專利名稱：鹽芥ThPER32基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中鹽芥ThPER32基因的應(yīng)用。
技術(shù)背景
鹽生植物鹽芥為十字花科(Brassicaceae)、鹽芥屬CThellungiella)植物，生于土壤鹽漬化的農(nóng)田旁、水溝邊和山區(qū)，分布于蒙古、西伯利亞和北美，在我國(guó)主要分布于山東、河北、江蘇、新疆、內(nèi)蒙古、吉林、天津和河南等地。
在鹽漬環(huán)境下生長(zhǎng)的鹽芥，不僅具有作為模式生物的基本特征，而且與擬南芥近緣。由于擬南芥作為模式植物，其許多方面研究已十分清楚，為進(jìn)行鹽芥基因水平上的研究提供了有利條件。已有的研究結(jié)果表明，鹽芥在響應(yīng)非生物脅迫中有許多基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能未知，對(duì)未來的遺傳學(xué)研究來說，它是一種具有豐富遺傳資源的植物。因此，作為一種具有應(yīng)用前景的植物耐鹽模式系統(tǒng)，鹽芥現(xiàn)已被國(guó)際、國(guó)內(nèi)許多實(shí)驗(yàn)室采納用于植物抗逆生理生化和分子機(jī)制的研究。
植物受到環(huán)境脅迫(如高鹽、低溫等)，體內(nèi)存在著活性氧(Reactive Oxygen Species,R0S)平衡體系就會(huì)受到破壞?；钚匝醯姆e累，對(duì)活性氧敏感的磷脂膜及脂肪酸首先受損，導(dǎo)致生物膜中脂質(zhì)的過氧化，干擾鑲嵌于生物膜系統(tǒng)上的多種酶的空間構(gòu)型，導(dǎo)致膜的孔隙變大、通透性增加、代謝紊亂，使植物受到傷害，生長(zhǎng)抑制，衰老和加速死亡。在長(zhǎng)期適應(yīng)進(jìn)化中，植物體內(nèi)形成了一套有效的ROS清除機(jī)制，分為酶促和非酶促兩類。其中酶促保護(hù)系統(tǒng)主要有超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、過氧化氫酶(Catalase， CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate Peroxidase，APX)、過氧化物酶(Peroxidase，P0D) 和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GPX)等。
高等植物中過氧化物酶Class III(POD)屬于大家族，在水稻中有138個(gè)成員，在擬南芥中有73個(gè)成員，在應(yīng)答內(nèi)部和外部各種脅迫中，各成員各自表達(dá)發(fā)揮特殊的作用， 其中有部分編碼POD的基因在正常條件和高鹽脅迫下表達(dá)豐度較高，而且在NCBI中登錄的鹽芥的ESTs文庫(kù)中也檢索到相關(guān)編碼POD基因。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將序列表中序列2所示蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入出發(fā)植物中，得到耐逆性高于所述出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物。
上述方法中，所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的基因
1)其核苷酸序列是序列表中序列1 ；
2)其編碼序列是序列表中序列1自5’末端起第53-1114位核苷酸所示；
3)在嚴(yán)格條件下與1)或2、的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；
4)與1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
上述任一所述方法中，所述耐逆性為耐鹽性和/或耐旱性。
上述任一所述方法中，所述蛋白的編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入出發(fā)植物中；所述重組表達(dá)載體為在載體PPZP212的多克隆位點(diǎn)間插入所述蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
上述任一所述方法中，所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為煙草、鹽芥或擬南芥。
含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述重組載體為在載體PPZP212的多克隆位點(diǎn)間插入序列表中序列2所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的基因
1)其核苷酸序列是序列表中序列1 ；
2)其編碼序列是序列表中序列1第53-1114位所示；
3)在嚴(yán)格條件下與1)或2、的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；
4)與1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
序列表中序列2所示蛋白的編碼基因和/或上述表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育耐逆植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
上述應(yīng)用中，所述耐逆植物為耐鹽和/或耐旱植物；
上述應(yīng)用中，所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的基因
1)其核苷酸序列是序列表中序列1 ；
2)其編碼序列是序列表中序列1第53-1114位所示；
3)在嚴(yán)格條件下與1)或2、的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；
4)與1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為煙草、 鹽芥或擬南芥。
序列表中序列2所示蛋白及其編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將ThPER32轉(zhuǎn)入煙草中，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性和耐旱性提高。獲得的轉(zhuǎn)基因煙草在150mmol -L^NaCl脅迫下能夠正常生長(zhǎng)，根系發(fā)育正常， 而野生型煙草生長(zhǎng)受到抑制，說明轉(zhuǎn)ThPER32煙草提高了植株的耐鹽性。以10% PEG 6000 模擬干旱脅迫，在鮮重和側(cè)根數(shù)量方面轉(zhuǎn)基因煙草都高于野生型煙草，說明轉(zhuǎn)ThPER32煙草提高了植株的耐旱性。


圖1為鹽脅迫下鹽芥不同組織中ThPER32半定量表達(dá)分析。
圖2為雙酶切鑒定ThPER32與pGEM_T載體鏈接。
圖3為雙酶切鑒定ThPER32與pPZP212載體鏈接。
圖4為轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105后的菌液PCR檢驗(yàn)?zāi)康钠巍?br> 圖5為煙草無菌苗的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)ThPER32煙草抗生素抗性植株篩選。
圖6為轉(zhuǎn)ThPER32基因煙草的鑒定。
圖7為轉(zhuǎn)ThPER32基因煙草Tl代與野生型煙草生長(zhǎng)狀況。
圖8為轉(zhuǎn)ThPER32煙草與載體對(duì)照型煙草與在含有NaCl的MS平板上的生長(zhǎng)狀況。圖9為轉(zhuǎn)HiPER32煙草與載體對(duì)照煙草在含有10% PEG6000的MS平板上的生長(zhǎng)狀況。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、鹽芥ThPER32的全長(zhǎng)序列的獲取一、鹽芥ThPER32全長(zhǎng)序列的獲取總 RNA 的提取。鹽芥(Thellungiella salsuginea(Pall.) 0. Ε. Schulz) (Shandong Ecotype)在混合土中種植6周后，轉(zhuǎn)入裝有新的珍珠巖m 蛭石m(l 1)育苗介質(zhì)中， 300mmol · L^1NaCl處理24h后取樣，采用Trizol法提取總RNA，具體操作按照說明書進(jìn)行。cDNA 的合成。取植株總 RNA2 μ g，2 μ L Oligo (dT)，1 μ L RNasin，補(bǔ)充 DEPC 水至總體積14. 5 μ L，放于65°C變性處理lOmin，取出后冰浴5min。加4μ L 5Xbuffer,2y L dNTP，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μ L，混勻。37°C保溫1. 5h，然后于95°C IOmin終止反應(yīng)。鹽芥ThPER32全長(zhǎng)序列的獲得。根據(jù)在NCBI上登錄的鹽芥ESTs序列，檢索到與 AtPER32同源的ESTs序列，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增鹽芥ThPER32基因的cDNA的中間片段。將得到的PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，回收目的片段進(jìn)行測(cè)序。 根據(jù)已測(cè)序的基因部分序列，按照SMART RACE試劑盒的要求設(shè)計(jì)引物。3’和5’ RACE按照SMART RACE試劑盒說明書進(jìn)行。將RACE得到的PCR產(chǎn)物在1. 0%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，回收目的片段進(jìn)行克隆測(cè)序。用DNAMAN軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析，拼接得到全長(zhǎng)cDNA 序列。在ORF兩端設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，獲得包含完整ORF的鹽芥ThPER32 基因的cDNA序列。所涉及的引物序列分別為用于ThPER32基因片段擴(kuò)增引物序列5，-ATGGATTTCTCTTCTTTCTCTTCG-3，，5， -GTTGCCTCATACATTGAGACAC-3，；用于ThPER32基因3，末端擴(kuò)增引物序列5， -TATGGACAGGCTATACAACTTCAG-3，；用于ThPER32基因5，末端擴(kuò)增引物序列5， -GTTGCCTCATACATTGAGACAC-3，；用于ThPER32基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物序列5，-GATCTTTCTCTACTAAAACTAATC-3，，5，-TTCGATCAAATGTCCTCAAG-3，。ThPER32的全長(zhǎng)cDNA序列由1309個(gè)堿基組成，如序列表中序列1所示，第1 52 位為 5，-UTR，第 53 1114位為 0RF，第 1115 1309 位為 3，-UTR，并帶有 AATAAA和 poly (A) 序列。序列表中序列1第53到1114位編碼具有序列表中序列2的氨基酸序列的蛋白，將該蛋白命名為ThPER32。序列表中序列2由353個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為38882Da，pi 為 6. 58。二、鹽芥ThPER32的半定量RT-PCR表達(dá)分析所用植物材料及種植方法步驟一相同。待鹽芥生長(zhǎng)至6周時(shí)，進(jìn)行鹽脅迫處理24h, NaCl濃度為100、200、300、400和500mmol · L—1，分別取地上部和根組織，提取總RNA。 以鹽芥tubulin為內(nèi)參基因，并選取25個(gè)循環(huán)為PCR循環(huán)數(shù)，進(jìn)行ThPER32的RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，ThPER32的表達(dá)具有組織特異性，正常條件下，地上部組織中的表達(dá)很低，而在根組織中表達(dá)量很高。經(jīng)過鹽脅迫，地上部組織中的 ThPER32的表達(dá)量增加，300mmol · L—1下表達(dá)量最高；而根組織中ThPER32的表達(dá)一直維持著較高的水平。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因植物的獲得及其檢測(cè)一、轉(zhuǎn)基因植物的獲得1、重組表達(dá)載體構(gòu)建載體 pPZP212 的參考文獻(xiàn)Peter Hajdukiewicz, Zora Svab and Pal Maliga, The small, versatilepPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation, Plant Molecular Biology Volume 25, Number 6,989-994, DOI 10. 1007/BF00014672。公眾可以通過 Addgene (http://www. addgene. org/)免費(fèi)獲取該載體。根據(jù)ThPER32全長(zhǎng)序列和載體pPZP212上所需的酶切位點(diǎn)(Xba I和Mc II)設(shè)計(jì)引物。其中含Xba I 酶切位點(diǎn)引物序列為5，~TGCTCTAGAATGCATTTCTCTTCTTTC~3’含 cII 酶切位點(diǎn)引物序列為5，-TCCCCGCGGTTACATAGAGCTGACAAA-3’。以人工合成的序列表中序列1所示的ThPER32基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取含酶切位點(diǎn)ThPER32全長(zhǎng)序列。回收產(chǎn)物后與pGEM-T easy Vector (pGEM-T easy Vector購(gòu)自!Iomega公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為A1360)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ε. coli DH5 α (Ε. coli DH5 α購(gòu)自天根生化科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為CB10102)，進(jìn)行抗性篩選，挑取陽性克隆，將陽性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，將重組載體記作pGEM-T-ThPER32。 以Mc II單酶切pGEM-T-ThPER32重組載體，取5 μ L單酶切產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 膠回收單酶切產(chǎn)物后，將經(jīng)II單酶切形成的粘性末端進(jìn)行3’端平滑化，使之成為平末端；回收產(chǎn)物，繼續(xù)進(jìn)行)(ba I單酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，膠回收ThPER32片段保存于-20°C備用。電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，圖2中泳道1為)(ba I和Mc II雙酶切產(chǎn)物，切下的小片段約為IlOObp左右，與ThPER32片段長(zhǎng)度相符，切下的大片段約為3000bp左右， 為T easy vector.泳道2為Mc II單酶切產(chǎn)物。進(jìn)一步將菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明在pGEM-T Vector載體中插入了序列表中序列1中第53-1114所示的ThPER32基因片段， 證明ThPER32片段和T-vector已經(jīng)連接。以)(ba I和Ecll36 II對(duì)pPZP212質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收載體大片段。將載體大片段與上述酶切得到的IliPER32 4°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞， 抗性篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。以)(ba I和EcoR I [在此選擇了位于EcolCRI下游的 EcoR I位點(diǎn)進(jìn)行酶切驗(yàn)證]對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切結(jié)果如圖3所示，圖3中泳道 1為雙酶切產(chǎn)物，大片段長(zhǎng)度約為101Λ ；小片段大小約為1400bp，包含了目的片段和表達(dá)載體中NOS終止子序列[該位點(diǎn)位于EcoR I位點(diǎn)上游]，證明ThPER32已經(jīng)與表達(dá)載體大片段連接。進(jìn)一步將菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明在PPZP212載體的Ecll36 II和)(ba I酶切位點(diǎn)間插入了序列表中序列1中第53-1114所示所示的ThPER32基因片段，證明ThPER32片段已經(jīng)連接到PPZP212載體大片段上。將制備得到的重組質(zhì)粒命名為pPZP212-ThPER32。2、轉(zhuǎn)基因植物獲得將步驟1獲得的重組質(zhì)粒pPZP212_ThPER32采用凍融法轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌 EHA105。對(duì)重組菌進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖4。泳道1 4均顯示有目的基因ThPER32，約為IlOObp左右，證明目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入了農(nóng)桿菌EHA105中。分別將帶有pPZP212_ThPER32 的農(nóng)桿菌 EHA105 接種于 200mL 含抗生素(100 μ g · IiiIZ1Rif，100 μ g · mL^Spec)的 LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600 = 0. 8 1.0，4°C，5000rpm離心lOmin，去上清，沉淀菌體懸浮于 200mL滲透液(含有50g · L-1的蔗糖和200 μ L · L-1的表面活性劑Silwet-77)中。葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。煙草(K326)接種于MS培養(yǎng)基，置于 25°C光照培養(yǎng)箱， 每天光照16h，黑暗他，生長(zhǎng)6周。取煙草無菌苗的葉片，去主脈，切成0.5 IcmXO. 5 Icm的煙草葉盤，加入含有pPZP212-ThPER32的農(nóng)桿菌EHA105菌液中，浸泡lOmin。接種在培養(yǎng)基Tl (MS+1. Omg Γ'Θ-ΒΑ+Ο. Img .L4NAA)上，暗培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基T2 (M S+100mg L_1Kan+400mg 'L^Cef+l. Omg 'L-16-BA+0. Img 'T1NAA)中，24°C光照培養(yǎng)2 周。再用含500mg · L^1Cef無菌水沖洗一次，轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基中。待獲得具有Kan抗性芽至2cm時(shí)， 轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基(l/2MS+100mg .I^Kar^^Omg .L-1Cef)，5d IOd后長(zhǎng)出不定根，移栽到由營(yíng)養(yǎng)土 珍珠巖蛭石(質(zhì)量比為2 1 1)組成的介質(zhì)中生長(zhǎng)，獲得待檢測(cè)的煙草植株 (圖 5)。轉(zhuǎn)ThPER32基因煙草的鑒定。采用CTAB法提取8株待鑒定轉(zhuǎn)ThPER32煙草葉片基因組DNA，以基因組DNA為模板，進(jìn)行對(duì)目的基因ThPER32的PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖6中A，圖6中A編號(hào)為2、7、8的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后均有目的條帶出現(xiàn)，大小約為 IlOObp左右，有可能轉(zhuǎn)入了 ThPER32。取經(jīng)初步鑒定為陽性(編號(hào)為2和8)的轉(zhuǎn)ThPER32 基因煙草，采取Trizol法提取其葉片總RNA，進(jìn)行RT-PCR，電泳結(jié)果見圖6中B，其中，泳道 1和2分別為上述編號(hào)為2和8的陽性轉(zhuǎn)ThPER32基因煙草的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，CK為陰性對(duì)照，從圖中可見，在轉(zhuǎn)錄水平上，編號(hào)為2和8的煙草植株中含有目的基因ThPER32。將鑒定陽性的煙草培養(yǎng)得到種子在含卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長(zhǎng)出綠葉和根系的苗為轉(zhuǎn)基因煙草Tl代。按照獲得轉(zhuǎn)ThPER32基因煙草的方法，將空載體PPZP212轉(zhuǎn)化煙草植株，得到轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草。將鑒定為轉(zhuǎn)ThPER32基因的Tl代煙草和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照(Vector control)煙草分別播種于MS培養(yǎng)基和含有Kan的MS培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)3周之后的結(jié)果見圖7。圖7中A和圖 7中B分別為轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草和轉(zhuǎn)ThPER32煙草在MS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示兩者在MS培養(yǎng)基中均正常生長(zhǎng)，但轉(zhuǎn)ThPER32煙草的長(zhǎng)勢(shì)略好于載體對(duì)照。圖7中C和圖7 中D分別為轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草和轉(zhuǎn)ThPER32煙草在含有Kan的MS平板上的生長(zhǎng)情況。從圖7中C和圖7中D的對(duì)比中可以明顯的看出，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草因不含抗Kan的基因而不能正常生長(zhǎng)，幼苗變黃且小；轉(zhuǎn)ThPER32煙草在含有Kan的平板上生長(zhǎng)正常，葉片呈鮮綠色。二、轉(zhuǎn)ThPER32基因煙草的抗逆性鑒定如下(1)耐鹽性分析將上述在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3周的轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草和轉(zhuǎn)ThPER32煙草T1代植株轉(zhuǎn)入含有150mmol -L^1NaCl的MS平板上，培養(yǎng)條件為每天光照16h，黑暗8h ；23°C 25°C。鹽脅迫1 3周之后觀察表型，結(jié)果見圖8。圖8中A D平板的左側(cè)為載體對(duì)照型煙草， 右側(cè)為轉(zhuǎn)ThPER32煙草；A 生長(zhǎng)1周的植株；B 生長(zhǎng)2周的植株；C 生長(zhǎng)3周的植株；D 生長(zhǎng)3周的根系情況；E 生長(zhǎng)8周后的轉(zhuǎn)ThPER32煙草(左側(cè)3株)和載體對(duì)照型煙草(右側(cè)3株)的幼苗生長(zhǎng)對(duì)比。從圖中可見，在ISOmm0Pr1NaCl下，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草生長(zhǎng)受到抑制，而轉(zhuǎn)ThPER32煙草能夠正常生長(zhǎng)。圖8中D顯示，轉(zhuǎn)ThPER32煙草的根系發(fā)育較好， 轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草根系發(fā)育較弱。圖8中E顯示，在相同生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草生長(zhǎng)受到抑制，幼苗較小 ’轉(zhuǎn)ThPER32煙草生長(zhǎng)正常，植株較大。分別測(cè)定9株幼苗3周后的生長(zhǎng)量，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)ThPER32煙草的平均鮮重(Fresh weight, FW)為0. 375士0. 156(g)， 平均根長(zhǎng)9. 611 士 2. 236 (cm)，平均側(cè)根數(shù)量為8. 111 士 5. 372 (條)，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草的平均鮮重(Fresh weight, Fff)為 0. 045士0. 027 (g)，平均根長(zhǎng) 3. 411 士 1. 870 (cm)，平均側(cè)根數(shù)量為2. 667 士 1.沈5 (條)。轉(zhuǎn)ThPER32煙草在平均鮮重、根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)量分別為轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草的8. 333倍、2. 818倍和3. 041倍。野生型煙草與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草的結(jié)果一致。(2)耐旱性分析將上述在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3周的轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草和轉(zhuǎn)ThPER32煙草T1代植株轉(zhuǎn)入含有10% PEG 6000的MS平板上，采用10% PEG 6000模擬干旱脅迫，培養(yǎng)條件為每天光照16h，黑暗8h ;23°C 25°C。干旱脅迫1 3周之后的結(jié)果見圖9。圖9中A D平板的左側(cè)為野生型煙草，右側(cè)為轉(zhuǎn)ThPER32煙草；A 生長(zhǎng)1周的植株；B 生長(zhǎng)2周的植株； C 生長(zhǎng)3周的植株；D 生長(zhǎng)4周的植株；E 生長(zhǎng)8周后的轉(zhuǎn)ThPER32煙草(左側(cè)3株)和載體對(duì)照煙草(右側(cè)3株)的生長(zhǎng)情況對(duì)比。轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草和轉(zhuǎn)ThPER32煙草能夠生長(zhǎng)，但是二者不同，幼苗萌發(fā)后生長(zhǎng)8 周后，各統(tǒng)計(jì)9株苗，轉(zhuǎn)ThPER32煙草的平均鮮重(Fresh weight, Fff)為0.6 士0. 335(g)， 平均根長(zhǎng)5. 467 士 0. 691(cm)，平均側(cè)根數(shù)量為21.444 士 12. 680 (條)，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草的平均鮮重為0. 410 士 0. 278 (g)，平均根長(zhǎng)3. 909 士 1. 373 (cm)，平均側(cè)根數(shù)量為 12. 777士7.四3 (條)。轉(zhuǎn)ThPER32煙草在平均鮮重、根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)量分別為轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草的1. 527倍、1. 399倍和1. 678倍。野生型煙草與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草的結(jié)果一致。
8
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將序列表中序列2所示蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入出發(fā)植物中，得到耐逆性高于所述出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1；2)其編碼序列是序列表中序列1自5’末端起第53-1114位核苷酸所示；3)在嚴(yán)格條件下與1)或幻的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；4)與1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述耐逆性為耐鹽性和/或耐旱性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述蛋白的編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入出發(fā)植物中；所述重組表達(dá)載體為在載體PPZP212的多克隆位點(diǎn)間插入所述蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為煙草、鹽芥或擬南芥。
6.含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在載體PPZP212的多克隆位點(diǎn)間插入序列表中序列2所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
8.序列表中序列2所示蛋白的編碼基因和/或權(quán)利要求6所述的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育耐逆植物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述耐逆植物為耐鹽和/或耐旱植物；所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為煙草、鹽芥或擬南芥。
10.序列表中序列2所示蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了鹽芥ThPER32基因的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將序列表中序列2所示蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入出發(fā)植物中，得到耐逆性高于所述出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將ThPER32轉(zhuǎn)入煙草中，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性和耐旱性提高。獲得的轉(zhuǎn)基因煙草在150mmol·L-1NaCl脅迫下能夠正常生長(zhǎng)，根系發(fā)育正常，而野生型煙草生長(zhǎng)受到抑制，說明轉(zhuǎn)ThPER32煙草提高了植株的耐鹽性。以10％PEG 6000模擬干旱脅迫，在鮮重和側(cè)根數(shù)量方面轉(zhuǎn)基因煙草都高于野生型煙草，說明轉(zhuǎn)ThPER32煙草提高了植株的耐旱性。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102517324SQ20111043066
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者馮金朝, 周宜君, 張根發(fā), 徐小靜, 程文靜, 耿玉珂, 韋善君, 馬亭亭, 高飛 申請(qǐng)人:中央民族大學(xué)