專利名稱：組蛋白去乙?；敢种苿┯诟淖兎渫鯘{中mrjp3蛋白質(zhì)的新穎用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促進蜂王子(蜂王幼蟲)、蜂王蛹和蜂王生長的方法，所述方法是通過以組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)或含有(一或多種)HDAC抑制劑的混合物或配方喂飼 年輕工蜂。具體來說，經(jīng)喂飼HDACi的年輕工蜂所分泌的蜂王漿中，68kDa與64kDa MRJP3 蛋白質(zhì)間的比例發(fā)生改變。
背景技術(shù)：
蜜蜂是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中最具價值的生物物種之一，其生產(chǎn)多種蜂產(chǎn)品，例如蜂王漿、 蜂蜜、蜂膠與花粉，而這些產(chǎn)品提供給人類豐富的營養(yǎng)來源(赫爾納(Hellner M.)等人， 2008)。因此，研究蜜蜂的生長、演化與發(fā)育是相當(dāng)重要的課題。蜜蜂的社會屬于母系社會，且由蜂王所領(lǐng)導(dǎo)。在蜂群當(dāng)中，工蜂與蜂王均由受精卵 孵化而成；而雄蜂則是由無受精的卵子孵化生長而成(溫斯頓(Winston Μ. L.)，1987)。蜂 王將單一的卵產(chǎn)于蜂巢的個別巢房當(dāng)中，在三到四天內(nèi)，產(chǎn)下的卵可孵化出幼蟲。孵化出的 幼蟲由年輕工蜂負責(zé)喂食，并在巢房中經(jīng)由數(shù)個發(fā)育階段成長。當(dāng)幼蟲進入化蛹期間時，工 蜂會封閉巢房的開口。通常蜂王會在16天內(nèi)自巢房羽化而出，而工蜂和雄蜂各需21天和 24天。蜂王個體較大，其壽命是一般工蜂的10-15倍。受精卵將發(fā)育為工蜂或蜂王，此受到 蜂群的調(diào)控。原則上，一群蜂只會有一只蜂王。此外，蜂王所食用的食物也有別于同一蜂群 中的其它蜂只；蜂王終其一生以蜂王漿為食物，而工蜂只在發(fā)育初期食用蜂王漿。部分學(xué)者 則認為工蜂在發(fā)育期仍食用蜂王漿，只是其所食用的蜂王漿與蜂王所食用的蜂王漿化學(xué)組 成可能不同。無論如何，蜂王漿可視為是延續(xù)蜂群最重要的物質(zhì)(羅賓遜(Robinson G. Ε.) 等人，1987)。蜂王漿是蜂王子與蜂王最重要的食物和養(yǎng)分來源，其由年輕工蜂的咽頭腺與大顎 腺所分泌。蜂王漿的化學(xué)組成可能會隨著蜂王子的不同發(fā)育階段而有所改變。總的來說， 一般認為前述蜂王漿的成份改變是源自糖類、而非蛋白質(zhì)組成的變化(派仁(PeirenN.)等 人，2005)。已知蜂王漿包含多種可促進人體健康的物質(zhì)，并具有多樣藥理特性(高木-土 井(Takaki-Doi S.)等人，2009 ；曼奴(Mannoor M. K.)等人，2009 ；和咖思科(Gasic S.) 等人，2007)。因此，蜂王漿已廣泛用于促進人類健康的保健產(chǎn)品。最近的研究發(fā)現(xiàn)，蜂王 漿可以促進免疫調(diào)控(維科威克(Vuecvic D.)等人，2007)、抗菌(布卡(Boukraa L.), 2008)、滋養(yǎng)腦神經(jīng)(橋本(Hashimoto Μ.)等人，2005)、抗癌和抗氧化(古蒂(Gou H.)等 人，2008)。研究發(fā)現(xiàn)蜂王漿為乳白色漿狀物質(zhì)，其組成為約60-70%的水分、12-15%的蛋 白質(zhì)、10-12%的糖類、3-5%的脂肪、和多種微量元素與礦物質(zhì)(斯卡塞利(ScarselliR.) 等人，2005)。在蛋白質(zhì)成份當(dāng)中，約有80-90%屬于水溶性蛋白質(zhì)，而其余為非水溶性蛋白 質(zhì)。換句話說，蜂王漿中所含的蛋白質(zhì)成份多為水溶性蛋白質(zhì)。在上述水溶性蛋白質(zhì)中，以MRJP (主要蜂王漿蛋白質(zhì)，Major Royal JellyProteins)家族(MRJP 1-9)為主(斯密佐娃(Schmitzova J.)等人，1998)。所述 MRJP 蛋 白質(zhì)的氨基酸序列雖已經(jīng)分析，然而，其所負責(zé)的作用和功能尚待研究。
MRJPl在蜜蜂腦部被發(fā)現(xiàn)，其可能與蜜蜂行為有關(guān)。MRJPl占蜂王漿中水溶性蛋 白質(zhì)的44%，而且是所有MRJP家族蛋白質(zhì)中含量最高者(瑪勒科瓦(Malecova B.)等人，
2003)。目前針對MRJP3的研究居多，一般認為其與免疫調(diào)控有關(guān)(科諾(KohnoK.)等人，
2004)。MRJP3占蜂王漿中整體水溶性蛋白質(zhì)的12%，而且其含量在所有MRJP蛋白質(zhì)(MRJPs 1-9)中居第二位。MRJP3的特點在于其抗過敏和抗發(fā)炎活性。此外，MRJP的高多態(tài)性基因 可導(dǎo)致MRJP3蛋白質(zhì)變異體(例如60-70kDa蛋白質(zhì))的生成(斯特芬-艾爾伯特(Stefan Albert)等人，1999)。MRJP蛋白質(zhì)提供豐富的必需氨基酸和其它營養(yǎng)成份(古澤(Furusawa T.)等人， 2008)。蜂王漿是蜂王子唯一的營養(yǎng)來源，而MRJP蛋白質(zhì)則是蜂王漿中最重要的蛋白質(zhì)。因 此，需要研發(fā)具有特殊組成的蜂王漿。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種方法，經(jīng)所述方法培育的蜜蜂幼蟲相比于正常幼蟲，重量至少大 50%、大一倍(100% )、甚至大數(shù)倍；經(jīng)所述方法培育的蜂蛹相比于正常蜂蛹，重量至少大 50%、甚至大一至數(shù)倍；經(jīng)所述方法培育的蜂王相比于正常蜂王，重量至少大50%、甚至大 一至數(shù)倍。本發(fā)明提供一種培育相比于對照組幼蟲重量至少大50%、甚至大一倍(100% )的 蜜蜂幼蟲的方法；所述方法包括以一種HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物喂飼年輕 工蜂，并以所述年輕工蜂所分泌的蜂王漿喂飼幼蟲。其中對照組的幼蟲所食用的蜂王漿是 由未喂飼HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物的年輕工蜂分泌。本發(fā)明提供一種培育相比于對照組蜂蛹重量至少大50%的蜂蛹、或相比于對照組 蜂王重量至少大50%的蜂王的方法；所述方法包括以一種HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑 的混合物喂飼年輕工蜂，并以所述年輕工蜂所分泌的蜂王漿喂飼幼蟲，而獲得由所述幼蟲 發(fā)育而成的蛹或蜂王，其中對照組的蛹或蜂王由食用未喂飼HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制 劑混合物的年輕工蜂所分泌的蜂王漿的蜜蜂幼蟲發(fā)育而成。本發(fā)明另外提供一種蜂王漿，其所含68kDa與64kDa MRJP3蛋白質(zhì)的比例相比于 對照組蜂王漿有所改變。本發(fā)明另外提供一種調(diào)控工蜂mrjp3基因的表觀遺傳(印igenetics)的方法，其 包括以HDAC抑制劑喂飼工蜂以調(diào)控工蜂的mrjp3基因表達。


圖1顯示喂飼臺灣綠蜂膠萃取物的年輕工蜂分泌特殊蜂王漿，所述蜂王漿誘發(fā)幼 蟲的快速生長。U-I和U-2 對照組；A-I和A-2 經(jīng)1. 25g/kg的臺灣綠蜂膠萃取物處理者； B-I和B-2 經(jīng)2. 50g/kg的臺灣綠蜂膠萃取物處理者；C-I和C-2 經(jīng)5. Og/kg的臺灣綠蜂 膠萃取物處理者。圖2顯示喂飼蜂膠素C的年輕工蜂分泌特殊蜂王漿，所述蜂王漿誘發(fā)幼蟲的快速 生長。U-2 對照組；C1-2 經(jīng)50mg/kg的蜂膠素C處理者；C2-2 經(jīng)100mg/kg的蜂膠素C處理者圖3顯示喂飼蜂膠素G的年輕工蜂分泌的蜂王漿中所鑒別出的水溶性蛋白質(zhì)的組 成。所述樣品在不同時間點收集。U-I 對照組；T-I 經(jīng)5. Og/kg臺灣綠蜂膠萃取物處理的 陽性對照組；Gl-I 經(jīng)150mg/kg蜂膠素G處理者；G2-1 經(jīng)300mg/kg蜂膠素G處理者；G3-1 經(jīng)600mg/kg蜂膠素G處理者。圖4顯示喂飼NBM-HD-I的年輕工蜂分泌的蜂王漿中所鑒別出的水溶性蛋白質(zhì)的 組成。所述樣品在不同時間點收集。U-I 對照組；T-I 經(jīng)5. Og/kg臺灣綠蜂膠萃取物處理 的陽性對照組；Hl-I 經(jīng) 50mg/kg NBM-HD-I 處理者；H2-1 經(jīng) lOOmg/kgNBM-HD-1 處理者； H3-1 經(jīng) 200mg/kg NBM-HD-1 處理者。圖5顯示二維凝膠電泳分析的結(jié)果，其目的在于分析在72小時自經(jīng)NBM-HD-I 處理的組別的幼蟲萃取出的水溶性蛋白質(zhì)。L-I =MRJPl ；L-2 :MRJP3 ；L-3 :MRJP2 ；L-4 MRJP2 ；L-5 :MRJP3 ；L_6 :MRJP3 ；L_7 :MRJP3 ；L_8 :MRJP2。Ul-I 對照組；H3-1 經(jīng) 200mg/kg NBM-HD-I處理者。圖6顯示喂飼SAHA的年輕工蜂分泌的蜂王漿中所鑒別出的水溶性蛋白質(zhì)的組成。 所述樣品在72小時的時間點收集。U-I 對照組；T-I 經(jīng)5. Og/kg臺灣綠蜂膠萃取物處理 的陽性對照組；G-I 經(jīng)150mg/kg蜂膠素G處理的陽性對照組；Sl-I 經(jīng)5mg/kg SAHA處理 者；S2-1 經(jīng) 15mg/kg SAHA 處理者。圖7顯示臺灣綠蜂膠萃取物誘發(fā)年輕工蜂分泌特殊蜂王漿，所述特殊蜂王漿可抑 制人類膠質(zhì)瘤Hs683細胞的增殖。Ul 對照組；Al 經(jīng)1. 25g/kg臺灣綠蜂膠萃取物處理者； Bl 經(jīng)2. 50g/kg臺灣綠蜂膠萃取物處理者；Cl 經(jīng)5. Og/kg臺灣綠蜂膠萃取物處理者。圖8顯示臺灣綠蜂膠萃取物誘發(fā)年輕工蜂分泌特殊蜂王漿，所述特殊蜂王漿可誘 發(fā)老鼠神經(jīng)干細胞的分化。Ul 對照組；Al 經(jīng)1. 25g/kg臺灣綠蜂膠萃取物處理者；Bl 經(jīng) 2. 50g/kg臺灣綠蜂膠萃取物處理者；Cl 經(jīng)5. Og/kg臺灣綠蜂膠萃取物處理者；EGF 陽性 對照。圖9 (a)至(C)顯示臺灣綠蜂膠萃取物誘發(fā)年輕工蜂分泌特殊蜂王漿，所述特殊蜂 王漿可促進蜂王幼蟲的生長和發(fā)育。U 對照組；T 經(jīng)5. Og/kg臺灣綠蜂膠萃取物處理者。圖10顯示喂飼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑EGCG的工蜂分泌的蜂王漿可使幼蟲快速 生長。U-I 對照組；El-I 經(jīng)50mg/天的EGCG處理者；E2-1 經(jīng)IOOmg/天的EGCG處理者； E3-1 經(jīng)150mg/天的EGCG處理者。
具體實施例方式本發(fā)明發(fā)現(xiàn)喂飼一種HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物的工蜂所撫育的蜜 蜂幼蟲可快速成長并發(fā)育為大個體的幼蟲、蛹或蜂王。所述蜜蜂幼蟲可具有大于正常幼蟲 至少50%、一倍(100% )甚至數(shù)倍的重量；所述蛹可具有大于正常蛹至少50%甚至一至數(shù) 倍的重量；而所述蜂王可具有大于正常蜂王至少50%甚至一至數(shù)倍的重量。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一種HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物可通過表觀遺傳方式改 變蜂王漿中68kDa與64kDa MRJP3蛋白質(zhì)的比例。喂飼一種HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制 劑的混合物的年輕工蜂可通過表觀遺傳分泌特殊的蜂王漿，其中所述蜂王漿中的68kDa與 64kDa蛋白質(zhì)的比例經(jīng)改變。蜂王漿是蜂王子和蜂王的主要食物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)特殊蜂王漿可促進食用所述蜂王漿的蜂王子的生長，并使蜂王子和發(fā)育自所述蜂王子的蛹和蜂王的重 量顯著增加。 在一方面，本發(fā)明提供一種培育相比于對照組幼蟲，重量至少大50%的蜜蜂幼蟲 的方法；所述方法包括以一種HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物喂飼年輕工蜂，并以 所述年輕工蜂所分泌的蜂王漿喂飼蜜蜂幼蟲；其中對照組的幼蟲所食用的蜂王漿是由未喂 飼HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物的年輕工蜂分泌。本發(fā)明也提供一種培育相比 于對照組幼蟲重量至少大一倍(100% )的蜜蜂幼蟲的方法；所述方法包括以一種HDAC抑 制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物喂飼年輕工蜂，并以所述年輕工蜂所分泌的蜂王漿喂飼 蜜蜂幼蟲；其中對照組的幼蟲所食用的蜂王漿是由未喂飼HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑 的混合物的年輕工蜂分泌。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，蜜蜂幼蟲可由工蜂以其所分泌的蜂 王漿喂飼，或由人類以收集自工蜂的蜂王漿喂飼。優(yōu)選地，重量增加約50%至5倍、50%至 2倍、50%至3倍、1至5倍、2至5倍或1至3倍。更優(yōu)選地，重量增加約3至5倍。根據(jù) 本發(fā)明的一個實施例，喂飼以前述蜂王漿的幼蟲在72小時重量增加1. 5倍以上。根據(jù)本發(fā) 明，上述蜂王漿所包含的68kDa與64kDa MRJP3蛋白質(zhì)的比例，相比于對照組蜂王漿已經(jīng)改 變。根據(jù)本發(fā)明，自本發(fā)明蜜蜂幼蟲發(fā)育而成的蛹和蜂王，相比于對照組的蛹和蜂王， 分別具有較高的重量。因此，本發(fā)明提供一種培育相比于對照組蜂蛹重量至少大50%的蜂 蛹、或相比于對照組蜂王重量至少大50%的蜂王的方法；所述方法包括以一種HDAC抑制 劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物喂飼年輕工蜂，并以所述年輕工蜂所分泌的蜂王漿喂飼幼 蟲，而獲得由所述幼蟲發(fā)育而成的蛹或蜂王；其中對照組的蛹或蜂王由食用未喂飼以一種 HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑混合物的年輕工蜂所分泌的蜂王漿的蜜蜂幼蟲發(fā)育而成。 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，蜜蜂幼蟲可由工蜂以其所分泌的蜂王漿喂飼，或由人類以收集 自工蜂的蜂王漿喂飼。在一方面，本發(fā)明提供一種改變蜂王漿中68kDa與64kDa MRJP3蛋白質(zhì)的比例的 方法，其包括以一種HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物喂飼年輕工蜂，以生產(chǎn)相比于 對照組蜂王漿，68kDa與64kDa MRJP3蛋白質(zhì)比例經(jīng)改變的蜂王漿。在另一方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)蜂王漿的方法，其中相比于對照組蜂王漿，所述 蜂王漿所含68kDa與64kDa MRJP3蛋白質(zhì)的比例經(jīng)改變，所述方法包括以一種HDAC抑制劑 或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物喂飼年輕工蜂，并收集由所述年輕工蜂所生產(chǎn)的蜂王漿。在另一方面，本發(fā)明提供一種蜂王漿，其所含68kDa與64kDa MRJP3蛋白質(zhì)的比例 相比于對照組蜂王漿經(jīng)改變。根據(jù)本發(fā)明，68kDa與64kDa MRJP3蛋白質(zhì)的比率可增加約1. 5至12倍、1. 5至5 倍、2-6倍、2-10倍、4-12倍或2-4倍(相比于對照組)。更優(yōu)選地，68kDa與64kDa MRJP3 蛋白質(zhì)的比率可增加約1. 5至約5倍或2至10倍(相比于對照組)。更優(yōu)選地，68kDa與 64kDa MRJP3蛋白質(zhì)的比率可增加約2至4倍或約4至10倍(相比于對照組)。在另一方面，本發(fā)明提供一種調(diào)控工蜂mrjp3基因的表觀遺傳的方法，其包括以 HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物喂飼工蜂，以調(diào)控工蜂的mr jp3基因表達。根據(jù) 本發(fā)明，前述表觀遺傳可以是對DNA甲基化或HDAC的抑制。DNA甲基化是一種表觀遺傳 改變，其不改變DNA序列、可經(jīng)遺傳、并可改變基因表達。DNA甲基化是可誘發(fā)可遺傳的基因沉默(gene silencing)的共價修飾，其可以兩種方式之一誘發(fā)沉默現(xiàn)象。其一，甲基化作用可直接干擾轉(zhuǎn)錄因子與DNA上辨識位置間的結(jié)合；其二，甲基-CpG結(jié)合區(qū)域蛋白質(zhì) (methyl-CpG binding domain proteins, MBPs)可通過聚集協(xié)阻抑物(co-repressor)復(fù) 合物(其內(nèi)含組蛋白去乙酰化酶或組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶)來強化前述沉默現(xiàn)象(朱莉基弗 (Juile C. Kiefer)，2007)。HDAC抑制劑既可改變年輕工蜂的68kDa與64kDa MRJP3蛋白質(zhì) 的表達，推測HDAC抑制劑可調(diào)控組蛋白的過度乙?；?hyperacetylation)，又可影響年輕 工蜂的多態(tài)性mrjp3基因剪接(gene splicing)和轉(zhuǎn)譯作用。本發(fā)明同時發(fā)現(xiàn)，相似于HDAC抑制劑的作用結(jié)果，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(例如 沒食子酸表兒茶素酯，EGCG)同樣可調(diào)控工蜂mrjp3基因的表觀遺傳，而使該工蜂所分泌的 蜂王漿經(jīng)喂飼蜂王子后，達到促進蜂王子生長的效果。本文中，術(shù)語“烷基”代表直鏈或具支鏈烴鏈；烷基優(yōu)選為C1,烷基。優(yōu)選地，烷基 的碳數(shù)選自由1至8組成的群組；更優(yōu)選地，其是Cp6烷基或CV4烷基。烷基的實例包括甲 基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2CH2CH3)、異丙基((CH3)2CH)和丁基(-C4H9)。本文中，術(shù)語“烯基”代表直鏈或具支鏈不飽和烴基，其中不飽和是雙鍵。根據(jù)本發(fā) 明，烯基包括一或多個雙鍵。烯基優(yōu)選為C2_16烯基。更優(yōu)選地，烯基的碳數(shù)選自由2至12組 成的群組。烯基的實例包括乙烯基(-CH = CH2)、丙烯基(-CH = CHCH3或-CH2CH = CH2)、丁 烯基(-CH2CH = CHCH3 或-CH = CHCH2CH3 或-CH2CH2CH = CH2)、-CH2CH = C (CH3) CH3、-CH2-CH =CH-CH2-CH2-CH = CH-CH3 和-CH2-CH = C (CH3) -CH2-CH2-CH = C (CH3)-CH3。本文中，術(shù)語“環(huán)烷基”代表脂肪族環(huán)(飽和碳環(huán))。優(yōu)選地，環(huán)烷基的碳數(shù)選自由 3至8組成的群組；更優(yōu)選地，環(huán)烷基的碳數(shù)選自由5至6組成的群組。環(huán)烷基的實例包括 環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。本文中，術(shù)語“不飽和碳環(huán)”包括由碳原子和氫原子組成的環(huán)取代基，而且環(huán)狀部 分是不飽和環(huán)，例如芳基或環(huán)烯基等。術(shù)語“環(huán)烯基”包括屬于具有一或多個雙鍵的環(huán)烷基 的烯基，例如環(huán)丙烯基(例如1-環(huán)丙烯基)、環(huán)丁烯基(例如1-環(huán)丁烯基)、環(huán)戊烯基(例如
1-環(huán)戊烯-1-基、2-環(huán)戊烯-1-基和3-環(huán)戊烯-1-基)、環(huán)己烯基(例如1-環(huán)己烯-1-基、
2-環(huán)己烯-1-基和3-環(huán)己烯-1-基)、環(huán)庚烯基(例如1-環(huán)庚烯基)、環(huán)辛基(例如1-環(huán) 辛基)等。尤其優(yōu)選為1-環(huán)己烯-1-基、2-環(huán)己烯-1-基和3-環(huán)己烯-1-基。術(shù)語“芳 基”包括單一或稠合環(huán)(其中至少一個環(huán)是芳香族)，例如苯基、萘基和四氫萘基。本文中，術(shù)語“5元或6元雜環(huán)”是具有5個或6個原子的環(huán)狀環(huán)，其中環(huán)中的至少 一個原子是雜原子。5元或6元雜環(huán)可以是芳香族或非芳香族，其飽和或不飽和。優(yōu)選地， 雜原子選自N、0和S。雜環(huán)的實例包括(但不限于)呋喃基(如2-呋喃基、3-呋喃基)、 噻吩基(如2-噻吩基、3-噻吩基)、吡咯基(如1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基)、咪唑基 (如1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基)、吡唑基(如1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基)、三 唑基(如1，2，4-三唑-1-基、1，2，4-三唑-3-基、1，2，4-三唑-4-基)、四唑基(如1_四 唑基、2-四唑基、5-四唑基)、噁唑基(如2-噁唑基、2-噁唑基、5-噁唑基)、異噁唑基(如
3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基)、噻唑基(如2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、 噻二唑基、異噻唑基(如3-異噻唑基、4-異噻唑基、5-異噻唑基)、吡啶基(如2-吡啶基、 3-吡啶基、4-吡啶基)、噠嗪基(如3-噠嗪基、4-噠嗪基)、嘧啶基(如2-嘧啶基、4-嘧啶 基、5-嘧啶基)、呋咕基(如3-呋咕基)、吡嗪基(如2-吡嗪基)、噁二唑基(如1，3，4-噁二唑-2-基)、1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、批咯烷、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、 1-咪唑啉基、2-咪唑啉基、4-咪唑啉基、1-咪唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、1-吡唑啉 基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、1-吡唑烷基、3-吡唑烷基、4-吡唑烷基、N-哌啶基、2-哌啶 基、3-哌啶基、4-哌啶基、哌嗪基、2-哌嗪基、3-哌嗪基、嗎啉基、四氫吡喃基或其類似物。
本文中，術(shù)語“商素”代表氟、氯、溴和碘。本文中，術(shù)語“醫(yī)藥上可接受的鹽”包括與有機或無機酸或堿所形成的鹽。醫(yī)藥上 可接受的酸加成鹽包括與礦物酸(例如鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸)或有機酸(例如檸檬 酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、草酸、甲酸、反丁烯二酸、蘋果酸、草酰乙 酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、對-甲苯磺酸、苯磺酸和羥乙基磺酸)形成的鹽。醫(yī)藥上可接受的 堿鹽包括銨鹽、堿金屬鹽(例如鈉鹽和鉀鹽)、堿土金屬鹽(例如鈣鹽和鎂鹽)和有機堿鹽 (包括伯胺、仲胺和叔胺鹽)。本文中，術(shù)語“前藥”代表化合物在身體內(nèi)轉(zhuǎn)變(例如在血液中水解)成其具有醫(yī) 療效果的活性形式。本文中，術(shù)語“溶劑合物”代表包括本發(fā)明化合物與溶劑的復(fù)合物，其中他們反應(yīng) 或他們自其沉淀或結(jié)晶。本文中，術(shù)語“立體異構(gòu)體”是異構(gòu)體分子，其分子連接相同但分子的空間排列不 同。本文中，術(shù)語“對映異構(gòu)體”代表彼此僅具有對映結(jié)構(gòu)關(guān)系但無法令其互相重疊一 致的立體異構(gòu)體，如一個人的左手與右手是相同但相反的。本文中，術(shù)語“工峰”是缺乏蜂群蜂王的完全繁殖能力的雌峰；在大多數(shù)情況下，其 與蜂王的非繁殖活動增加有關(guān)。峰卵個別產(chǎn)卵于蠟質(zhì)蜂巢的巢室中，其由工峰制造并成型。 蜂王子起初喂食工蜂生產(chǎn)的蜂王漿，接著喂食蜂蜜和花粉。例外是蜂王子緩慢喂食蜂王漿， 其將發(fā)育成蜂王。在巢室內(nèi)結(jié)繭前，蜂王子進行數(shù)次蛻變并變成蛹。雄蜂自未受精的卵孵 化出，雌蜂(蜂王和工蜂)自受精卵孵化出。蜂王可選擇使卵受精，此通常取決于產(chǎn)卵處的 蜂巢。年輕工蜂清潔蜂巢并喂食蜂王子。當(dāng)蜂王漿生產(chǎn)腺萎縮，他們開始建造蜂巢室。當(dāng) 他們較年長時，他們進行蜂群內(nèi)的其它任務(wù)，例如采花蜜和花粉并捍衛(wèi)蜂巢。接著，工蜂認 巢飛行，最后離開蜂巢并擔(dān)任外勤蜂。本文中，術(shù)語“蜂王漿”是蜜蜂分泌物，其用于滋養(yǎng)蜂王子。其分泌自位于年輕工 蜂頭部的下咽頭腺(hypopharyngeal gland)并用于喂食蜂群中的蜂王子。根據(jù)本發(fā)明，HDAC是一種酶，其通過選擇性去乙?；挥诮咏诵慕M蛋白氨端的 賴氨酸ε-氨基而影響轉(zhuǎn)錄。HDAC抑制劑正成為治療實體和血液惡性疾病的新一類抗癌 齊U。本發(fā)明出乎意料地發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑可影響年輕工蜂生產(chǎn)的蜂王漿的MRJP3的68kDa 和64kDa的表達。根據(jù)本發(fā)明，HDAC抑制劑包括(但不限于)四類HDAC抑制劑短鏈脂肪 酸、羥肟酸、芐酰胺和環(huán)狀肽，如醫(yī)藥研究評論(Medicinal Research Reviews)，第26卷，第 4期，第397-413頁，2006所報導(dǎo)；如美國國家癌癥研究所期刊(Journal of the National Cancer Institute)，第92卷，第15期，2000年8月2日，第1210-1216頁所提及以羥肟酸 為主的雜合極性化合物(HPC)；美國專利第6，174，905號、EP 0847992、JP 258863/96和日 本申請案第10138957號所述的芐酰胺衍生物；W001/38322中的化合物；芐酰胺M344(人 類遺傳學(xué)(Hum Genet)，2006，120，第 101-110 頁)；丁酸鈉(sodium butyrate)(人類分子遺傳學(xué)(Human Molecular Genetics)，2004，第 13 卷，第 11 期，第 1183-1192 頁)；曲古抑 菌素 A (Trichostatin A)(分子癌癥(Molecular Cancer) 2006，5 :8 ；此文獻可自 http // www. molecular-cancer, com/content/5/1/8 得到)；美國專利第 7，169，801 號揭示的具 有式Z-Q-L-M或Z-L-M的化合物；美國專利第6，888，027號所述的包括PXDlOl的磺酰胺化 合物；歐洲專利第1301184號所述的丙戊酸(valproic acid)和其衍生物；N，N'-六亞甲 基二乙酰胺(hexamethylene bisacetamide, HMBA)；美國專利第 6，087，367 號和 RE 38506 所述的與HMBA有關(guān)的化合物；美國專利第7，399，787號所揭示的與HMBA有關(guān)的化合物，例 如辛二酰苯胺異羥廂酸(suberoylanilide hydroxamic acid) (SAHA)；血液(Blood)，2003 年10月1日，第102卷，第7期，第2615-2622頁所報導(dǎo)的NVP-LAQ824(羥肟酸衍生物) 和NVP-LAQ824(4-氨基甲基肉桂異羥肟酸的衍生物)；通過誘發(fā)細胞凋亡誘導(dǎo)生長抑制和 腫瘤細胞株退化并作為抗癌劑進行第一期臨床試驗測試的LBH589(血液(Blood)，105 (4) 1768-76，2005年2月15日)；美國專利申請案第11/855416號和第12/418373號提及的化 合物；蜂膠；蜂膠素和美國公開案第20080242648號提及的化合物，包括N-羥基-N' -3-吡 啶基辛二酰胺(pyroXamide)、M-羧基肉桂酸雙羥酰胺(CBHA)、曲古抑菌素A(TSA)、曲古 抑菌素C、水楊酰異羥肟酸(SBHA)、壬二酰雙異羥肟酸(azelaic bishydroxamic acid) (ABHA)、壬二酰-1-異羥肟酸鹽-9-苯胺(AAHA)、6_ (3-氯苯基脲基)己酸異羥肟酸(3C 1-UCHA)、奧克氟汀(oxamflatin)、A-161906、斯瑞泰德(scriptaid)、PXD-101、含有異羥肟 酸的環(huán)狀肽(CHAP)、叮？-2357、]\^2796、麗2996、托普辛六(仕3 ( 丨11 A)、FR901228 (FK 228 或縮酚酸肽(D印sip印tide))、FR225497、阿匹西汀(apicidin)、CHAP、HC-毒素、WF27082、 查米多星(chlamydocin)、丁酸鈉、異戊酸鹽、戊酸鹽、4-苯基丁酸鹽(4-PBA)、4_苯基丁酸 鈉鹽(PBS)、丁酸精氨酸、丙酸鹽、丁酰胺、異丁酰胺、苯乙酸鹽、3-溴丙酸鹽、三丁酸甘油酯 (tributyrin)、丙戊酸、丙戊酸鹽、CI-994、MS-27-275的3'-氨衍生物、MGCDO103和德普 地辛(D印udecin)。其中所引用的公開文獻并入本文中作為參考根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，用于本發(fā)明的HDAC抑制劑是下式(I)所代表的化
合物
R2
R4 R7其中R1和R2各自獨立為OH、0C( = 0)烷基、0_烷基、S-烷基、N-烷基、0_烯基、S-烯 基、N-烯基、0-炔基、S-炔基、N-炔基、0-C3_8環(huán)烷基、S-C3_8環(huán)烷基、N-C3_8環(huán)烷基、0-不飽 和5元至10元單環(huán)或雙環(huán)、S-不飽和5元至10元單環(huán)或雙環(huán)、N-不飽和5元至10元單環(huán) 或雙環(huán)、烷基、烯基、炔基、C3_8環(huán)烷基、不飽和5元至10元單環(huán)或雙環(huán)或包含至少一個選自 下列群組的雜原子N、0和S的飽和或不飽和5元至10元雜環(huán)；或R1與R2 —起形成二氧戊環(huán)；
權(quán)利要求
一種培育相比于對照組幼蟲，重量至少大50％的蜜蜂幼蟲的方法；所述方法包括以一種HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物喂飼年輕工蜂，并以所述年輕工蜂所分泌的蜂王漿喂飼蜜蜂幼蟲；其中對照組的幼蟲所食用的蜂王漿是由未喂飼HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物的年輕工蜂分泌。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中蜜蜂幼蟲的重量增加約50%至5倍、50%至2倍、 50%至3倍、1至5倍、2至5倍或1至3倍。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中喂飼蜂王漿72小時后的幼蟲重量增加大于1倍 (100% )。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中喂飼蜂王漿72小時后的幼蟲重量增加大于1.5倍。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中喂飼蜂王漿72小時后的幼蟲重量增加約2到5倍。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中喂飼蜂王漿72小時后的幼蟲重量增加約3到5倍。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中蜂王漿中MRJP3蛋白質(zhì)的68kDa對64kDa的比例改變。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中蜂王漿中MRJP3蛋白質(zhì)的68kDa對64kDa的比例，相 對于對照組，增加約1. 5至12倍、1. 5至5倍、2至6倍、2至10倍、4至12倍或2至4倍。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述HDAC抑制劑選自下列式(I)化合物的群組或其 醫(yī)藥上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、前藥和溶劑合物，下列式(II)化合物的群組 或其醫(yī)藥上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、前藥和溶劑合物，SAHA，蜂膠和蜂膠素的 群組，
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述HDAC抑制劑是臺灣綠蜂膠、蜂膠素A、蜂膠素 B、蜂膠素C、蜂膠素D、蜂膠素E、蜂膠素F、蜂膠素G、蜂膠素H、蜂膠素I、蜂膠素J、SAHA或 NBM-HD-I。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中HDAC抑制劑選自下列群組
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中蜜蜂幼蟲可由工蜂喂飼由其分泌的蜂王漿或由人 類喂飼收集自工蜂的蜂王漿。
13.一種培育相比于對照組蜂蛹重量至少大50%的蜂蛹、或相比于對照組蜂王重量至 少大50%的蜂王的方法；所述方法包括以一種HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物喂 飼年輕工蜂，并以所述年輕工蜂所分泌的蜂王漿喂飼幼蟲，而獲得由所述幼蟲發(fā)育而成的 蛹或蜂王，其中對照組的蛹或蜂王由食用未喂飼HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物 的年輕工蜂所分泌的蜂王漿的蜜蜂幼蟲發(fā)育而成。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中蜜蜂幼蟲可由工蜂喂飼由其分泌的蜂王漿或由人 類喂飼收集自工蜂的蜂王漿。
15.一種方法，其包括以一種HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物喂飼年輕工蜂， 以生產(chǎn)相比于對照組蜂王漿，68kDa與64kDa MRJP3蛋白質(zhì)比例經(jīng)改變的蜂王漿。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中MRJP3蛋白質(zhì)的68kDa對64kDa的比例，相對于對照組，增加約1.5至12倍、1.5至5倍、2至6倍、2至10倍、4至12倍或2至4倍。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述HDAC抑制劑選自如權(quán)利要求8所述的式(I) 化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、前藥和溶劑合物的群組。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述HDAC抑制劑選自如權(quán)利要求8所述的式(II) 化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、前藥和溶劑合物的群組。
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述HDAC抑制劑是臺灣綠蜂膠、蜂膠素A、蜂膠素 B、蜂膠素C、蜂膠素D、蜂膠素E、蜂膠素F、蜂膠素G、蜂膠素H、蜂膠素I、蜂膠素J、SAHA或 NBM-HD-I。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述HDAC抑制劑選自如權(quán)利要求11所述的化合 物的群組。
21.一種如權(quán)利要求15所述的方法所制得的蜂王漿，包括相對于對照組蜂王漿，其中 68kDa與64kDa MRJP3蛋白質(zhì)的比例改變。
22.如權(quán)利要求21所述的蜂王漿，其中蜂王漿中MRJP3蛋白質(zhì)的68kDa對64kDa的比 例，相對于對照組，增加約1. 5至12倍、1. 5至5倍、2至6倍、2至10倍、4至12倍或2至4倍。
23.—種改變蜂王漿中68kDa與64kDa MRJP3蛋白質(zhì)的比例的方法，其包括以一種HDAC 抑制劑或數(shù)種HDAC抑制劑的混合物喂飼年輕工蜂，以生產(chǎn)相比于對照組蜂王漿，68kDa與 64kDa MRJP3蛋白質(zhì)比例經(jīng)改變的蜂王漿。
24.一種調(diào)控工蜂mrjp3基因的表觀遺傳的方法，其包括以HDAC抑制劑或數(shù)種HDAC抑 制劑的混合物喂飼工蜂，以調(diào)控工蜂的mr jp3基因表達。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中表觀遺傳為HDAC活性的抑制。
26.一種調(diào)控工蜂mrjp3基因的表觀遺傳的方法，其包括以DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑喂飼 工蜂，以調(diào)控工蜂的mrjp3基因表達。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中表觀遺傳為DNA甲基化的抑制。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑為沒食子酸表兒茶素酯 (Epigallocatechin Gallate，EGCG)0
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其中該工蜂所分泌的蜂王漿可促進食用該蜂王漿的蜂 王子的生長。
全文摘要
本發(fā)明提供改變蜂王漿中68千道爾頓(kDa)與64kDa MRJP3蛋白質(zhì)的比例的方法、制備相比于對照組蜂王漿，含68kDa與64kDa蛋白質(zhì)比例經(jīng)改變的MRJP3的蜂王漿的方法、以及由前述方法所制得的蜂王漿。本發(fā)明還提供促進蜂王子生長的方法，所述方法包括以本發(fā)明的蜂王漿喂食蜂王子。本發(fā)明另外提供培育個體較正常大的蜂王子、蜂王蛹和蜂王的方法。
文檔編號A23L1/076GK101960997SQ20101023608
公開日2011年2月2日 申請日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月22日
發(fā)明者紀(jì)俐伶, 陳嘉南, 陳威戎, 黃中洋, 黃偉展 申請人:彥臣生技藥品股份有限公司