包含馬來酰亞胺基核心的超分子聚集體的制作方法
【專利說明】包含馬來釀亞胺基核心的超分子聚集體 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及通式（VI)的超分子聚集體及其用于靶向和任選地遞送活性物質(zhì)的應(yīng) 用。特別地，本發(fā)明涉及與活性物質(zhì)形成超分子聚集體的新的馬來酰亞胺基官能化的核心。
[0002] 技術(shù)狀態(tài)
[0003] 用于設(shè)計多聚體大分子的化學(xué)策略已經(jīng)在近期的文獻中描述（B.D.Mather等人 Prog.Polym.Sci. 31 (2006)487-531 ;K.Sadler等人ReviewsinMolecularBiotechnology90,（2002) 195-229)。這類具有肽性質(zhì)的分子的第一個實例由Tam和同事提出（K.J.Chang 等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,（1988)4929-4933)作為在保持原始氨基酸序列的同時 增加肽大小的解決方案。由Tam設(shè)計的分子被應(yīng)用為用于產(chǎn)生抗體的"章魚免疫原"并且 此類免疫策略已被命名為多抗原肽（MAP)策略。MAP對蛋白水解的抗性的觀察開啟了肽作 為藥物的用途的前景。在這方面，MAP策略被應(yīng)用于合成作為眼鏡蛇毒素解毒劑、作為抗微 生物劑、作為用于腫瘤革E向的載體等的分支肽（A.Pini等人CurrentProteinandPeptide Science9,（2008)468-477))。另外，一小組神經(jīng)肽，包括腦啡肽類、神經(jīng)降壓素和痛敏肽/ 孤啡肽FQ(N/0FQ)，被以單體和四分支形式合成并與人血漿和血清孵育。所有四分支神經(jīng) 肽保留完整的生物活性，并通常顯示出對血液和腦蛋白酶活性的較高穩(wěn)定性（L.Bracci等 人J.Biol.Chem. 278,（2003) 56590-56595)。綜合來說，這些數(shù)據(jù)支持開發(fā)分支肽分子作為 創(chuàng)新的療法。此外，作為超分子聚集體的多聚體大分子越大，它們的合成、純化和分析表征 就越復(fù)雜。事實上，在通過標(biāo)準(zhǔn)固相合成技術(shù)的MAP裝配期間產(chǎn)生的雜質(zhì)在純化步驟期間 特別是當(dāng)需要長臂時不能夠被除去。文章（A.Pini等人CurrentProteinandPeptide Science9,（2008)468-477)的圖4幅C中報道的HPLC譜顯示了研究的四分支MAP的低純 度級別。通過標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成技術(shù)獲得的MAP分子的低純度級別提出了為了開發(fā)作為藥物 的分支分子即超分子聚集體所需要解決的重要問題。
[0004] 在ZhangXiaofen等人"macrocyclicchelatorassembledRGDmu1timer forturnertargenting'，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters, 21 卷 11 號，2011 年6月中，描述了用于靶向腫瘤中的肽裝配的大環(huán)螯合劑，1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二 烷-1，4, 7, 10-四乙酸（D0TA)。由于D0TA的結(jié)構(gòu)，D0TA-被更多地官能化，最終多聚體官 能化的產(chǎn)物的產(chǎn)量就降低，使得具有四肽的D0TA的產(chǎn)量非常低。
[0005] 因此，制備能夠保證不僅當(dāng)制備甚至完全官能化時高產(chǎn)量而且以高純度保持與待 被靶向至最終位點的分子連接的新的超分子聚集體是非常困難的。另一方面，超分子聚集 體還應(yīng)保證以可再生的方式與最終靶標(biāo)連接。
[0006] 因此，本發(fā)明的目的是不使用長的和困難的純化步驟以高產(chǎn)量地提供超分子聚集 體。
[0007] 此外，存在提供能夠以穩(wěn)定和可再生的方式連接和靶向活性物質(zhì)的新的超分子聚 集體的需求。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 因此通過式（VI)的超分子聚集體已經(jīng)實現(xiàn)了前述目的
[0010]
[0011] 其中
[0012] f、q彼此獨立地是從1到8的整數(shù)，
[0013] r和s彼此獨立地是從1到4的整數(shù)，
[0014] Y是從1到4的整數(shù)，并且
[0015] XpX2、X3和X4彼此獨立地是式⑴的部分并且
[0016]
[0017] ΧρX2、父3和X4中的至少一個是存在的，并且
[0018] 其中
[0019] A-S-是用巰基衍生的活性物質(zhì)或具有游離的巰基的活性物質(zhì)
[0020] 并且I是從1到10的整數(shù)。
[0021] 在本發(fā)明中，當(dāng)使用用于A-S-的定義"活性物質(zhì)"時，它意指待被靶向并遞送到靶 位點的活性物質(zhì)，諸如藥物、疫苗、診斷物質(zhì)。
[0022] 式（VI)的聚集體包括式（IV)的核心
[0023]
[0024] 以及XjP/或X2、X3和X4。
[0025] 在另一方面，本發(fā)明涉及式PWT2的馬來酰亞胺基官能化的核心
[0026]
[0027] 因此本發(fā)明通過提供作為包含馬來酰亞胺基部分的超分子聚集體的新的分支支 架解決了以上提到的問題（即分支分子的低純度）。連接至分支核心的此類馬來酰亞胺基 部分允許高產(chǎn)量的巰基-邁克爾加成反應(yīng)，并因此可用于包含巰基的分子的化學(xué)選擇性連 接（welding)。由于應(yīng)用的反應(yīng)的高產(chǎn)量和化學(xué)選擇性，所得的超分子聚集體可被容易地純 化。另外，包含核心的馬來酰亞胺基和巰基衍生的活性物質(zhì)之間的連接反應(yīng)需要的溫和條 件和該連接反應(yīng)的快速性有利地將此類方法延伸至具有低化學(xué)穩(wěn)定性的活性物質(zhì)。
[0028] 因此，在另一方面，本發(fā)明涉及用于制備本發(fā)明的超分子聚集體的方法，所述方法 包括將η個（A-SH)與式（VII)的化合物巰基-邁克爾加成反應(yīng)的步驟
[0029]
[0030] 其中
[0031 ] f、q彼此獨立地是從1到8的整數(shù)，
[0032] r和s彼此獨立地是從1到4的整數(shù)，
[0033] Y是1到4的整數(shù)，并且
[0034] ZpZ2、ZjPZ4彼此獨立地是式（II)的部分
[0035]
[0036] 并且ΖρZ2、&和Z4中的至少一個是存在的，
[0037] 并且I是從1到10的整數(shù)。
[0038] 因此，在本發(fā)明中，式（VII)的化合物優(yōu)選為PWT2。
[0039] 新的式（IV)的馬來酰亞胺基官能化的核心，即式（VII)的化合物，更特別為PWT2， 致使結(jié)構(gòu)上能夠不僅提供在巰基上與特定的活性物質(zhì)的精確連接，而且能夠?qū)⑦@樣的活性 物質(zhì)以可再生的方式靶向至被靶向的位點。
[0040] 不束縛于任何理論，本發(fā)明人認(rèn)為活性物質(zhì)的精確、可再生和與其穩(wěn)定的連接，以 及有效的靶向至靶位點的驚人特性是由于（IV)的馬來酰亞胺基官能化的核心更優(yōu)選為 PWT2的特定結(jié)構(gòu)。
[0041] 在另一方面，本發(fā)明涉及用于將活性物質(zhì)A靶向和任選地遞送至靶位點的超分子 聚集體。
[0042] 所得的超分子聚集體可用于例如藥物、疫苗領(lǐng)域中、作為GPCR的配體（激動劑以 及拮抗劑）、作為抗生素、作為診斷物質(zhì)（即作為放射性配體的PWT2衍生物）以及將單個生 物活性藥理單元連接到多官能支架可以是有價值的所有領(lǐng)域中。
【附圖說明】
[0043] 在下文中參考附圖詳細(xì)描述本發(fā)明，其中：
[0044] 圖1示出了PWT2的合成方案
[0045] 圖2示出了PWT2的質(zhì)譜（計算的M.W. 861. 37775)(計算的PWT2+Na M.ff. 883. 35969)
[0046] 圖3示出了PWT2-N/0FQ的化學(xué)式和HPLC譜
[0047] 圖 4 示出了PWT2-N/0FQ的質(zhì)譜（計算的M.W. 8505. 69)
[0048] 圖5.對CH0N0P+Gaqi5細(xì)胞進行的鈣動員測定。N/0FQ、PWT2_N/0FQ的濃度響應(yīng)曲 線（左圖）。針對抗N/0FQ和PWT2衍生物的刺激效應(yīng)的SB-612111的抑制響應(yīng)曲線（右 圖）。數(shù)據(jù)為以一式兩份做出的至少4組實驗的平均值土sem。
[0049] 圖6.在電刺激的小鼠輸精管中N/0FQ和PWT2-N/0FQ的濃度響應(yīng)曲線。值為3組 獨立實驗的平均值土sem。
[0050] 圖7.N/0FQ(頂圖）和PWT2-N/0FQ(底圖）的濃度響應(yīng)曲線的典型追蹤。記錄 PWT2-N/0FQ作用和洗滌后缺乏逆轉(zhuǎn)的緩慢動力學(xué)。
[0051] 圖8.在SB-612111 (ΙΟΟηΜ)的不存在（對照）和存在下在電刺激的小鼠輸精管中 獲得的N/0FQ(頂圖）、PWT2-N/0FQ(底圖）的濃度響應(yīng)曲線。值為至少3組獨立實驗的平 均值土sem。
[0052]圖9.在取自NOP(+/+)和NOP(-/-)小鼠的輸精管組織中獲得的N/0FQ(頂圖）、 PWT2-N/0FQ(底圖）的濃度響應(yīng)曲線。值為3組獨立實驗的平均值土sem。
[0053] 圖 10.小鼠運動活性。等效i.c.V.劑量的N/OFQ(lOnmol)、PWT2-N/0FQ(0· 25nmol) 對動物運動距離（頂圖）、不動時間（中圖）、和豎起（底圖）的效應(yīng)。結(jié)果表示為從下午 4時至上午9時的時間過程（左圖）和累積效應(yīng)（右圖）。數(shù)據(jù)為每組10-12只小鼠的平 均值土sem。根據(jù)AN0VA隨后是用于多重比較的Bonferroni's檢驗相比于鹽水*p〈0. 05。
[0054] 發(fā)明詳述
[0055] 因此本發(fā)明涉及式（VI)的超分子聚集體
[0056]
[0057] 其中
[0058] f、q彼此獨立地是從1到8的整數(shù)，
[0059] r和s彼此獨立地是從1到4的整數(shù)，
[0060] Y是從1到4的整數(shù)，并且
[0061] XpX2、X3和X4彼此獨立地是式⑴的部分并且
[0062]
[0063]X。X2、&和X4中的至少一個是存在的，并且 [0064] 其中
[0065]A-S-是用巰基衍生的活性物質(zhì)或具有游離的巰基的活性物質(zhì)
[0066] 并且I是從1到10的整數(shù)。
[0067] 在本發(fā)明中，當(dāng)使用用于A-S-的定義"活性物質(zhì)"時，它意指待被靶向并遞送到靶 位點的活性物質(zhì)，諸如藥物、疫苗、診斷物質(zhì)。
[0068] 式（VI)的聚集體包括式（IV)的核心
[0069]
[0070] 和XJP/或X2、X3和X4中的至少一部分。
[0071] 在式（VI)的聚集體中和在式（IV)的核心中，f、q彼此獨立地是從1到8的整數(shù)， 優(yōu)選地f是3且q是2,r和s彼此獨立地是從1到4的整數(shù)，優(yōu)選地它們等于1，并且Y是 從1到4的整數(shù)，更優(yōu)選地是1。在本發(fā)明的超分子聚集體的式（I)的部分中，I是3。
[0072] 根據(jù)本發(fā)明，在超分子聚集體（VI)中X2、XjPX4彼此獨立地是連接的馬來酰 亞胺基片段，所述馬來酰亞胺基片段轉(zhuǎn)而通過巰基連接至用巰基衍生的或具有巰基基團的 活性物質(zhì)A。
[0073] 因此本發(fā)明涉及式（IV)的馬來酰亞胺基官能化的核心。
[0074] 在另一方面，本發(fā)明涉及式PWT2的馬來酰亞胺基官能化的核心
[0075]
[0076] 馬來酰亞胺基官能化的核心連接至巰基活性物質(zhì)A。
[0077] 因