專利名稱：抗豬圓環(huán)病病毒的轉(zhuǎn)移因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物及其制劑領(lǐng)域，更具體地說，是涉及一種抗豬圓環(huán)病病毒的轉(zhuǎn)移
因子。
背景技術(shù)：
近年來，豬圓環(huán)病病毒病作為一種新的病毒病在許多國家廣泛流行。豬圓環(huán)病病 毒II型可引起斷奶子豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬間質(zhì)性肺炎、豬皮炎腎病綜合征)以及母豬 繁殖障礙等，這些病總稱為豬圓環(huán)病病毒病。 繁殖障礙豬圓環(huán)病病毒II型可導(dǎo)致母豬返情率增高，流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎和 弱子等，所產(chǎn)子豬斷奶前死亡率上升。公豬感染圓環(huán)病毒II型后，可通過交配傳染給與配 母豬，從而導(dǎo)致其繁殖障礙。 豬皮炎和腎病綜合征本病通常發(fā)生于8 18周齡的豬，病豬食欲廢絕，體溫升高 至41.5t:，皮下水腫。皮膚出現(xiàn)紫紅色病變斑塊，在會陰部和四肢最為明顯，這些斑塊有時 會相互融合。在極少情況下皮膚病變會消失。也有的病變表現(xiàn)為豬的后軀部位出現(xiàn)紫紅色 淤血、淤點或淤斑。可視的淺表淋巴結(jié)腫大，出現(xiàn)黃色胸水或心包積液。腎臟呈腎小球性腎 炎和間質(zhì)性腎炎，表面可見淤血點。常見癥狀還有嚴(yán)重下痢和呼吸困難，以及被毛粗亂。
間質(zhì)性肺炎間質(zhì)性肺炎主要危害6 14周齡的豬，發(fā)病率為2% 30%，死亡率 為4% 10%。眼觀病變?yōu)閺浡蚤g質(zhì)性肺炎，顏色呈灰紅色。有時可見肺部存在II型肺 細(xì)胞增生區(qū)和細(xì)支氣管上皮壞死并含壞死細(xì)胞碎片的區(qū)域，肺泡腔內(nèi)有時可見透明蛋白。
斷奶子豬多系統(tǒng)衰竭綜合征多發(fā)于6 8周齡子豬，發(fā)病率為20% 60%，死亡 率為5% 35% 。子豬斷奶后2 3周出現(xiàn)以咳嗽、呼吸困難、逐漸消瘦、死亡率和淘汰率均
顯著升高為特征的疾病。病豬發(fā)熱(一般不超過4rc)，食欲減退，繼而出現(xiàn)消瘦、被毛粗
亂、皮膚蒼白或黃疸、呼吸困難等癥狀。個別豬眼睛有分泌物，腹瀉，肘關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)腫脹。 其剖檢特征為全身淋巴結(jié)腫大和發(fā)生心包炎、胸膜肺炎、腹膜炎等，使用多種抗生素治療效 果不理想。 圓環(huán)病毒II型可致使感染豬的免疫力大大降低，從而為其他病毒或病菌的入侵 創(chuàng)造了條件。如圓環(huán)病毒與藍(lán)耳病病毒協(xié)同作用，使豬繼發(fā)感染金色葡萄球菌、鏈球菌時， 從而使病豬出現(xiàn)體溫升高、充血性皮疹、嘔吐、腹瀉、呼吸困難等，由于這些細(xì)菌所產(chǎn)毒素在 本病發(fā)生中所起的關(guān)鍵作用，可引起豬多器官功能衰竭綜合征。 盡管目前市場上有一些抗豬圓環(huán)病的臨床用藥，但是現(xiàn)有藥劑的爭對性不強(qiáng)，療 效有限，而且，治療性制劑多是發(fā)病后采用的，不能起到預(yù)防的作用。對于易感染豬圓環(huán)病 的豬群。每年定期的對豬接種豬圓環(huán)病病毒疫苗是預(yù)防豬圓環(huán)病的有效方法，其次應(yīng)增強(qiáng) 營養(yǎng)或藥物干預(yù)，提高自身免疫力，通過藥物提高機(jī)體抵抗力或免疫力也是一種預(yù)防豬圓 環(huán)病的有效方法。 轉(zhuǎn)移因子(TF， Transfer Factor)是從淋巴細(xì)胞中提取的一類低分子肽與核苷酸 復(fù)合物，具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)免疫功能、增強(qiáng)機(jī)體非特異性細(xì)胞免疫功能等作用，被譽(yù)為T細(xì)胞活性的觸發(fā)劑，細(xì)胞免疫的增強(qiáng)劑、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)劑及干擾素 產(chǎn)生啟動劑。轉(zhuǎn)移因子分子量小、無毒、無抗原性、不起過敏反應(yīng)，不產(chǎn)生對抗抗體且可超越 種系界限應(yīng)用等優(yōu)點。自美國著名的免疫學(xué)專家Lawrence發(fā)現(xiàn)和研究轉(zhuǎn)移因子以來，世界 各國不但進(jìn)行了許多理論研究，而且進(jìn)行了大量的臨床應(yīng)用研究，使得轉(zhuǎn)移因子成為目前 應(yīng)用廣泛的增強(qiáng)免疫制劑。 目前已報道的提取的轉(zhuǎn)移因子大多數(shù)都是關(guān)于非特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法。本 發(fā)明采用病毒免疫抗原的方法提取特異性的轉(zhuǎn)移因子，提取方法在已報道的傳統(tǒng)方法基礎(chǔ) 上加以改進(jìn)，縮短生產(chǎn)時間，簡化生產(chǎn)工藝。 采用特殊的病毒株免疫抗原提取抗豬圓環(huán)病病毒的轉(zhuǎn)移因子，具有重要的理論和 現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種天然高效的 抗豬圓環(huán)病病毒的轉(zhuǎn)移因子。 本發(fā)明的第一個目的是提供一種簡單有效的抗豬圓環(huán)病轉(zhuǎn)移因子的制備方法，步 驟包括 (1)先用注射用水洗凈用豬圓環(huán)病病毒抗原免疫過的豬脾臟，去其表面的筋膜、脂 肪等組織，再用生理鹽水沖洗； (2)將洗凈的豬脾臟剪碎，加入1 2倍冷的lOmmol PBS緩沖液，用高速組織搗碎 機(jī)1000 3000rpm搗碎3 5次，每次3 5min，制得豬脾勻漿液；
(3)豬脾勻漿液用超聲波(4KW、3KHz)處理5 10min ; (4)將步驟(3)中得到的勻漿液用HC1調(diào)pH5. 0 6. 0或者加入0. 1 0. 3%檸 檬酸，4°C ， 3000 8000rpm離心10 30min，收集上清液； (5)上清液用O. 2iim中空纖維柱微濾，濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的中 空纖維柱超濾，收集濾出液； (6)將超濾得到的濾液用0. 22 ii m濾膜進(jìn)行無菌過濾，即得到抗豬圓環(huán)病病毒轉(zhuǎn)
移因子原液，4t:保存。 在具體實施方案中，實施上述步驟之前，步驟還包括制備病毒抗原、提取病毒抗 原、病毒抗原免疫豬的步驟。這些步驟，可選用常規(guī)技術(shù)實施。其中，所述的制備病毒抗原步 驟，優(yōu)選將豬圓環(huán)病病毒接種于9 11日齡雞胚尿囊液30 4(TC培養(yǎng)24 72h。取雞 胚尿囊液，-2(TC反復(fù)凍融4 8次，3000 8000rpm離心10 30min，棄去沉淀收集上清 液。其中，豬圓環(huán)病病毒株選自本申請人保藏的PCV-II(Genbank accession NO. AF027217 或Genbankaccession NO. AF201897)。 所述的提取病毒抗原步驟，優(yōu)選上清液用蔗糖密度梯度離心純化提取病毒，蔗糖 濃度為10% 80%， 150000 200000rpm離心2 4小時，根據(jù)豬圓環(huán)病病毒分子量確定 豬圓環(huán)病病毒所在離心管的位置，吸出備用； 所述的病毒抗原免疫豬步驟，優(yōu)選挑選健康免疫豬，將上述提取的病毒抗原皮下 多點注射免疫豬，共免疫3 5次。每次免疫間隔一周，最后一次免疫7 10天后取豬靜 脈血，以免疫熒光法或ELISA法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效
4價后，宰殺豬，取脾臟于-20°C保存，備用。 本發(fā)明的第二個目的在于提供通過上述方法所制備的轉(zhuǎn)移因子。 在一個優(yōu)選實施方案中，上述方法使用的豬圓環(huán)病病毒株選自本申請人保藏的
PCV-II(Genbank accession NO. AF027217或Genbank accession NO. AF201897)。 由于轉(zhuǎn)移因子是從淋巴細(xì)胞中提取的一類低分子肽與核苷酸復(fù)合物，目前并沒有
明確的組分或結(jié)構(gòu)，制備方法或所用病毒株的不同，所得的轉(zhuǎn)移因子也會差異，因此通常在
生產(chǎn)過程中是通過限定制備方法和所用病毒株來明確轉(zhuǎn)移因子。在本發(fā)明中，由于限定了
具體的制備方法和特異的病毒株，因此所得到的轉(zhuǎn)移因子具有組分穩(wěn)定、純度高、活性好等
特點，具有很好的應(yīng)用前景。 本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明的一種抗豬圓環(huán)病病毒轉(zhuǎn)移因子，具有以下優(yōu)點
1、豬脾臟屬于屠宰場的下腳料，原料來源容易； 2、組織經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎后，采用大功率的超聲波設(shè)備處理，縮短反復(fù)凍融時間，
而且也避免了因高壓均質(zhì)機(jī)破壁處理時由于筋膜的存在而堵塞高壓均質(zhì)機(jī)； 3、離心前用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH，使大部分蛋白絮凝，使得離心后的上清液的澄清度明
顯好于以前的方法；而且有利用后續(xù)的微濾、超濾操作； 4、在勻漿液中加入0. 1 0. 3%檸檬酸也起到使蛋白絮凝的作用，簡化后面的離 心處理； 5、本發(fā)明既可基于前期的常規(guī)病毒抗原免疫步驟，又可優(yōu)選本發(fā)明的免疫步驟， 具有靈活高效的優(yōu)點。 6、所述轉(zhuǎn)移因子的提取方法，顯著地縮短了生產(chǎn)時間，簡化了生產(chǎn)工藝。 7、提取物經(jīng)體外生物活性試驗及藥理、毒性試驗等證明，具有純度高、免疫活性起
效快而維持時間長、易吸收、無任何不良反應(yīng)等特點，其療效確切，安全可靠，既可治療又可
增強(qiáng)抗病能力。該提取物可做成口服、注射、噴霧等劑型，便于使用。 8、本發(fā)明所用的病毒株，屬于申請人保藏的PCV-II (Genbank accession NO. AF027217或Genbank accession NO. AF201897)，與常規(guī)圓環(huán)病毒株相比，具有更高的 免疫原性，因而采用該病毒株免疫抗原的方法所提取的轉(zhuǎn)移因子，包含特異性好和純度高 的低分子肽與核苷酸復(fù)合物，其活性水平明顯優(yōu)于常規(guī)方法和常規(guī)病毒株所制備的轉(zhuǎn)移因 子。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
實施例1 : 抗豬圓環(huán)病病毒轉(zhuǎn)移因子的制備 1、將豬圓環(huán)病病毒接種于9 11日齡雞胚尿囊液37t:培養(yǎng)48h。取雞胚尿囊 液，-2(TC反復(fù)凍融5次，5000rpm離心30min，棄去沉淀收集上清液； 2、取上清液，上清液用蔗糖密度梯度離心純化提取病毒，蔗糖濃度為10%、20%、 30 % 、40 % 、50 % 、60 % 、70 % 、80 % ， 150000rpm離心4小時，根據(jù)豬圓環(huán)病病毒分子量確定 豬圓環(huán)病病毒所在離心管的位置，吸出備用；
5
3、得到的豬圓環(huán)病病毒抗原免疫豬，挑選健康免疫豬，將上述提取的病毒抗原皮 下多點注射免疫豬，共免疫4次。每次免疫間隔一周，最后一次免疫7天后取豬靜脈血，以 免疫熒光法或ELISA法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價后，宰 殺豬，取脾臟于-2(TC保存，備用； 4、從得到的豬脾臟提取抗豬圓環(huán)病病毒轉(zhuǎn)移因子 (1)先用注射用水洗凈脾臟，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再用生理鹽水沖洗；
(2)將洗凈的豬脾臟剪碎，加入2倍冷的lOmmol PBS緩沖液，用高速組織搗碎機(jī) 2000rpm搗碎3次，每次5min，制得豬脾勻槳液；
(3)豬脾勻漿液用超聲波(4KW、3KHz)處理5min ; (4)將(3)中得到的勻漿液用HC1調(diào)pH5. 0， 4°C ， 5000rpm離心30min，收集上清 液； (5)上清液用0. 2 ii m中空纖維柱微濾，收集濾出液； (6)濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維柱超濾，收集濾出液；
(7)將超濾得到的濾液用0. 22 m濾膜進(jìn)行無菌過濾；
(8)分裝，4t:保存，即得到抗豬圓環(huán)病病毒轉(zhuǎn)移因子原液。
實施例2: 抗豬圓環(huán)病病毒轉(zhuǎn)移因子的制備 1、將豬圓環(huán)病病毒接種于9 11日齡雞胚尿囊液37t:培養(yǎng)72h。取雞胚尿囊 液，-2(TC反復(fù)凍融5次，5000rpm離心30min，棄去沉淀收集上清液； 2、取上清液，上清液用蔗糖密度梯度離心純化提取病毒，蔗糖濃度為15%、30%、 45%、60%、75%， 180000rpm離心3小時，根據(jù)豬圓環(huán)病病毒分子量確定豬圓環(huán)病病毒所在 離心管的位置，吸出備用； 3、得到的豬圓環(huán)病病毒抗原免疫豬，挑選健康免疫豬，將上述提取的病毒抗原皮 下多點注射免疫豬，共免疫4次。每次免疫間隔一周，最后一次免疫IO天后取豬靜脈血，以 免疫熒光法或ELISA法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價后，宰 殺豬，取脾臟于-2(TC保存，備用； 4、從得到的豬脾臟提取抗豬圓環(huán)病病毒轉(zhuǎn)移因子 (1)先用注射用水洗凈脾臟，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再用生理鹽水沖洗；
(2)將洗凈的豬脾臟剪碎，加入2倍冷的lOmmol PBS緩沖液，用高速組織搗碎機(jī) 1500rpm搗碎3次，每次5min，制得豬脾勻槳液；
(3)豬脾勻槳液用超聲波(4KW、3KHz)處理10min ; (4)將(3)中得到的勻槳液用加入O. lX檸檬酸，混勻，4。C，6000rpm離心30min， 收集上清液； (5)上清液用0. 2 ii m中空纖維柱微濾，收集濾出液； (6)濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維柱超濾，收集濾出液；
(7)將超濾得到的濾液用0. 22 ii m濾膜進(jìn)行無菌過濾；
(8)分裝，4t:保存，即得到抗豬圓環(huán)病病毒轉(zhuǎn)移因子原液。
實施例3 : 對本發(fā)明所述工藝制備的抗豬圓環(huán)病病毒轉(zhuǎn)移因子的檢測
對實施例1、2所述工藝制備的抗豬圓環(huán)病病毒轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行以下檢測 1、紫外分光光度測定上述所得樣品在252±2nm處有一吸收峰，且ABS26。/ABS28。
> 2. 0。 2、標(biāo)準(zhǔn)液為淡黃色，pH值在6. 0 8. 0之間。 3、細(xì)菌學(xué)檢驗上述所得樣品中無需氧、厭氧、腐生菌和真菌存在。 4、20%磺基水楊酸檢測上述所得樣品無渾濁及沉淀現(xiàn)象，說明蛋白反應(yīng)均成陰
性，其不含大分子蛋白質(zhì)。 5、核酸含量測定上述所得樣品經(jīng)地衣酚法測定核酸含量分別為603. 14 y g/mL、 594. 55 ii g/mL。 6、多肽含量測定上述所得樣品經(jīng)Lowry法測定多肽含量分別為7. 08mg/mL、 6. 88mg/mL。 7、轉(zhuǎn)移因子活性測定根據(jù)轉(zhuǎn)移因子可使脫E受體后的胸腺T細(xì)胞恢復(fù)其受體功 能，從而反應(yīng)轉(zhuǎn)移因子的生物活性。上述所得樣品形成E玫瑰花結(jié)的百分率分別為30. 5% 、 28. 4%，比對照組分別增加18. 9%、16. 8% (P《0. 01)。 8、過敏性、毒性試驗取健康小白鼠10只，雌雄各半，口服本品濃縮液，相當(dāng)于正 ?？诜┝康腎OO倍，觀察小白鼠的生存能力的變化，結(jié)果無任何過敏、毒性反應(yīng)，也無任 何死亡出現(xiàn)，說明本品是安全的，無任何毒性和副作用。 9、用豬圓環(huán)病病毒抗原做皮試檢測，有弱的陽性反應(yīng)，說明本品具有良好的轉(zhuǎn)移 活性和特異性。 通過上述實施例，我們發(fā)現(xiàn)所提取的抗豬圓環(huán)病轉(zhuǎn)移因子可以全面抑制豬圓環(huán)病 病毒，能保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受豬圓環(huán)病病毒的感染。因此使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移因子可以起 到預(yù)防豬圓環(huán)病、保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受豬圓環(huán)病病毒侵害的作用，從而降低發(fā)病率。同時 對于遭受到豬圓環(huán)病病毒感染的豬使用該轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行治療，可以有效改善臨床癥狀，提 高治愈率、降低死亡率。
權(quán)利要求
一種抗豬圓環(huán)病病毒的轉(zhuǎn)移因子，其制備方法包括(1)先用注射用水洗凈用豬圓環(huán)病病毒抗原免疫過的豬脾臟，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再用生理鹽水沖洗；(2)將洗凈的豬脾臟剪碎，加入1～2倍冷的10mmol PBS緩沖液，用高速組織搗碎機(jī)1000～3000rpm搗碎3～5次，每次3～5min，制得豬脾勻漿液；(3)豬脾勻漿液用超聲波(4KW、3KHz)處理5～10min；(4)將步驟(3)中得到的勻漿液用HCl調(diào)pH5.0～6.0或者加入0.1～0.3％檸檬酸，4℃，3000～8000rpm離心10～30min，收集上清液；(5)上清液用0.2μm中空纖維柱微濾，濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維柱超濾，收集濾出液；(6)將超濾得到的濾液用0.22μm濾膜進(jìn)行無菌過濾，即得到抗豬圓環(huán)病病毒轉(zhuǎn)移因子原液，4℃保存。
2. 權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移因子，其中在實施上述步驟之前，還包括制備病毒抗原、提取 病毒抗原、病毒抗原免疫豬等步驟。
3. 權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)移因子，其中所述的制備病毒抗原步驟，包括將豬圓環(huán)病病毒 接種于9 11日齡雞胚尿囊液30 4(TC培養(yǎng)24 72h。取雞胚尿囊液，_201:反復(fù)凍融 4 8次，3000 8000rpm離心10 30min，棄去沉淀收集上清液
4. 權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)移因子，其中所述的提取病毒抗原步驟，包括上清液用蔗糖密 度梯度離心純化提取病毒，蔗糖濃度為10% 80%， 150000 200000rpm離心2 4小時， 根據(jù)豬圓環(huán)病病毒分子量確定豬圓環(huán)病病毒所在離心管的位置，吸出備用。
5. 權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)移因子，其中所述的病毒抗原免疫豬步驟，包括挑選健康免疫 豬，將上述提取的病毒抗原皮下多點注射免疫豬，共免疫3 5次。每次免疫間隔一周，最 后一次免疫7 10天后取豬靜脈血，以免疫熒光法或ELISA法檢測上述病毒的特異性抗體 效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價后，宰殺豬，取脾臟于-20°C保存，備用。
6. 權(quán)利要求1或2或3所述的轉(zhuǎn)移因子，其中豬圓環(huán)病病毒株選自本申請人保藏的 PCV-II(Genbank accession NO. AF027217或Genbank accession NO. AF201897)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種天然高效抗豬圓環(huán)病病毒的轉(zhuǎn)移因子，使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移因子可以起到預(yù)防豬圓環(huán)病病毒、保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受豬圓環(huán)病病毒侵害的作用，從而降低發(fā)病率。同時對于遭受到豬圓環(huán)病病毒感染的豬使用該轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行治療，可以有效改善臨床癥狀，提高治愈率、降低死亡率。該轉(zhuǎn)移因子的制備工藝包括制備病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫豬、從免疫豬的脾臟中提取抗豬圓環(huán)病轉(zhuǎn)移因子等步驟。
文檔編號C07K1/14GK101759772SQ20081015434
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者李旭東, 管于平, 蘇建東 申請人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司