專利名稱：放線菌來源的耐熱性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及放線菌來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)的突變蛋白。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(也簡稱為TG)被廣泛用于食品加工等等，因為它在蛋白質(zhì)之間形成交聯(lián)鍵且產(chǎn)生凝膠物質(zhì)。具有改良的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性或熱穩(wěn)定性的突變型TG有助于減少需要的TG量且可用于高溫范圍，從而使這種酶有可能應(yīng)用于新領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是一種催化蛋白質(zhì)的肽鏈中Y-羧酰胺基團(tuán)的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶。 當(dāng)讓這種酶作用于蛋白質(zhì)時，可發(fā)生形成ε-(Y-Glu)-Lys交聯(lián)的反應(yīng)和Gln通過脫酰胺被替換為Glu的反應(yīng)。迄今已經(jīng)知道動物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。前一類酶是Ca2+依賴性的，分布在動物器官、皮膚、血液等等中。例如，存在豚鼠肝轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(非專利文件1)、人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(非專利文件2)、 人凝血因子XIII (非專利文件幻等等。后一類酶不是Ca2+依賴性的，已經(jīng)在鏈輪絲菌屬 (Streptoverticillium)的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)。例子包括灰肉色鏈輪絲菌(Sti^ptoverticillium griseocarneum)IFO 12776、肉桂色鏈輪絲菌肉桂色亞種(Sti^ptoverticillium cinnamoneum sub sp. Cinnamoneum) IFO 12852、茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense) IFO 13819等等。特別地，在茂原鏈輪絲菌的一種變體的培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶被稱作MTG(微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)。另外，還在利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus)NRRL B-3446中發(fā)現(xiàn)了一種不依賴Ca2+的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(專利文件1)。通過肽作圖法和基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，由這些微生物生成的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的一級結(jié)構(gòu)與動物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶沒有任何同源性(專利文件2)。MTG是一種單體蛋白，由331個氨基酸組成，具有約38，000的分子量(非專利文件 4)。因為MTG是通過純化操作從上述微生物等之一的培養(yǎng)物生產(chǎn)的，所以在供應(yīng)量、效率等等方面有問題。還有人嘗試通過遺傳工程技術(shù)來生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。已經(jīng)報告了一種基于大腸桿菌、酵母等等分泌性表達(dá)的方法(專利文件幻，一種讓大腸桿菌表達(dá)MTG成為蛋白質(zhì)包含體，然后將此包含體用蛋白質(zhì)變性劑溶解，通過處理除去變性劑，然后復(fù)原以生成活性 MTG的方法(專利文件4)，及一種使用谷氨酸棒狀桿菌(Corynekicterium glutamicum)的 MTG分泌性表達(dá)的方法(專利文件幻。與動物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶不同，MTG和微生物來源的其它轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是Ca2+依賴性的，因此被用于生產(chǎn)膠凝食品諸如果凍、酸奶、奶酪，或凝膠化妝品等等，改良肉的質(zhì)量等等(專利文件6)。MTG還被用于生產(chǎn)熱穩(wěn)定微囊的原材料、固定化酶的載體等等，是在工業(yè)上高度有用的酶。關(guān)于酶促反應(yīng)條件，例如，如果酶促反應(yīng)時間較短的話，不形成膠凝食品，相反，如果反應(yīng)時間太長的話，膠凝食品變得太硬，難以作為商品。因此，當(dāng)MTG被用于生產(chǎn)膠凝食品諸如果凍、酸奶、奶酪，或凝膠化妝品等等，改良肉的質(zhì)量等等時，通過調(diào)整底物和酶的濃度、反應(yīng)溫度、和反應(yīng)時間來制備期望產(chǎn)品。然而，隨著利用MTG生產(chǎn)的食品、試劑等等變得越來越多樣，在有些場合僅僅通過調(diào)整濃度、 溫度、時間等等無法制備期望的產(chǎn)品；需要改變MTG的酶活性。
已知野生型MTG (野生型MTG指天然存在的且其氨基酸序列沒有經(jīng)過修飾的MTG) 在介于約4和10之間的pH是穩(wěn)定的，而且可以說在相對較寬的pH范圍里是穩(wěn)定的，但是它在極端酸性或堿性條件下難以反應(yīng)。野生型MTG的最適溫度為約50°C，它也難以在很高的溫度反應(yīng)。即使在低于此最適溫度的溫度，長時間溫育可導(dǎo)致酶活性降低。因此，具有改善的PH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性等等的突變型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可望為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶用于新目的提供可能。MTG迄今為止主要用于食品領(lǐng)域。已經(jīng)提議了在極其多種用途中應(yīng)用的可行性，包括紡織品、化學(xué)產(chǎn)品(照相膠片、制革)、飼料、化妝品、和藥品。在紡織品領(lǐng)域，用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進(jìn)行羊毛改性是已知的。具體地，已知通過用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理羊毛，可賦予抗收縮性、抗起球性和疏水性，同時維持原有的質(zhì)地(專利文件 7)。當(dāng)將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶用于羊毛時，短時間內(nèi)在較高溫度與角蛋白反應(yīng)會提高單位時間的處理量且改良生產(chǎn)效率，因此被認(rèn)為在工業(yè)上是有用的。制革指對動物皮(hide/skin)進(jìn)行包括多個步驟的一系列處理和加工，使得皮成為耐用、柔韌的革(leather)；此加工是通過用六價鉻交聯(lián)皮的膠原來實現(xiàn)的。因為六價鉻是有害的且不希望它釋放入環(huán)境，所以對于替代方法的開發(fā)存在強烈的需求。關(guān)于將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶用于制革，專利文件8披露了微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可用于制革，但是沒有披露實際容許轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用于皮的例子；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶尚未在實際應(yīng)用中用于此目的。由于用六價鉻進(jìn)行的交聯(lián)在PH 3至4發(fā)生，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在此pH也能反應(yīng)似乎是理想的，但是因為MTG對酸性不穩(wěn)定，所以難以實際應(yīng)用。因此，在諸如紡織品加工和制革等應(yīng)用的場合，想要改良轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的熱穩(wěn)定性(即耐熱性)以在短時間里在高溫完成反應(yīng)，及改良的PH穩(wěn)定性以容許在酸性區(qū)域中反應(yīng)。如上所述，作為用于改變和改良轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的酶活性的手段，可監(jiān)測轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶自身的改變，即轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的熱穩(wěn)定性和PH穩(wěn)定性等等的改良。例如，改良熱穩(wěn)定性可拓寬適用性，從而可以預(yù)期提高反應(yīng)速率等。還有，改良PH穩(wěn)定性會容許更寬pH范圍內(nèi)的酶促反應(yīng)和貯存。這在工業(yè)化中也會是有利的。為了改變轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的耐熱性和/或PH穩(wěn)定性，有必要制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的突變體，評估其活性等等，并找出卓越的突變體，即具有改良的耐熱性和/或PH穩(wěn)定性的突變體。為了制備突變體，有必要操作野生型基因；因此，必須能制備重組蛋白。對于MTG而言， 已建立了使用谷氨酸棒狀桿菌的分泌性表達(dá)系統(tǒng)(專利文件5)。為了提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，一般可能使用引入非共價鍵諸如氫鍵、靜電相互作用或疏水相互作用，或共價鍵諸如二硫鍵來增強分子內(nèi)疏水核的堆填或穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)中的α 螺旋的方法，或消除使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的因素的方法。為了通過引入二硫鍵來提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，有必要找出適合于引入半胱氨酸的位置。對于MTG而言，已創(chuàng)建了通過引入二硫鍵而改良了耐熱性和/或PH穩(wěn)定性的突變型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(專利文件9)。專利文件9披露了通過將二硫鍵引入野生型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等等而制備的突變型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。例如，專利文件9披露了擁有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性且具有至少一處選自下述的突變的蛋白質(zhì)a)MTG中的7位和58位替代為半胱氨酸，
b)46位和318位替代為半胱氨酸，c) 93位和112位替代為半胱氨酸，d) 106位和213位替代為半胱氨酸，e) 160位和2 位替代為半胱氨酸，f) 2位和282位替代為半胱氨酸，g)2位和283位替代為半胱氨酸，h) 3位和283位替代為半胱氨酸，和i) 17位和330位替代為半胱氨酸，編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸、包含所述多核苷酸之一的重組載體、經(jīng)所述載體之一轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法、等等，還披露了使用此類突變型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶加工底物蛋白的方法。然而，盡管在通過將二硫鍵引入上文所述的MTG而制備的突變型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中觀察到耐熱性和/或PH穩(wěn)定性的一些改善，但是想要進(jìn)一步改善耐熱性以容忍用于紡織品
加工等等的高溫。為了改變通過將二硫鍵引入MTG而制備的突變型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的酶活性，有必要制備其突變體，評估其活性等等，并找出更好的突變體。為了制備突變體，有必要操作野生型基因；因此，必須能制備重組蛋白。在MTG的情況中，已建立了使用谷氨酸棒狀桿菌的分泌性表達(dá)系統(tǒng)(專利文件5)。雖然非專利文件5描述了一些MTG突變體，但是這些突變體的耐熱性不適合它們在較高溫度的用途，如用于紡織品加工等。文獻(xiàn)列表專利文件專利文件1 JP-A-H10-504721專利文件2 :EP-A-0481504A1專利文件3 JP-A-H5-199883專利文件4 JP-A-H6-30771專利文件5 :W02002/081694專利文件6 JP-A-64-27471專利文件7 JP-A-H3-213574專利文件8 :US-B-6, 849，095專利文件9 :W02008/099898非專利文件非專利文件1 :K. Ikura 等，Biochemistry, 27，2898，1988非專利文件2 :M. A. Phillips 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A，87，9333，1990非專利文件3 :A. Ichinose 等，Biochemistry, 25，6900，1986非專利文件4:T Kanaji 等，Journal of Biological Chemistry. 268,11565,1993非專利文件5 :C. K. Marx 等，Journal ofBiotechnology, 136 (3)，p. 156-162，Sep 2008

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的一個目的是提供具有與野生型(以下也簡稱為WT)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和專利文件9中記載的通過將二硫鍵引入WT轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶而制備的突變型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(以下也簡稱為“二硫鍵引入型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶”)相比改善的耐熱性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶突變蛋白，由此使得在高溫下短時間內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng)成為可能。解決問題的手段本發(fā)明人為了解決上文所述的問題而進(jìn)行了廣泛的探討，結(jié)果，通過向?qū)＠募? 中記載的二硫鍵引入型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因進(jìn)一步引入突變，提供了具有與原始的二硫鍵引入型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶相比改善的耐熱性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶突變蛋白，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的突變蛋白使得在高溫下短時內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng)成為可能，適合于紡織品加工、制革等等。本發(fā)明可概述如下。[1], 一種具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白質(zhì)(A)在SEQ ID NO 2中在至少一個選自101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；(B)在序列(A)中在除了 101位、157位和250位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。(C)在選自SEQ ID NO :4、6、8、10禾口 12的氨基酸序列中，或在與選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10和12的氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，在至少一個選自對應(yīng)于101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；或(D)在序列(C)中在除了對應(yīng)于SEQ ID NO 2的101位、157位和250位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。[2],上述[1]的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步具有至少一個選自下面a)至d)的突變a) 3位和283位突變?yōu)榘腚装彼幔琤) 2位和282位突變?yōu)榘腚装彼?，c) 2位和283位突變?yōu)榘腚装彼?，d) 7位和58位突變?yōu)榘腚装彼?。[3], 一種具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白質(zhì)(A)在SEQ ID NO :2中，在3位和283位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔儯⑦€在至少一個選自101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；(B)在序列㈧中在除了 3位、101位、157位、250位和283位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；(C)在選自SEQ ID NO :4、6、8、10禾口 12的氨基酸序列中，或在與選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10和12的氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，在對應(yīng)于SEQ ID NO :2的3位和283位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔?，并還在至少一個選自對應(yīng)于101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；或(D)在序歹Ij (C)中在除了對應(yīng)于SEQ ID NO :2的3位、101位、157位、250位和沘3 位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
[4], 一種具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白質(zhì)(A)在SEQ ID NO :2中，在2位和282位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔?，并還在至少一個選自101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；(B)在序列㈧中在除了 2位、101位、157位、250位和282位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；(C)在選自SEQ ID NO :4、6、8、10和12的氨基酸序列中，或在與選自SEQ ID NO 2、4、6、8、10和12的氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，在對應(yīng)于SEQ ID NO :2的2位和282位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔儯⑦€在至少一個選自對應(yīng)于101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；或(D)在序歹Ij (C)中在除了對應(yīng)于SEQ ID NO :2的2位、101位、157位、250位和沘2 位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。[5] 一種具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白質(zhì)(A)在SEQ ID NO :2中，在2位和283位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔?，并還在至少一個選自101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；(B)在序列(A)中在除了 2位、101位、157位、250位和283位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；(C)在選自SEQ ID NO :4、6、8、10禾口 12的氨基酸序列中，或在與選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10和12的氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，在對應(yīng)于SEQ ID NO :2的2位和283位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔?，并還在至少一個選自對應(yīng)于101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；或(D)在序歹Ij (C)中在除了對應(yīng)于SEQ ID NO :2的2位、101位、157位、250位和沘3 位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。[6], 一種具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白質(zhì)(A)在SEQ ID NO :2中，在7位和58位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔儯⑦€在至少一個選自101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；(B)在序列(A)中在除了 7位、58位、101位、157位和250位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；(C)在選自SEQ ID NO :4、6、8、10和12的氨基酸序列中，或在與選自SEQ ID NO 2、4、6、8、10和12的氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，在對應(yīng)于SEQ ID NO :2的7位和58位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔?，并還在至少一個選自對應(yīng)于101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；或(D)在序歹Ij (C)中在除了對應(yīng)于SEQ ID NO 2的7位、58位、101位、157位和250 位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。[7],上述[3]的蛋白質(zhì)，其中在(A)或(B)中SEQ ID NO 2的101位、157位和 250位，或在(C)或⑶中對應(yīng)于這些位置的位置處的氨基酸突變?yōu)?01位突變?yōu)楦彼幔?57位突變?yōu)楸彼峄蚪z氨酸，250位突變?yōu)楸彼峄蚓彼帷8],上述[3]的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有
9
SEQ IDNO :2 中的3位的天冬氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔?01位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?57位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸；250位的甘氨酸突變?yōu)榫彼幔缓?83位的甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼?。[9],上述[3]的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在SEQ ID NO :2中，除了 3位的天冬氨酸突變?yōu)榘腚装彼岷?83位的甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼嶂?，還具有下述所示突變的組合之任一(1) 101位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?57位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，和250位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸或天冬氨酸；(2) 157位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，250位的甘氨酸突變?yōu)榫彼?，?01位的絲氨酸突變?yōu)楦拾彼帷⒈彼?、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸或谷氨酸；或(3) 101位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?50為的甘氨酸突變?yōu)榫彼?，?57位的甘氨
酸突變?yōu)楸彼帷⒗i氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。[10].上述[3]的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在SEQ ID NO :2中，除了 3位的天冬氨酸突變?yōu)榘腚装彼岷?83位的甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼嶂?，還具有101位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?57位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?、絲氨酸或精氨酸；和250位的甘氨酸突變?yōu)楸彼帷⒈奖彼?、絲氨酸、天冬酰胺或精氨酸。[11].上述[10]的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在SEQ ID NO :2中，除了 3位的天冬氨酸突變?yōu)榘腚装彼岷?83位的甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼嶂?，還具有下述所示的突變組合之任一(1) 101位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?57位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，和250位的甘氨酸突變?yōu)楸彼帷⒈奖彼?、絲氨酸、天冬酰胺或精氨酸；(2) 157位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，250位的甘氨酸突變?yōu)榫彼?，?01位的精氨酸突變?yōu)楦彼幔换?3) 101位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?50位的甘氨酸突變?yōu)榫彼?，?57位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?、絲氨酸或精氨酸。[12].上述[7]-[11]中任一項的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在SEQ ID N0:2中，進(jìn)一步包含208位的精氨酸突變?yōu)榱涟彼?、丙氨酸或谷氨酸。[13].上述[8]的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在SEQ ID NO :2中，進(jìn)一步包含(1)208位的精氨酸突變?yōu)樯彼幔?2)268位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０罚?3) 132位的纈氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?4) 238位的精氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔?br> (5) 249位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?。[14]. 一種多核苷酸，其編碼上述[1]_[13]中任一項的蛋白質(zhì)。[15]. —種重組載體，其包含上述[14]的多核苷酸。[16]. —種宿主細(xì)胞，其經(jīng)上述[15]的重組載體轉(zhuǎn)化。[17]. —種產(chǎn)生上述[1]至[13]中任一項的蛋白質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)上述[16]的宿主細(xì)胞，并收集具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)。[18]. —種處理底物蛋白的方法，包括允許上述[1]至[13]中任一項的蛋白質(zhì)、由上述[17]的方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或上述[16]的宿主細(xì)胞作用于底物蛋白的步驟。[19].上述[18]的方法，其中對底物蛋白的處理在40°C至100°C進(jìn)行。發(fā)明的效果依照本發(fā)明，通過修飾常規(guī)的二硫鍵引入型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(特別是二硫鍵引入型 MTG)，有可能提供具有進(jìn)一步改善的耐熱性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。另外，通過使用具有改良的耐熱性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，能提供新產(chǎn)品和新技術(shù)。


圖1是顯示自二硫鍵引入型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶衍生的多種突變體的耐熱性(殘留活性)的圖示。圖2是顯示實施例8中鑒定的6種突變體的耐熱性(殘留活性)的圖示。圖3是顯示實施例10中的耐熱性評估的結(jié)果的圖。圖4A是顯示表6中所列突變體的耐熱性評估結(jié)果的圖示。圖4B是顯示表6中所列突變體的耐熱性評估結(jié)果的圖示。圖4C是顯示表6中所列突變體的耐熱性評估結(jié)果的圖示。圖5是顯示通過MSS2 β B的R208處的氨基酸替代生成的各種突變體的耐熱性評估結(jié)果的圖。圖6是顯示表11中所列的突變體的耐熱性評估結(jié)果的圖示。發(fā)明詳述下面具體描述本發(fā)明。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶被廣泛用于生產(chǎn)食品諸如果凍、奶酪、酸奶、 豆腐、魚糕、火腿、香腸、和面條，改良肉的質(zhì)量等等(JP-A-SH0-64-27471)。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶還被用于生產(chǎn)熱穩(wěn)定微膠囊的原材料、固定化酶的載體等等，是用于多種工業(yè)目的的酶。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化蛋白質(zhì)分子的肽鏈中谷氨酰胺殘基上的Y-羧酰胺基團(tuán)的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子中的賴氨酸殘基的ε -氨基擔(dān)當(dāng)?；荏w時，在蛋白質(zhì)分子中及在分子間形成 ε - (y-Glu) -Lys 鍵。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶大體上分為Ca2+依賴性的(來源于動物)和不依賴Ca2+的(來源于微生物)。作為微生物來源的TG，自放線菌衍生的TG是已知的。下表顯示了自放線菌衍生的TG的核苷酸序列和氨基酸序列的例子。表1 放線菌的名稱、核苷酸序列和氨基酸序列
放線菌核苷酸序列氨基酸序列
1權(quán)利要求
1.一種具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白質(zhì)(A)在SEQID NO 2中在至少一個選自101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；(B)在序列(A)中在除了101位、157位和250位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。(C)在選自SEQID NO :4、6、8、10和12的氨基酸序列中，或在與選自SEQ ID NO :2、4、 6、8、10和12的氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，在至少一個選自對應(yīng)于101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；或(D)在序列(C)中在除了對應(yīng)于SEQID NO 2的101位、157位和250位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步具有至少一個選自下面a)至d)的突變a)3位和283位突變?yōu)榘腚装彼?，b)2位和282位突變?yōu)榘腚装彼幔琧)2位和283位突變?yōu)榘腚装彼?，d)7位和58位突變?yōu)榘腚装彼帷?br> 3.一種具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白質(zhì)(A)在SEQID NO :2中，在3位和283位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔?，并還在至少一個選自101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；(B)在序列(A)中在除了3位、101位、157位、250位和283位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；(C)在選自SEQID NO :4、6、8、10和12的氨基酸序列中，或在與選自SEQ ID NO :2、4、 6、8、10和12的氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，在對應(yīng)于SEQ ID NO :2的3位和283位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔儯⑦€在至少一個選自對應(yīng)于101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；或(D)在序列(C)中在除了對應(yīng)于SEQID NO 2的3位、101位、157位、250位和283位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
4.一種具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白質(zhì)(A)在SEQID NO :2中，在2位和282位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔?，并還在至少一個選自101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；(B)在序列(A)中在除了2位、101位、157位、250位和282位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；(C)在選自SEQID N0:4、6、8、10和12的氨基酸序列中，或在與選自SEQ ID NO :2、4、 6、8、10和12的氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，在對應(yīng)于SEQ ID NO :2的2位和282位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔儯⑦€在至少一個選自對應(yīng)于101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；或(D)在序列(C)中在除了對應(yīng)于SEQID NO 2的2位、101位、157位、250位和282位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
5.一種具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白質(zhì)(A)在SEQID NO :2中，在2位和283位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔?，并還在至少一個選自101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；(B)在序列(A)中在除了2位、101位、157位、250位和283位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；(C)在選自SEQID NO :4、6、8、10和12的氨基酸序列中，或在與選自SEQ ID NO :2、4、 6、8、10和12的氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，在對應(yīng)于SEQ ID NO :2的2位和283位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔儯⑦€在至少一個選自對應(yīng)于101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；或(D)在序列(C)中在除了對應(yīng)于SEQID NO 2的2位、101位、157位、250位和283位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
6.一種具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白質(zhì)(A)在SEQID NO :2中，在7位和58位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔?，并還在至少一個選自101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；(B)在序列(A)中在除了7位、58位、101位、157位和250位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；(C)在選自SEQID N0:4、6、8、10和12的氨基酸序列中，或在與選自SEQ ID NO :2、4、 6、8、10和12的氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，在對應(yīng)于SEQ ID NO 2的7位和58位具有變?yōu)榘腚装彼岬耐蛔儯⑦€在至少一個選自對應(yīng)于101位、157位和250位的位置處具有突變的氨基酸序列；或(D)在序列(C)中在除了對應(yīng)于SEQID NO :2的7位、58位、101位、157位和250位之外的位置處具有一個至幾個殘基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)，其中在(A)或(B)中SEQID NO :2的101位、157位和250位， 或在(C)或(D)中對應(yīng)于這些位置的位置處的氨基酸突變?yōu)?01位突變?yōu)楦彼幔?57位突變?yōu)楸彼峄蚪z氨酸，250位突變?yōu)楸彼峄蚓彼帷?br> 8.權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有 SEQ ID NO 2 中的3位的天冬氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔?101位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?157位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸； 250位的甘氨酸突變?yōu)榫彼?；?283位的甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼帷?br> 9.權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在SEQID NO :2中，除了 3位的天冬氨酸突變?yōu)榘腚装彼岷?83位的甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼嶂?，還具有下述所示突變的組合之任一(1)101位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?57位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，和250位的甘氨酸突變?yōu)楸彼帷⒗i氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸或天冬氨酸；(2)157位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，250位的甘氨酸突變?yōu)榫彼?，?01位的絲氨酸突變?yōu)楦拾彼帷⒈彼?、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸或谷氨酸；或(3) 101位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?50為的甘氨酸突變?yōu)榫彼?，?57位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?、纈氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
10.權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在SEQID NO :2中，除了 3位的天冬氨酸突變?yōu)榘腚装彼岷?83位的甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼嶂猓€具有101位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?57位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?、絲氨酸或精氨酸；和250位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?、苯丙氨酸、絲氨酸、天冬酰胺或精氨酸。
11.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在SEQID NO :2中，除了 3位的天冬氨酸突變?yōu)榘腚装彼岷?83位的甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼嶂?，還具有下述所示的突變組合之任(1)101位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?57位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，和250位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?、苯丙氨酸、絲氨酸、天冬酰胺或精氨酸；(2)157位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，250位的甘氨酸突變?yōu)榫彼?，?01位的精氨酸突變?yōu)楦彼?；?3)101位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?50位的甘氨酸突變?yōu)榫彼幔?57位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?、絲氨酸或精氨酸。
12.權(quán)利要求7-11中任一項的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在SEQID NO :2中，進(jìn)一步包含208位的精氨酸突變?yōu)榱涟彼帷⒈彼峄蚬劝彼帷?br> 13.權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在SEQID NO :2中，進(jìn)一步包含(1)208位的精氨酸突變?yōu)樯彼幔?2)268位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０罚?3)132位的纈氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?4)238位的精氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔?5)249位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷?br> 14.一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-13中任一項的蛋白質(zhì)。
15.一種重組載體，其包含權(quán)利要求14的多核苷酸。
16.一種宿主細(xì)胞，其經(jīng)權(quán)利要求15的重組載體轉(zhuǎn)化。
17.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1至13中任一項的蛋白質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，并收集具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)。
18.—種處理底物蛋白的方法，包括允許權(quán)利要求1至13中任一項的蛋白質(zhì)、由權(quán)利要求17的方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞作用于底物蛋白的步驟。
19.權(quán)利要求18的方法，其中對底物蛋白的處理在40°C至100°C進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明致力于提供具有改良的耐熱性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。具體地，本發(fā)明提供了具有進(jìn)一步改良的耐熱性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶突變蛋白，如通過將適宜突變引入突變型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，從而摻入二硫鍵而獲得的。
文檔編號C12N15/09GK102341497SQ20108001074
公開日2012年2月1日 申請日期2010年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者伊達(dá)雅代, 橫山敬一, 鈴木基孝 申請人:味之素株式會社