨架連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)綠色熒光篩選標(biāo)記篩選得到重組質(zhì)粒T-HSP702-HGFP。
(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒 T-HSP702-CBD3
①用限制性內(nèi)切酶以)(cml酶切重組質(zhì)粒T-HSP702-HGFP，回收約4. 7kb的DNA片段；6
②以質(zhì)粒pET_30a (+) -CBD3 (中國(guó)科學(xué)院飼料研究所周志剛老師構(gòu)建)為模板，用 CBD3-F和CBD3-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收約2. 7kp的CBD3片段。
CBD3-F 5' -ATGCACCATCATCATCATCATTGGAAGCCCTATGGTGGCGA-3’ ；
CBD3-R 5’ -TCAGGCCTTGTAGGCCGCC-3 ’。
③將步驟①的DNA片段和步驟②的CBD3片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)綠色熒光篩選標(biāo)記篩選得到重組質(zhì)粒T-HSP702-CBD3。
(3)序列表的序列1所示的DNA片段的獲得
用限制性內(nèi)切酶Not I單酶切處理重組質(zhì)粒T-HSP702-CBD3，回收酶切產(chǎn)物，即約 4. 3kb 的 Not I-HSP70-2 5，UTR-CBD3-HSP70_1 3'UTR-Not I 片段，即序列表的序列表的序列1所示的DNA片段。
2、用限制性內(nèi)切酶Not I酶切質(zhì)粒pD5H8，回收載體骨架(約13. 8kb)。
3、將步驟1的酶切產(chǎn)物和去磷酸化處理后的步驟2的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pD5H8-CBD3 (幾丁質(zhì)酶的四膜蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體)。
4、將重組質(zhì)粒pD5H8-CBD3進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見(jiàn)圖2 (泳道1為 λ -EcoT14 Idigest DNA maker，其條帶大小依次為 19329bp，7743bp，622!3bp，42Mbp， 3472bp,2690bp, 1882bp, 1489bp，925bp ；泳道 2-6 為重組質(zhì)粒 pD5H8_CBD3，約為 17. 8kb)。
5、將重組質(zhì)粒pD5H8-CBD3進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pD5H8_CBD3進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在質(zhì)粒PD5H8的Not I酶切位點(diǎn)插入了序列表的序列1所示的DNA。重組質(zhì)粒PD5H8-CBD3的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖3。
實(shí)施例2、利用四膜蟲(chóng)表達(dá)幾丁質(zhì)酶
一、將重組質(zhì)粒pD5H8-CBD3轉(zhuǎn)染四膜蟲(chóng)
1、四膜蟲(chóng)的饑餓處理
(1)將嗜熱四膜蟲(chóng)(嗜熱四膜蟲(chóng)B2086株系或⑶4 株系)轉(zhuǎn)接到50ml SPP培養(yǎng)基Q50ml的錐形瓶?jī)?nèi))，在轉(zhuǎn)速為160rpm的搖床上30°C培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到3_5X IO5個(gè) /ml (約18小時(shí))。
(2)將步驟(1)的培養(yǎng)體系(50ml)轉(zhuǎn)到50ml離心管內(nèi)，30°C下IOOOg離心2min， 收集沉淀(四膜蟲(chóng))，用50ml 30°C溫育過(guò)的Tris緩沖液清洗2次。
(3)向50ml離心管中(含步驟O)的沉淀)加入少量30°C溫育過(guò)的Tris緩沖液，輕緩振蕩開(kāi)沉淀，然后將管內(nèi)液體及四膜蟲(chóng)全部轉(zhuǎn)移到無(wú)菌錐形瓶中，用30°C溫育過(guò)的 Tris緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度至3X IO5個(gè)/ml ；30°C恒溫水浴靜置2小時(shí)后，再次進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用30°C溫育過(guò)的Tris緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度至2X IO5個(gè)/ml，即為四膜蟲(chóng)懸液。
分別得到B2086株系懸液和⑶似8株系懸液，饑餓處理總時(shí)間為18- 小時(shí)。
2、將B2086株系懸液和⑶4 株系懸液按等細(xì)胞個(gè)數(shù)置于同一個(gè)2L錐形瓶?jī)?nèi)混合，混合均勻后30°C下靜置培養(yǎng)(靜置Ih后細(xì)胞開(kāi)始配對(duì))，靜置培養(yǎng)4小時(shí)后定時(shí)取樣用魯哥染色液固定后在光鏡下檢查配對(duì)率(配對(duì)率達(dá)到80%以上)，靜置培養(yǎng)10小時(shí)后30°C 下IOOOg離心aiiin，收集配對(duì)的四膜蟲(chóng)。
3、用30°C溫育過(guò)的!fepes緩沖液(10mM，PH7. 5)清洗步驟2中收集的配對(duì)的四膜蟲(chóng)1次，然后懸浮于125 μ 1 30°C溫育過(guò)的H印es緩沖液。
4、將步驟3的懸浮液與30°C溫育的50 μ g重組質(zhì)粒pD5H8_CBD3混勻，迅速轉(zhuǎn)移到30°C溫育的0. 2cm電擊杯(Bio-Rad公司產(chǎn)品)中，用Bio-Rad電穿孔儀進(jìn)行電擊(電擊參數(shù)為300V，25yF，50Q)，電擊后的電擊杯于室溫靜置lmin。
二、轉(zhuǎn)染后四膜蟲(chóng)的培養(yǎng)及篩選
轉(zhuǎn)染后四膜蟲(chóng)的培養(yǎng)及篩選的環(huán)境為30°C恒溫箱內(nèi)、無(wú)菌操作，具體步驟如下
1、將電擊杯內(nèi)的四膜蟲(chóng)用粗口吸管輕緩轉(zhuǎn)移到30°C溫育的裝有2細(xì)1 SPP培養(yǎng)基的錐形瓶中，30°C恒溫靜置1小時(shí)，然后均勻分裝到96孔一次性培養(yǎng)皿中。
2、電擊12-16小時(shí)后加巴龍霉素(Sigma公司產(chǎn)品)，使每孔內(nèi)的巴龍霉素濃度達(dá)到 ΙΟΟμ g/ml。
3、電擊后第3天，觀察培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，轉(zhuǎn)移至新的96孔一次性培養(yǎng)皿中 (每孔20 μ 1)，每孔加200 μ 1 SPP培養(yǎng)基(含200 μ g/ml巴龍霉素)。
4、電擊后第4天，轉(zhuǎn)移至新的96孔一次性培養(yǎng)皿中(每孔20 μ 1)，每孔加 200 μ ISPP培養(yǎng)基(含400 μ g/ml巴龍霉素)。
5、電擊后第5天，轉(zhuǎn)移至新的96孔一次性培養(yǎng)皿中(每孔20 μ 1)，每孔加 200 μ ISPP培養(yǎng)基(含600 μ g/ml巴龍霉素)。
6、電擊后第6天，轉(zhuǎn)移至新的96孔一次性培養(yǎng)皿中(每孔20 μ 1)，每孔加 200 μ ISPP培養(yǎng)基(含800 μ g/ml巴龍霉素)。
7、電擊后第7天，轉(zhuǎn)移至新的96孔一次性培養(yǎng)皿中(每孔20 μ 1)，每孔加 200 μ ISPP培養(yǎng)基(含1000 μ g/ml巴龍霉素)。
8、電擊后第8天，在解剖鏡(kiss)下，用微毛細(xì)吸管(Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品) 挑取單個(gè)四膜蟲(chóng)到96孔一次性培養(yǎng)皿(CellMar公司產(chǎn)品)中，每孔一個(gè)四膜蟲(chóng)，每孔加 200 μ 1 SPP培養(yǎng)基(含1000 μ g/ml巴龍霉素)，30°C恒溫培養(yǎng)。
9、步驟8培養(yǎng)3天后，用微毛細(xì)吸管挑取單個(gè)四膜蟲(chóng)到96孔一次性培養(yǎng)皿中，每孔一個(gè)四膜蟲(chóng)，每孔加200 μ 1 SPP培養(yǎng)基(含1000 μ g/ml巴龍霉素)，30°C恒溫培養(yǎng)。
三、轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)的PCR鑒定
1、取200ul步驟二的培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，用IOOul IXBufferK (2mM Mg2+)懸浮，55°C孵育1小時(shí)，99°C變性20分鐘，得到裂解物。
IXBuffer K(2mM Mg2+)每毫升由 10XPCR Buffer IOOul、MgCl2(25mM)80ul、 Proteinase K (IOmM) 30ul 和 H20790ul 組成。
2、將裂解物作為模板，用CBD3-F和CBD3-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
CBD3-F 5' -ATGCACCATCATCATCATCATTGGAAGCCCTATGGTGGCGA-3’ ；
CBD3-R 5’ -TCAGGCCTTGTAGGCCGCC-3 ’。
PCR 體系(25ul) :20ul 裂解物，0.5ul 10XPCR Buffer, 1. 4ul MgCl2 (25mM), 0.5uldNTP(IOuM)，Iul CBD3-F(IOuM)，Iul CBD3-R(IOuM)，0. 2ul Taq DNA 聚合酶， 0. 4ulH20。
PCR 擴(kuò)增條件-MV 2min ；94°C 30sec、56°C lmin、68°C 3min，30 個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)均可)；68°C IOmin0
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見(jiàn)圖4(泳道5為λ-EcoT14 Idigest DNA maker，其條帶大小依次為 19329bp、7743bp、622!3bp、4254bp、3472bp、2690bp、1882bp、1489bp,925bp ；泳道1-4為裂解物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)。結(jié)果表明，能夠擴(kuò)增得到約2. 7kb目的片段，即得到了轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)。
四、轉(zhuǎn)空載體四膜蟲(chóng)的獲得
將質(zhì)粒pD5H8代替重組質(zhì)粒pD5H8_CBD3進(jìn)行步驟一至三，得到轉(zhuǎn)空載體四膜蟲(chóng)。
五、應(yīng)用轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)表達(dá)幾丁質(zhì)酶
1、膠體幾丁質(zhì)(底物)的制備
(1)在4°C下將IOg幾丁質(zhì)(SIGMA公司生產(chǎn)、分析純)放入研缽中，加入40ml丙酮研磨lOmin，邊研磨邊緩緩加入冷濃HCl 400ml，充分研磨至糊狀，4°C放置24h后用玻璃棉過(guò)濾，收集濾液。
(2)將步驟(1)的濾液緩緩加入到盛有2000ml 50 % (體積比)乙醇水溶液的燒杯中，邊加邊劇烈攪拌，然后靜置至膠態(tài)幾丁質(zhì)析出，收集膠態(tài)幾丁質(zhì)，用蒸餾水沖洗至PH7， 用蒸餾水定容至1000ml，即為膠體幾丁質(zhì)，冷藏備用。
2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
將0. Olg葡萄糖(分析純)用蒸餾水配制成100yg/ml的葡萄糖母液，用蒸餾水依次稀釋為如下五種濃度的葡萄糖稀釋液20、40、60、80、100μ g/ml。取六支干凈的試管， 分別加入水(O濃度)和五種葡萄糖稀釋液lml，再加入Iml DNS溶液，100°C水浴lOmin，冷卻至室溫，以蒸餾水為空白對(duì)照，在MOnm處測(cè)吸光度，以吸光度的減少量(各濃度吸光度與O濃度的吸光度之差)為橫坐標(biāo)，葡萄糖濃度(μ g/ml)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖5。 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y = 454. 3x+l. 4508，R2 = 0. 9997。
3、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-CBD3的四膜蟲(chóng)中表達(dá)的幾丁質(zhì)酶的酶活測(cè)定
(1)粗酶液的制備
將步驟三獲得的轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)和步驟四獲得的轉(zhuǎn)空載體四膜蟲(chóng)分別進(jìn)行如下步驟將四膜蟲(chóng)在SPP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)2X IO5個(gè)/ml，均分成2份，1份熱激處理(39°C熱激1小時(shí))作為第一組，另1份不作熱激處理作為第二組；然后收集細(xì)胞，用 PBS (pH7. 4)緩沖液懸浮，得到懸浮液(IO7個(gè)/ml)，超聲波破碎5π η(Φ2探頭，功率200W, 破碎10s、間歇30s)，用玻璃棉過(guò)濾并收集濾液，即為粗酶液。
(2)采用DNS比色法測(cè)還原糖
取4支試管，分別加入0. 5mL粗酶液和0. 5mL 1 %幾丁質(zhì)膠體，其中三支試管于 40°C水浴60min(樣品管)，另外一支于4°C放置(對(duì)照管)；水浴池后，在樣品和對(duì)照中均加入1. 5mL DNS,沸水浴lOmin，離心取上清夜在MOnm測(cè)定其OD值。樣品管內(nèi)溶液的OD 值平均值-對(duì)照管內(nèi)溶液的OD值=樣品管內(nèi)溶液的修正后OD值。將樣品管內(nèi)溶液的修正后OD值對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶活。
進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
幾丁質(zhì)酶酶活力單位定義在上述酶反應(yīng)體系中，每小時(shí)分解膠體幾丁質(zhì)釋放出 1 μ g的還原糖定義為一個(gè)酶活力單位(U)。
DNS比色法中所測(cè)到的還原糖可能包括粗酶液中本身的單糖、由四膜蟲(chóng)自身表達(dá)的能降解幾丁質(zhì)為單糖的酶產(chǎn)生的單糖和載體PD5H8-CBD3所表達(dá)的幾丁質(zhì)酶CBD3降解幾丁質(zhì)產(chǎn)生的單糖(采用轉(zhuǎn)空載體四膜蟲(chóng)得到的粗酶液所測(cè)到的還原糖中不含有載體 PD5H8-CBD3所表達(dá)的幾丁質(zhì)酶CBD3產(chǎn)生的單糖)。
表1粗酶液的酶活檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.DNA片段，自5’至3’方向依次包括HSP70-2基因啟動(dòng)子、幾丁質(zhì)酶的編碼基因和 HSP70-1基因終止信號(hào)；所述HSP70-2基因啟動(dòng)子如序列表的序列1自5，末端第9至11 位核苷酸所示；所述HSP70-1基因終止信號(hào)如序列表的序列1自5，末端第3835至4304位核苷酸所示；所述幾丁質(zhì)酶如序列表的序列2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA片段，其特征在于所述幾丁質(zhì)酶的編碼基因如序列表的序列1自5，末端第1142至3820位核苷酸所示。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA片段，其特征在于所述DNA片段如序列表的序列1自5’ 末端第9至4304位核苷酸所示。
4.含有權(quán)利要求1至3中任一所述DNA片段的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是在質(zhì)粒pD5H8 的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求1至3中任一所述DNA片段得到的重組質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系為將權(quán)利要求5 所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入四膜蟲(chóng)得到的轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)。
7.權(quán)利要求6所述轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)在生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用。
8.一種制備幾丁質(zhì)酶的方法，是培養(yǎng)權(quán)利要求6所述轉(zhuǎn)基因四膜蟲(chóng)，得到幾丁質(zhì)酶。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中還包括熱激處理的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種幾丁質(zhì)酶的四膜蟲(chóng)表達(dá)載體及其在表達(dá)幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種表達(dá)盒，包括序列1自5’末端第9至1126位核苷酸所示HSP70-2基因啟動(dòng)子、序列2所示幾丁質(zhì)酶的編碼基因和序列1自5’末端第3835至4312位核苷酸所示HSP70-1基因終止信號(hào)。本發(fā)明還提供了含有所述表達(dá)盒的重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到四膜蟲(chóng)后，在巴龍霉素藥物篩選作用下，能替換掉四膜蟲(chóng)體內(nèi)原有的大部分rDNA，使外源基因在四膜蟲(chóng)體內(nèi)大量倍增，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化，在熱激條件下，HSP70-2強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)CBD3基因的高效表達(dá)，而且表達(dá)的幾丁質(zhì)酶具有生物活性(能水解幾丁質(zhì))。綜上所述，本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102517281SQ20111043056
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者周志剛, 張宇婷, 徐俐, 楊雅麟, 繆煒, 袁冬霞 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所