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豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗及其制備方法

文檔序號:584938閱讀:691來源:國知局
專利名稱:豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)
豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)是圓環(huán)病毒屬的代表種,它是一種小而 無囊膜、二十面體對稱、共價(jià)閉合、環(huán)狀、單股DNA病毒,病毒粒子直徑平均為17nm,是目前 獸醫(yī)學(xué)上發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。根據(jù)PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列的不同,可將 PCV分為豬圓環(huán)病毒1型(PCVl)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)兩個(gè)型。PCVl對豬無致病性, 為非致病性PCV。PCV2對豬有致病性,可引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome, PMWS),又稱 PMWS 相關(guān) PCV。Hamel 等通過對 PCV 基因組 分析,發(fā)現(xiàn)PCVl和PCV2均可能含有11個(gè)開放閱讀框(Openreading frame, 0RF)。PCV2閱 讀框中,ORFl和開放閱讀框2(0RF2)為主要閱讀框?,F(xiàn)已證實(shí)ORFl編碼與病毒復(fù)制相關(guān) 的R印蛋白,0RF2全長702bp,編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白及病毒核衣殼蛋白(Cap)。PCV2在 細(xì)胞上的增值滴度很低,很難應(yīng)用傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗。新型的疫苗如DNA疫苗,免 疫效率并不高;而亞單位疫苗比DNA疫苗有更好的免疫力?,F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了利用昆蟲細(xì)胞的一個(gè)便利和多用途的桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng) (Baculovirus Expression Systems)。桿狀病毒的特征是通常包含在包涵體(也稱為多角 體)的桿狀病毒顆粒。桿狀病毒科可以分為兩個(gè)亞科真桿狀病毒,有兩個(gè)包涵體病毒屬, 即核多角體病毒(NPV)和顆粒體病毒(GV);和包括非包涵體病毒的亞科裸桿狀病毒。許多 蛋白質(zhì)已經(jīng)在編碼該蛋白質(zhì)的重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)提 供了生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的有力工具。昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)十分成熟,昆蟲細(xì)胞的 微載體培養(yǎng)技術(shù)和懸浮培養(yǎng)技術(shù)為大規(guī)模制備重組蛋白提供了條件。我國每年因豬圓環(huán)病 毒2型的爆發(fā)給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,利用桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì) 胞中大量表達(dá)重組0RF2蛋白,研制出具有良好免疫效果的亞單位疫苗,對于豬圓環(huán)病毒相 關(guān)病毒的防制具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此,本發(fā)明的主要目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的制備方 法,包括以下步驟(1).克隆豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因并引入信號肽基因序列,轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移載體,獲得 包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的轉(zhuǎn)移載體;(2).包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化入含有穿梭載體的大腸 桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,獲得包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的穿梭載體,再將該穿梭載體 轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞中,獲得重組桿狀病毒;(3).重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng);(4).由重組桿狀病毒的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型重組
30RF2蛋白,收獲和純化豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白;(5).利用豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白,輔以佐劑,經(jīng)乳化,制備豬圓環(huán)病毒2型 亞單位疫苗。優(yōu)選地,本發(fā)明步驟(1)中豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因序列包含序列表中的SEQ ID NOl。優(yōu)選地,本發(fā)明步驟(1)中信號肽基因序列包括蜂毒素信號肽核苷酸序列。優(yōu)選地,本發(fā)明所述的蜂毒素信號肽核苷酸序列包含序列表中的SEQ ID N02。優(yōu)選地,本發(fā)明步驟(2)中所述重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因的表達(dá)受多角體啟 動(dòng)子的控制。優(yōu)選地,本發(fā)明步驟(4)中所述的重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白序列包含序列表 中的 SEQ ID N03。優(yōu)選地,本發(fā)明所述的重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白是下面任意一種多肽i)選自序列表中SEQ ID N03序列的多肽;ii)與i)所述多肽至少80%同源的多肽;iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。優(yōu)選地,本發(fā)明步驟(5)中所述的佐劑為水性佐劑或油性佐劑。本發(fā)明的另一個(gè)方面為使用本發(fā)明方法制備的豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)方面為使用本發(fā)明方法制備的豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗。優(yōu)選地,本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗包含至少1微克/頭份的豬圓 環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白。發(fā)明效果(1)目的蛋白表達(dá)的高效性選用蜂毒素分泌信號對目的基因進(jìn)行分泌表達(dá),使 目的蛋白在桿狀病毒_昆蟲細(xì)胞中獲得高效表達(dá)。(2)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前頗受歡迎的一種表達(dá)系統(tǒng),他可以進(jìn)行多種翻譯后 修飾作用,包括糖基化、脂肪酸酰化、氨基末端乙?;?、羧基末端酰胺化和信號肽切割、轉(zhuǎn) 運(yùn),所表達(dá)蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與天然蛋白比較接近。重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)的 重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白進(jìn)行了多種翻譯后加工和修飾作用,具有較高的生物學(xué)活 性。(3)生物安全性桿狀病毒具有高度的種屬特異性,僅感染昆蟲,對脊椎動(dòng)物無感 染性,其表達(dá)產(chǎn)物安全可靠。(4)制備方便,成本低廉重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞能分泌表達(dá)重組豬圓環(huán) 病毒2型0RF2蛋白,只需經(jīng)過超濾純化、滅活等簡單處理程序即可以直接應(yīng)用于畜禽疾病 的臨床應(yīng)用。(5)疫苗免疫保護(hù)效果較好通過動(dòng)物試驗(yàn)檢測該亞單位疫苗效果,免疫保護(hù)率 在80%以上。


圖1為PCR擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型0RF2序列的結(jié)果;圖2為鑒定豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白的SDS-PAGE電泳圖3為豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白的Western blotting圖;圖4為豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白的表達(dá)量測定;圖5為重組病毒vBac-P2構(gòu)建流程圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例中采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bae Baculovirus Expression System, Invitrogen)對豬圓環(huán)病毒2型的0RF2基因進(jìn)行全基因擴(kuò)增,并在 5'端引入蜂毒素信號肽核苷酸序列,構(gòu)建含有蜂毒素信號肽核苷酸序列和豬圓環(huán)病毒2 型0RF2序列的開放閱讀框的重組桿狀病毒,感染昆蟲細(xì)胞,表達(dá)具有高效豬圓環(huán)病毒2型 抗原性的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白,制備成含有豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白的亞 單位疫苗。通過仔豬攻毒試驗(yàn),驗(yàn)證該亞單位疫苗具有良好的免疫保護(hù)作用。本發(fā)明實(shí)施例中利用豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白,輔以佐劑,并使用本領(lǐng)域常 用的乳化方法,制備豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗。其他本領(lǐng)域常用的佐劑,包括油性佐劑或 水性佐劑,其他本領(lǐng)域常用的疫苗乳化劑、穩(wěn)定劑,其他本領(lǐng)域常用的疫苗制備手段,都可 利用本發(fā)明之PCV2重組0RF2蛋白進(jìn)行疫苗的制備。本發(fā)明實(shí)施例中PCV2重組0RF2蛋白為含序列SEQ ID N03的多肽;使用本發(fā)明之 方法還可生產(chǎn)如下重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白與含序列表中SEQ ID N03序列的多肽至 少80%同源的多肽及含上述多肽的免疫原性部分的多肽。制備上述多肽的實(shí)施例方法與過 程與本發(fā)明實(shí)施例相同,下面不再累述。本發(fā)明實(shí)施例中優(yōu)選了疫苗成品PCV2重組0RF2蛋白的含量為0. 2微克/頭份、1 微克/頭份、2微克/頭份、4微克/頭份、8微克/頭份、16微克/頭份和40微克/頭份。 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例,當(dāng)劑量大于0. 1微克/頭份時(shí)即可以對豬產(chǎn)生良好的免疫效果。制備 好的疫苗經(jīng)粘度檢測、離心檢測、劑型檢測、穩(wěn)定性檢測后,各項(xiàng)指標(biāo)均符合規(guī)定。疫苗保存 于4°C。每頭份為2ml。本發(fā)明術(shù)語頭份的含義為一般情況下,免疫一頭牲畜所需的疫苗用 量。為使本發(fā)明更加容易理解,下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這 些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍,下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn) 方法,通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。實(shí)施例1豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的制備方法1、克隆豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因并引入蜂毒素信號肽基因序列,轉(zhuǎn)入pMD-18T載 體,獲得包含豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因的重組載體 首先設(shè)計(jì)弓 I 物 Spe-ATG (5 ‘ -cgactagtatgacgtatccaaggaggcgt-3 ‘)禾口弓 I 物 H ind-TAA (5 ‘ -gcaagctttattcattaagggttaagttggg-3 ‘),以保藏號為 CGMCC No. 2389 的 PCV2-SH株的基因組DNA為模板,擴(kuò)增PCV20RF2基因,并將擴(kuò)增的0RF2基因克隆入pMD_18T 載體中,獲得重組載體PT-0RF2。PCR產(chǎn)物大小約730bp,結(jié)果見附圖1。其中,第1孔為DNA Marker2000 ;第2孔為PCV2 0RF2擴(kuò)增產(chǎn)物;第3孔為PCR陰性對照。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測 序,由電泳及測序結(jié)果可知,重組載體PT-0RF2含序列表中的SEQ ID NOl序列。
設(shè)計(jì)四條引物,以pT-0RF2為模板,通過融合PCR方法在0RF2基因序列5、端引入 蜂毒素信號肽核苷酸序列和限制性酶Spe I和Hind III酶切位點(diǎn)。引物如下
HBM-Fl5‘ _tttcttacatctatgcgacgtatccaaggaggcgt_3‘HBM-Rl5‘ -ggcaacgttgactaagaatttcatactagtatcgtccac-3‘HBM-F25‘ -ttatggtcgtatacatttcttacatctatgcg-3‘HBM-R25‘ _aaacaagggcaacgttgactaagaatttc_3‘通過Spe I和Hind III雙酶切帶有蜂毒素信號肽核苷酸序列的0RF2序列,并將其 克隆入轉(zhuǎn)移載體pFastBaCTMl (Invitrogen),構(gòu)成包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的載 體pFastBaCP2。用PCR擴(kuò)增并測序,由測序結(jié)果可知,重組轉(zhuǎn)移載體pFastBaCP2含蜂毒素 信號肽核苷酸序列,即含序列表中的SEQ ID N02序列。2、包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化入含有穿梭載體的大腸桿 菌感受態(tài)細(xì)胞中,獲得包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的穿梭載體,再將該穿梭載體轉(zhuǎn) 染入昆蟲細(xì)胞中,獲得重組桿狀病毒vBac-P2 ;將pFastBacP2轉(zhuǎn)化含有病毒穿梭質(zhì)粒Bacmid的大腸桿菌DHlOBac (購自 Invitrogen公司),獲得重組質(zhì)粒Bacmid-P2 ;PCR篩選,提取陽性質(zhì)粒,制備陽性重組質(zhì)粒 Bacmid-P2DNA0 采用Cellfectin Reagent 轉(zhuǎn)染 Sf9 細(xì)胞(購自 Invitrogen 公司),待細(xì)胞 出現(xiàn)病變后,進(jìn)行重組病毒噬斑純化和病毒擴(kuò)增,然后通過通用引物M13F和M13R進(jìn)行PCR 驗(yàn)證目的重組0RF2基因。純化獲得重組桿狀病毒,命名為vBac-P2,重組病毒構(gòu)建的過程和 方法參見圖5。擴(kuò)增重組桿狀病毒vBac-P2作為種毒,通過噬斑法進(jìn)行效價(jià)滴定后于4°C保 存?zhèn)溆谩?、重組桿狀病毒vBac-P2感染昆蟲細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)將vBac-P2重組桿狀病毒感染懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞High Five (購自Invitrogen 公司)。在含有200 350ml的EXPRESS FIVE SFM培養(yǎng)基的500ml轉(zhuǎn)瓶中無菌懸浮培養(yǎng) High Five 細(xì)胞,接種細(xì)胞密度為0.3 0.6X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到IXlO6 個(gè)細(xì)胞/ml時(shí),用重組病毒vBac-P2接種各轉(zhuǎn)瓶,接種到各轉(zhuǎn)瓶中的重組桿狀病毒具有不 同的感染復(fù)數(shù)(M. 0. I.),分別是0. 01,0. 1、1。接種重組桿狀病毒后,以26 28°C,轉(zhuǎn)速為 lOOrpm,培養(yǎng)4天。4、重組桿狀病毒的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2 蛋白,收獲和純化豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白;①豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白的表達(dá)在以步驟(3)中所述培養(yǎng)條件培養(yǎng)的High Five 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,接種后每12小 時(shí)對各瓶取樣,即48h、60h、72h、84h和96h取樣。各樣品以10,OOOg離心20分鐘,分離上 清液和沉淀。上清液通過1 μ m的濾膜進(jìn)行過濾,過濾后進(jìn)行SDS-PAGE電泳和紫外分光光 度計(jì)測定上清液中的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白及其含量。結(jié)果見附圖4,其中,橫坐標(biāo)表示重組病毒以不同的M.O. I.感染High Five 細(xì)胞 后不同的取樣時(shí)間點(diǎn),縱坐標(biāo)為不同的取樣時(shí)間點(diǎn)樣品中重組蛋白的含量。由結(jié)果可知,在 重組病毒感染細(xì)胞72小時(shí)后上清中重組蛋白含量達(dá)到60微克/毫升以上。結(jié)果說明重組 病毒感染細(xì)胞后,培養(yǎng)至少72h后回收培養(yǎng)上清,能夠顯著提高豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2 蛋白的產(chǎn)率。②豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白的鑒定采用Western blotting鑒定表達(dá)的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白。分別收集重組桿狀病毒感染的High Five 細(xì)胞,經(jīng)3,000r/min離心IOmin取上清,進(jìn)行SDS-PAGE電 泳,結(jié)果見圖2 ;其中,第1孔為蛋白質(zhì)Marker ;第2孔為細(xì)胞陰性對照;第3孔為vBac-P2 感染48h后收獲的培養(yǎng)上清;第4孔為vBac-P2感染72h后收獲的培養(yǎng)上清。SDS-PAGE蛋 白質(zhì)電泳凝膠觀察到大小約為28. 2KDa的特異性條帶,即為重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋 白。將目的蛋白進(jìn)行測序,由電泳及測序結(jié)果可知,重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白序列含 序列表中的SEQ ID N03序列。SDS-PAGE電泳后,再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,封閉液封 閉后,加上針對豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白的單抗,再加上帶有標(biāo)記物的二抗。然后判定重 組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白的表達(dá)。結(jié)果見附圖3,其中,第1孔為藍(lán)色預(yù)染低分子量蛋 白質(zhì)Marker ;第2孔為vBac-P2表達(dá)蛋白;第3孔為陰性對照。用Westernblotting分析 表達(dá)的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白。用豬的抗豬圓環(huán)病毒2型高免血清對重組豬圓環(huán) 病毒2型0RF2蛋白進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,在硝酸纖維素膜上僅觀察到一條分子量大小與預(yù) 期大小一致的特異性條帶,說明表達(dá)的重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白能夠與豬圓環(huán)病毒2 型抗體特異性結(jié)合,說明重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白具有特異的豬圓環(huán)病毒2型免疫原 性。③收獲和純化豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白將培養(yǎng)物經(jīng)IOOOOg離心20分鐘,分離沉淀和上清液,上清液通過1 μ m的濾膜進(jìn) 行過濾,然后通過超濾濃縮純化,超濾膜孔徑為10000 (切割分子量),純化后的樣品溶液經(jīng) 7mM 二乙烯亞胺(BEI)滅活重組桿狀病毒載體,36 48小時(shí),加入等量的硫代硫酸鈉中和。 然后通過紫外分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白含量測定。5、利用豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白,輔以佐劑,制備豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫
田ο準(zhǔn)備不同濃度的抗原稀釋物,并與油佐劑ISA206佐劑混合乳化。ISA206佐劑 經(jīng)12rC、60min高壓濕熱滅菌,按照抗原/佐劑體積比例46 54混合。使用德國產(chǎn)IKA 2000/4型乳化機(jī),先將佐劑加入乳化機(jī)料筒內(nèi),在攪拌狀態(tài)下(lOOr/min)緩緩將抗原水相 滴入佐劑中,滴完后,繼續(xù)攪拌5min。用乳化機(jī)5000r/min,循環(huán)乳化4min,得到亞單位疫苗成品。優(yōu)選地,疫苗成品重組0RF2蛋白的的含量為0. 2微克/頭份、1微克/頭份、2微 克/頭份、4微克/頭份、8微克/頭份、16微克/頭份和40微克/頭份。制備好的疫苗經(jīng) 粘度檢測、離心檢測、劑型檢測、穩(wěn)定性檢測后,各項(xiàng)指標(biāo)均符合規(guī)定。疫苗保存于4°C。每 頭份為2ml。本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白抗原還可以與其他的油性佐劑、水性佐劑或其他佐劑混合 使用,如本領(lǐng)域常見的白油佐劑、鋁膠佐劑、弗氏佐劑等等。實(shí)施例2 PCV2亞單位疫苗的效力檢測對洛陽某豬場的豬進(jìn)行主要病原和相關(guān)抗體檢測,選用10-14日齡的豬圓環(huán)病 毒、豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬細(xì)小病毒等主要病原陰性豬。將符合條件的仔豬隨機(jī)分為9組,每組10頭,7組給予包含不同量重組0RF2蛋白 的亞單位疫苗(分別包含重組0RF2蛋白0. 2微克/頭份、1微克/頭份、2微克/頭份、4微 克/頭份、8微克/頭份、16微克/頭份和40微克/頭份),1組做為攻毒對照,另1組做為陰性對照。其中,第1組給予包含重組0RF2蛋白0. 2微克/頭份的亞單位疫苗;第2組給 予包含重組0RF2蛋白1微克/頭份的亞單位疫苗;第3組給予包含重組0RF2蛋白2微克/ 頭份的亞單位疫苗;第4組給予包含重組0RF2蛋白4微克/頭份的亞單位疫苗;第5組給 予包含重組0RF2蛋白8微克/頭份的亞單位疫苗;第6組給予包含重組0RF2蛋白16微克 /頭份的亞單位疫苗;第7組給予包含重組0RF2蛋白40微克/頭份的亞單位疫苗;第8組 做為攻毒對照組,不給予任何包含重組0RF2蛋白的亞單位疫苗。第1 7組進(jìn)行兩次免疫, 間隔2周。在第二次免疫后21天對第1 8組進(jìn)行病毒攻擊,毒株選用PCV2-SH株(CGMCC No. 2389) (106 0TCID50/ml),每頭豬滴鼻1ml,頸部肌肉注射2ml,隔離飼養(yǎng)。攻毒后第4、7天 分別在兩腋下和兩臀部注射弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍(lán)蛋白(4mg/ml,0.5ml)和腹 腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基10ml。在第11天和19天腹腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基10ml。攻毒后 25天進(jìn)行剖殺。第9組做為陰性對照組,單獨(dú)隔離飼養(yǎng),在第1 8組攻毒后25天進(jìn)行剖 殺。所有豬只在第1次免疫前、攻毒前和剖殺前收集血樣。在第1次免疫前、攻毒前和剖殺前對所有豬只收集血樣,通過ELISA法進(jìn)行PCV2 血清抗體分析。攻毒后25天剖檢全部豬只,觀察各組織器官病理變化、拍照記錄。符合以 下3項(xiàng)中的任何2項(xiàng),即可判為發(fā)病。A.臨床癥狀仔豬體溫升高(彡400C ),應(yīng)至少持續(xù) 3日,出現(xiàn)明顯食欲減退、精神沉郁、被毛粗亂、消瘦和生長速度減緩;B.病理變化腹股溝 和氣管淋巴結(jié)水腫、肺臟輕度水腫,腎臟發(fā)黃或有點(diǎn)狀壞死。組織學(xué)病變?yōu)榱馨徒Y(jié)有明顯淋 巴細(xì)胞侵入,或有多核巨細(xì)胞;C.病毒檢測用PCR檢測淋巴結(jié)組織,檢測到PCV2。結(jié)果本實(shí)施例結(jié)果如下。表1是各組試驗(yàn)豬在第1次在第1次免疫前、攻毒前和剖殺前對所有豬只收集的 血樣進(jìn)行ELISA檢測血清中PCV2特異性抗體的結(jié)果。表1.各組試驗(yàn)豬PCV2血清抗體分析結(jié)果
組別PCV2抗體陽性率(%)第1次免疫前攻毒前剖殺前第1組090100第2組0100100第3組0100100第4組0100100第5組0100100第6組0100100第7組0100100第8組00100第9組000
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表2.是各組試驗(yàn)動(dòng)物在剖殺前觀察臨床表現(xiàn)和剖殺后進(jìn)行病理變化檢測和淋巴 結(jié)PCR檢測病毒的試驗(yàn)結(jié)果。表2.各組試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病判定結(jié)果 結(jié)果分析根據(jù)試驗(yàn)動(dòng)物臨床癥狀、剖檢病理變化檢測和病原的PCR檢測判斷結(jié) 果,其中第8組攻毒對照組仔豬全部發(fā)病。第1組試驗(yàn)動(dòng)物有5只發(fā)病,亞單位疫苗保護(hù)率 為50%,第2組試驗(yàn)動(dòng)物有1只發(fā)病,保護(hù)率為90%,第3 7組試驗(yàn)動(dòng)物均沒有發(fā)病,保 護(hù)率均為100%。第2組亞單位疫苗效果明顯好于第1組,臨床上認(rèn)為當(dāng)大約80%或更多 的動(dòng)物被保護(hù)時(shí),畜群即獲得了保護(hù),可以推斷必須包含PCV2重組0RF2蛋白1微克/頭份 或者更多蛋白的亞單位疫苗可以給動(dòng)物提供保護(hù),以能有效的保護(hù)畜群對抗PCV2。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi),所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的制備方法,其特征在于,所述方法包括以下步驟(1).克隆豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因并引入信號肽基因序列,轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移載體,獲得包含豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2基因的轉(zhuǎn)移載體;(2).包含豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2基因的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化入含有穿梭載體的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,獲得包含豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2基因的穿梭載體,再將該穿梭載體轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞中,獲得重組桿狀病毒;(3).重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng);(4).由重組桿狀病毒的豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2基因表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2蛋白,收獲和純化豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2蛋白;(5).利用豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2蛋白,輔以佐劑,經(jīng)乳化,制備豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步驟(1)中豬圓環(huán)病毒2型0RF2 基因序列包含序列表中SEQ ID NOl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步驟(1)中信號肽基因序列包括蜂 毒素信號肽核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,所述的蜂毒素信號肽核苷酸序列包含序 列表中SEQ ID N02。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步驟(2)中所述重組豬圓環(huán)病毒2 型0RF2基因的表達(dá)受多角體啟動(dòng)子的控制。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟(4)中所述的重組豬圓環(huán)病毒2 型0RF2蛋白序列包含序列表中的SEQ IDN03。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟(4)中所述的重組豬圓環(huán)病毒2 型0RF2蛋白是下面任意一種多肽i)含有序列表中SEQ ID N03序列的多肽; )與i)所述多肽至少80%同源的多肽;iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟(5)中所述的佐劑為水性佐劑或 油性佐劑。
9.由權(quán)利要求1 7任意一項(xiàng)方法制備的豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白。
10.由權(quán)利要求1 8任意一項(xiàng)方法制備的豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白亞單位疫苗。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗,其特征在于,所述疫苗包含至 少1微克/頭份的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白。
全文摘要
本發(fā)明的主要目的在于提供一種PCV2亞單位疫苗及其制備方法,具體地說是,利用桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中大量表達(dá)重組ORF2蛋白,研制出具有良好免疫效果的亞單位疫苗。采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac Baculovirus ExpressionSystem)對豬圓環(huán)病毒2型的ORF2基因進(jìn)行全基因擴(kuò)增,并在5′端引入蜂毒素信號肽核苷酸序列,構(gòu)建含有蜂毒素信號肽核苷酸序列和PCV2ORF2基因序列的開放閱讀框的重組桿狀病毒,感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)出具有高效良好PCV2抗原性的重組ORF2蛋白,制備成含有PCV2重組ORF2蛋白的亞單位疫苗。通過仔豬攻毒試驗(yàn),驗(yàn)證該亞單位疫苗具有良好的免疫保護(hù)作用。
文檔編號C12N15/34GK101884787SQ20101023663
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者喬榮岑, 孫進(jìn)忠, 張?jiān)S科 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司
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