專利名稱：：豬圓環(huán)病毒Ⅱ型滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物新醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
,涉及一種豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：自1991年以來，PCV2感染引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬呼吸疾病綜合征(PRDC)、豬皮膚和腎病綜合征(PDNS)等多種疾病(總稱為豬圓環(huán)病毒病，PCVDs)給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。病毒感染產(chǎn)生的免疫抑制能夠?qū)е卢F(xiàn)有疫苗免疫失敗，造成多種病原混合(或繼發(fā))感染，并使疾病流行更加嚴(yán)重。在田間，PMWS主要出現(xiàn)于斷奶仔豬，豬群表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、發(fā)育障礙、皮膚蒼白，淋巴結(jié)腫大和黃疽，其發(fā)病率為3%—50%，死亡率為8%—35%;PRDC主要出現(xiàn)于育肥后期，其臨床癥狀主要為非常嚴(yán)重的咳嗽和呼吸困難，遷延難治且使用抗生素?zé)o效，其發(fā)病率可達(dá)30—70%，死亡率可達(dá)4一6。/。，發(fā)病豬群生產(chǎn)性能顯著降低；PDNS主要發(fā)生于斷奶豬和育肥豬，最常見的臨床癥狀為皮膚出現(xiàn)紅疹，常見于后軀、后肢、背側(cè)耳廓和腹部，其發(fā)病率可達(dá)2—14%，死亡率可達(dá)15—40%。目前，PCVDs的治療原則主要是對癥治療和減少合并感染，但效果并不理想。有研究表明，PCV2中和抗體可抑制病毒復(fù)制，中和抗體水平愈高則病毒復(fù)制速度愈慢，PCVDs的發(fā)生機(jī)率也愈低。還有研究提示，高滴度的母源PCV2抗體可以預(yù)防仔豬感染PCV2。由此可見特異性疫苗可用于控制本病。近年來，人們一直在致力于PCV2疫苗的開發(fā)應(yīng)用研究，并開發(fā)出了各種形式的PCV2疫苗，特別是滅活疫苗對豬有一定的免疫保護(hù)作用，但是應(yīng)用效果仍不理想，主要表現(xiàn)在(1)抗原濃度較低PCV2在細(xì)胞中的生長滴度較低，一般僅為103TCID5()/ml左右，而疫苗產(chǎn)量和抗原劑量又是PCV2滅活疫苗得以大規(guī)模應(yīng)用的關(guān)鍵，因此降低生產(chǎn)成本、提高疫苗質(zhì)量與產(chǎn)量成為目前急待解決的棘手問題；(2)疫苗生產(chǎn)工藝較粗糙每個病毒都有適合自己的最佳生產(chǎn)工藝，而在PCV2滅活疫苗的制備過程中多數(shù)人忽略了對生產(chǎn)工藝的優(yōu)化和完善，因而直接降低或破壞了PCV2抗原的免疫活性，導(dǎo)致了免疫效果的降低。
發(fā)明內(nèi)容針對當(dāng)前PCV2疫苗在應(yīng)用方面存在的不足，本發(fā)明提供一種病毒滴度高、免疫原性好、免疫持續(xù)期長的豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗(DBN—SX07株)。用本發(fā)明的疫苗免疫豬，可較早產(chǎn)生均一且有效的免疫力，明顯縮短PCV2感染窗口期，延長免疫持續(xù)期，從而減少加強(qiáng)免疫次數(shù)，降低免疫成本。本發(fā)明的另一目的在于提供該豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗的制備方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一種豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗，該疫苗的毒種為豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株，保藏號為CGMCCNo.3064，上述毒種經(jīng)垸化劑滅活后作為抗原，按比例加入油佐劑乳化配制而成。本發(fā)明中用于滅活病毒的烷化劑可為P—丙內(nèi)酯、甲醛和戊二醛等垸化劑，但為更好的達(dá)到本發(fā)明的效果，本發(fā)明優(yōu)選0.5%。一1%。的甲醛溶液。本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗，抗原與油佐劑的比例為1:1一1:5。其中，油佐劑包含卯一98wt。/。的白油、2—10wt。/。的司本一80。將重量百分比為90—98%白油與2—10%司本一80混合，100毫升混合液中加入l一2克硬脂酸鋁即得本發(fā)明的油佐劑。本發(fā)明還提供了該豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗的制備方法，其步驟如下(1)生產(chǎn)用毒的制備取豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株毒種接種PK15a，按常規(guī)條件培養(yǎng)、收獲，作為生產(chǎn)用毒；(2)生產(chǎn)用毒的滅活將烷化劑按比例加入生產(chǎn)用毒中，37'C條件下滅活16—24小時，期間振蕩4—5次；(3)乳化按比例加入油佐劑，乳化配制成滅活疫苗。其中，本發(fā)明所用的豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司分離和鑒定，為當(dāng)前中國流行毒株。該毒株已于2009年5月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.3064，分類命名為豬圓環(huán)病毒II型AwW"e"'rcov/r"stype2。本發(fā)明中的豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株基因組由1767個堿基組成，含有ORFl和ORF2編碼區(qū)，與已知序列的其它PCV2毒株序列有差異。該毒株具有如下特性(1)動物回歸試驗結(jié)果表明，攻毒豬(S/5)可出現(xiàn)明顯的PCV2病毒血癥和一過性的體溫升高，且攻毒后21天迫殺解剖可見多種淋巴組織出現(xiàn)不同程度的腫大和充血，肺出現(xiàn)不同程度的水腫和肉變，腎發(fā)黃表面有壞死灶等；(2)具有良好的細(xì)胞增殖活性，按常規(guī)方法培養(yǎng)，其病毒滴度可達(dá)106J)TCID5o/ml以上；(3)具有較廣的抗原譜，可與來自中國20省市的PCV2抗體陽性豬血清進(jìn)行有效的中和。本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗及其制備方法有益效果如下(1)免疫效果好、成本低用常規(guī)病毒培養(yǎng)方法培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒II型DBN一SX07株，其病毒滴度可達(dá)10^^5TCID5。/ml，顯著高于目前文獻(xiàn)報道水平，用此毒種制備的本發(fā)明疫苗，免疫效果好、生產(chǎn)成本低；(2)豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株抗原譜較廣，可以應(yīng)用于中國大部分地區(qū)；(3)豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，產(chǎn)生較文獻(xiàn)報道水平高l一2個滴度的PCV2ELISA抗體，可有效預(yù)防PCV2的感染，保護(hù)率可達(dá)卯％以上；(4)將豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株按本發(fā)明的制備方法配制成滅活疫苗，與文獻(xiàn)報道的豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗進(jìn)行效力比較。結(jié)果表明，用本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒II型疫苗免疫豬，可較早(提前約l周)產(chǎn)生良好的免疫效果，明顯縮短PCV2感染窗口期，延長免疫持續(xù)期(延長約1個月)，減少加強(qiáng)免疫次數(shù)，降低免疫成本。具體實施例方式實施例l豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株滅活疫苗的制備(1)生產(chǎn)用毒的制備取所需數(shù)量的、細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80。/。以上的細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，棄去生長培養(yǎng)基，以5%(V/V)的比例接入豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株毒種，37'C吸附1小時后加入維持液進(jìn)行培養(yǎng)。24小時后用300mM的D—氨基葡萄糖于37'C處理20min,經(jīng)無菌PBS(pH7.4)兩次洗滌后加入維持液于37'C下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48小時后反復(fù)凍融3次，經(jīng)離心或過濾除去細(xì)胞碎片，凍存于一40'C以下。(2)生產(chǎn)用毒的滅活將檢驗合格的病毒液按0.5%。(V/V)的比例加入甲醛溶液，混勻后置37'C滅活16小時，期間振蕩4一5次。(3)乳化將滅活后的生產(chǎn)用毒按1:1的比例(抗原油佐劑)加入油佐劑，乳化配制成滅活疫苗。所用的油佐劑配制為卯wt^白油和10wt冗司本一80組成的油佐劑混合液中加入硬脂酸鋁，其中硬脂酸鋁加入量為1克/ioo毫升油佐劑混合液。本實施例共制備出3批豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株滅活疫苗，批號分別定為200701、200702、200703，制備的疫苗物理性狀檢驗、安全檢驗、效力檢驗等均合格。其中，所用毒種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)-①病毒含量取病毒液用無血清培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，選取10—s、10_6、10—73個稀釋度，分別接種96孔細(xì)胞板，每個稀釋度接種5孔，37'C吸附1小時后加入維持液進(jìn)行培養(yǎng)。24小時后用300mM的D—氨基葡萄糖于37'C處理20min，經(jīng)無菌PBS(pH7.4)兩次洗滌后加入維持液培養(yǎng)48小時，同時設(shè)不接種病毒的細(xì)胞為空白對照。運用間接免疫熒光法(IFA)測定每個稀釋度含有熒光的孔數(shù)，最后按Reed—Muench計算TCID鄰。每毫升病毒含量應(yīng)a060TCID50。②免疫原性將病毒含量20^TCID5o/ml的病毒培養(yǎng)液按O.P/。(V/V)的比例加入甲醛，滅活后按實施例中所述方法制成疫苗。選取3—4周齡PCV2抗原抗體陰性的健康仔豬10頭，其中5頭耳后根肌肉注射疫苗lml，14天后以同樣方式再次注射，另5頭接種安慰劑作為陰性對照，同樣條件下飼養(yǎng)。二免后15天，所有豬肌肉注射DBN—SX07株病毒培養(yǎng)液(病毒含量為lO^TCIDso/ml)3ml，每天測溫觀察并隔周采集血清進(jìn)行血清學(xué)檢測，攻毒后21天迫殺解剖。對照豬(S/5)在攻毒后應(yīng)出現(xiàn)明顯的PCV2病毒血癥和一過性的體溫升高，且攻毒后21天迫殺解剖可見多種淋巴組織出現(xiàn)不同程度的腫大和充血，肺出現(xiàn)不同程度的水腫和肉變，腎發(fā)黃表面有壞死灶等。免疫豬(S/5)二免后15天PCV2ELISA抗體應(yīng)全部為陽性且滴度2:1600，攻毒后應(yīng)無明顯臨床癥狀、PCV2病毒血癥及病理變化。③純凈性按《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒污染。④特異性中和試驗將毒種用培養(yǎng)基稀釋成103TCID5()/ml，與等量PCV2特異性陽性血清混合，37'C中和1小時后，接種PK15a細(xì)胞板，接種和培養(yǎng)方法同①，通過間接免疫熒光法(IFA)測定，應(yīng)無特異性的熒光信號出現(xiàn)。所制備疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)①性狀外觀乳白色乳劑。劑型為油包水型。取一個清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均應(yīng)不擴(kuò)散。穩(wěn)定性取疫苗10ml加入離心管中，以3000rpm離心15min，應(yīng)不分層，管底析出的水相應(yīng)不大于0.5ml。粘度用lml吸管(下口的內(nèi)徑1.2111111，上口內(nèi)徑2.7mm)吸取25'C左右的疫苗lml，令其垂直自然流出，記錄流出0.41111所需的時間，應(yīng)在8秒以內(nèi)。②無菌檢驗按《中國獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。③安全檢驗選取3—4周齡PCV2抗原抗體陰性的健康仔豬10頭，分為2組，每組各5頭，分別進(jìn)行一次超劑量(4ml)和單劑量重復(fù)(lmlx2)接種的安全性試驗，同時設(shè)不進(jìn)行接種的豬5頭作為空白對照，同樣條件下飼養(yǎng)。每次接種后觀察14日。應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。④效力檢驗選取3—4周齡PCV2抗原抗體陰性的健康仔豬10頭，其中5頭耳后根肌肉注射疫苗lml，14天后以同樣方式再次注射，另5頭接種安慰劑作為陰性對照，同樣條件下飼養(yǎng)。二免后15天，所有豬肌肉注射DBN—SX07株病毒培養(yǎng)液(病毒含量為105力TCIDWml)3ml，每天測溫觀察并隔周采集血清進(jìn)行血清學(xué)檢測，攻毒后21天迫殺解剖。對照豬(S/5)在攻毒后應(yīng)出現(xiàn)明顯的PCV2病毒血癥和一過性的體溫升高，且攻毒后21天迫殺解剖可見多種淋巴組織出現(xiàn)不同程度的腫大和充血，肺出現(xiàn)不同程度的水腫和肉變，腎發(fā)黃表面有壞死灶等。免疫豬(^/5)二免后15天PCV2ELISA抗體滴度應(yīng)2:1600，攻毒后應(yīng)無明顯臨床癥狀、PCV2病毒血癥及病理變化。甲醛、硫柳汞含量測定按《中國獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。實施例2豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗的制備(1)生產(chǎn)用毒的制備取所需數(shù)量的、細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上的細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，棄去生長培養(yǎng)基，以5%(V/V)的比例接入豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株毒種，37'C吸附1小時后加入維持液進(jìn)行培養(yǎng)。24小時后用300mM的D—氨基葡萄糖于37'C處理20min，經(jīng)無菌PBS(pH7.4)兩次洗滌后加入維持液于37'C下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48小時后反復(fù)凍融3次，經(jīng)離心或過濾除去細(xì)胞碎片，凍存于一40'C以下。(2)生產(chǎn)用毒的滅活將檢驗合格的病毒液按0.759(i。(V/V)的比例加入甲醛溶液，混勻后置37'C滅活20小時，期間振蕩4一5次。(3)乳化將滅活后的種生產(chǎn)用毒按1:3的比例(抗原油佐劑)加入油佐劑乳化配制成滅活疫苗。所用的油佐劑配制是按照重量百分比計算，為94%白油和6%司本一80組成的油佐劑混合液中加入硬脂酸鋁，其中硬脂酸鋁加入量為1克/100亳升油佐劑混合液。制備的疫苗物理性狀檢驗、安全檢驗、效力檢驗等均合格。所用豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株毒種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和所制疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參見實施例l。實施例3豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗的制備(1)生產(chǎn)用毒的制備取所需數(shù)量的、細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上的細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，棄去生長培養(yǎng)基，以5%(V/V)的比例接入豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株毒種，37'C吸附1小時后加入維持液進(jìn)行培養(yǎng)。24小時后用300mM的D—氨基葡萄糖于37'C處理20min，經(jīng)無菌PBS(pH7.4)兩次洗滌后加入維持液于37'C下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48小時后反復(fù)凍融3次，經(jīng)離心或過濾除去細(xì)胞碎片，凍存于一40'C以下。(2)生產(chǎn)用毒的滅活將檢驗合格的病毒液按1%。(V/V)的比例加入甲醛溶液，混勻后置37'C滅活24小時，期間振蕩4—5次。(3)乳化將滅活后的種生產(chǎn)用毒按1:5的比例(抗原油佐劑)加入油佐劑乳化配制成滅活疫苗。所用的油佐劑配制是按照重量百分比計算，為98%白油和2%司本一80組成的油佐劑混合液中加入硬脂酸鋁，其中硬脂酸鋁加入量為1克/100毫升油佐劑混合液。制備的疫苗物理性狀檢驗、安全檢驗、效力檢驗等均合格。所用豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株毒種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和所制疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參見實施例1。實施例4疫苗效力比較試驗(1)檢驗用毒豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株，每毫升病毒含量為l(PTCID鄰，攻毒時采用肌肉注射。(2)試驗疫苗實施例1制備的批號分別為200701、200702、200703疫苗。(3)效力比較試驗應(yīng)用豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗(DBN—SX07株)3批實驗室產(chǎn)品進(jìn)行試驗，耳后根肌肉接種3—4周齡PCV2抗原抗體陰性的健康仔豬各10頭，每頭l.Oml，14日后各組以同樣的方式重復(fù)注射，另選取10頭條件相同的豬，接種安慰劑作為陰性對照。于首次免疫后l周、2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周分別采血測定PCV2抗體滴度，監(jiān)測PCV2抗體消長情況，并與目前文獻(xiàn)報道進(jìn)行比較。(4)效力比較試驗結(jié)果豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗(DBN—SX07株)首次免疫后3周即可產(chǎn)生均一且有效的保護(hù)力，6周PCV2ELISA抗體水平達(dá)高峰，并可持續(xù)8周，24周后PCV2抗體水平下降到保護(hù)線以下。3批疫苗間結(jié)果無明顯差異，詳細(xì)結(jié)果見表根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報道可知，豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗首次免疫后4周方可產(chǎn)生均一且有效的保護(hù)力，6周PCV2ELISA抗體水平達(dá)高峰，并可持續(xù)6周，20周后PCV2抗體水平下降到保護(hù)線以下。免疫持續(xù)期約為4個月。免疫后PCV2抗體的消長情況表明，本發(fā)明的疫苗效力具有明顯優(yōu)勢①產(chǎn)生保護(hù)力的時間較早用本發(fā)明的疫苗免疫豬，其產(chǎn)生均一且有效的保護(hù)力的時間比文獻(xiàn)報道早約1周，因此可明顯縮短PCV2感染窗口期；②PCV2抗體高峰持續(xù)時間長用本發(fā)明的疫苗免疫豬，PCV2抗體高峰持續(xù)時間比文獻(xiàn)報道長約2周，因此可以更有效的預(yù)防PCV2的感染；③免疫持續(xù)期較長用本發(fā)明的疫苗免疫豬，免疫持續(xù)期比文獻(xiàn)報道長約l個月，因此可以提供為時更長的有效保護(hù)期，減少加強(qiáng)免疫次數(shù)。表l本發(fā)明疫苗免疫后PCV2ELISA抗體檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1、一種豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗，其特征在于毒種為豬圓環(huán)病毒II型DBN-SX07株，保藏號為CGMCCNo3064，上述毒種經(jīng)烷化劑滅活后作為抗原，按比例加入油佐劑乳化配制而成。2、如權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗，其特征在于所述的垸化劑為0.5%。一1%。的甲醛溶液。3、如權(quán)利要求i所述的豬圓環(huán)病毒n型滅活疫苗，其特征在于抗原與油佐劑的比例為1:1—1:5。4、如權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗，其特征在于所述的油佐劑包含卯一98wt。/。的白油、2—10wt。/o的司本一80。5、一種如權(quán)利要求1一4任一項所述的豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗的制備方法，其特征在于步驟如下(1)生產(chǎn)用毒的制備取豬圓環(huán)病毒II型DBN—SX07株毒種接種PK15a，按常規(guī)條件培養(yǎng)、收獲，作為生產(chǎn)用毒；(2)生產(chǎn)用毒的滅活將烷化劑按比例加入生產(chǎn)用毒中，37'C條件下滅活16—24小時，期間振蕩4—5次；(3)乳化按比例加入油佐劑，乳化配制成滅活疫苗。全文摘要本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物新醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)滅活疫苗及其制備方法。該疫苗所用毒種為豬圓環(huán)病毒Ⅱ型DBN-SX07株，保藏號為CGMCCNo3064，該毒株經(jīng)烷化劑滅活后作為抗原，再加入油佐劑乳化配制而成。使用本發(fā)明的PCV2滅活疫苗免疫豬，可較早產(chǎn)生均一且有效的保護(hù)力——明顯縮短PCV2感染窗口期，延長免疫持續(xù)期——減少加強(qiáng)免疫次數(shù)。文檔編號A61K39/12GK101549155SQ20091008490公開日2009年10月7日申請日期2009年5月27日優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日發(fā)明者趙亞榮,趙建增,邢海云申請人:福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司;北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司