專利名稱：誘導(dǎo)型啟動子攜帶Glu基因培育抗青枯病煙草的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)型啟動子攜帶67 基因培育抗青枯病煙草的方法，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
青枯病是煙草種植過程中的主要病害之一，每年因青枯病的危害給煙草的產(chǎn)量與 質(zhì)量造成巨大的損失。煙草是四倍體，遺傳背景相當(dāng)復(fù)雜，抗常規(guī)育種來選育抗青枯病的煙 草品種很難實(shí)現(xiàn)，加之育種年限過長，不能滿足我國煙草生產(chǎn)的要求；且目前對于煙草青枯 病的防治尚無特效藥，因此通過藥劑進(jìn)行防治不能滿足煙草生產(chǎn)的要求，加上過度的施用 農(nóng)藥本身對煙草的生長與煙葉的產(chǎn)量也不利。隨著基因工程技術(shù)手段的發(fā)展，為選育抗煙 草青枯病的轉(zhuǎn)基因煙草提供了有利的基礎(chǔ)。煙草青枯菌從植物根部侵入，首先在根皮層細(xì)胞間隙等處定殖，然后在導(dǎo)管 及相鄰組織內(nèi)迅猛增殖和廣泛散布，由此產(chǎn)生維管系統(tǒng)的阻塞和破壞，最終導(dǎo)致植物枯萎 死亡(Tsi^A/ya K 2004)。青枯病菌還分泌細(xì)胞外多種細(xì)胞壁降解酶(如纖維素酶類和果 膠酶類)，其可能也在破壞導(dǎo)管組織，引起植株枯萎死亡方面起重要作用(何禮遠(yuǎn)和康耀衛(wèi)， 1995)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，通過將外緣基因?qū)霟煵葸M(jìn)行功能驗(yàn)證或者抗病選育已 經(jīng)有很多報導(dǎo)，同時對轉(zhuǎn)基因安全性也得到了普遍的關(guān)注，特別是1998年轉(zhuǎn)GNA馬鈴薯的 “普斯陶伊事件”和1999年轉(zhuǎn)Bt玉米的“斑蝶事件”引起了人們對轉(zhuǎn)基因作物的恐慌與 擔(dān)憂。因此通過植物基因工程技術(shù)手段來解決煙草煙草抗病育種首要的是考慮到轉(zhuǎn)基因的 安全性。因此選擇啟動子、目的基因，讓目的基因在煙草怎么樣表達(dá)已經(jīng)成為當(dāng)前科研的熱 點(diǎn)?；蚺c幾丁質(zhì)酶基因廣泛運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因上，以"基因經(jīng)修飾后轉(zhuǎn)化煙草，其胞外產(chǎn) 物能對鐮刀菌(Fusarium solani)呈現(xiàn)抑菌活性(Sela-Buurlage M B，ei a入 1993)。β 一 1，3 —葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因植株后代具有良好抗炭疽病和黑脛病的能力(黎定軍 等，2002)。誘導(dǎo)型啟動子主要是一類受某些物理或化學(xué)信號的刺激而能大幅度地提高基因 在特定時期、特定部位的轉(zhuǎn)錄水平的啟動子(Subramanian S 2002)。已有很多報道關(guān)于誘 導(dǎo)型啟動子的研究，有熱誘導(dǎo)啟動子、干旱誘導(dǎo)啟動子、激素誘導(dǎo)啟動子、機(jī)械損傷誘導(dǎo)啟 動子，當(dāng)然很多誘導(dǎo)型啟動子的活性的啟動可受多因素的誘導(dǎo)(趙恢武2000 ;Xu D 1993； 李嬋娟 2006 ；李秋莉 2006 ；Zhu Jun 2005)。本發(fā)明就是針對以上背景技術(shù)，通過分子生物學(xué)克隆煙草誘導(dǎo)型啟動子P1，以及 煙草β_1，3 -葡聚糖酶基因67 通過中間載體，將目的啟動子、目的基因整合在一起，構(gòu) 建植物表達(dá)載體。建立了以抗生素為篩選劑的轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，培 育轉(zhuǎn)基因煙草，以及高效的分子檢測手段及抗病鑒定。誘導(dǎo)型啟動子與基因都來自煙 草基因組中的核苷酸序列，因此為安全、高效的解決煙草青枯病培育奠定了良好的技術(shù)基 石出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)型啟動子攜帶基因培育抗青枯病煙草的方法。利用轉(zhuǎn) 基因技術(shù)安全、有效地改良煙草抗青枯病。本發(fā)明的利用誘導(dǎo)型啟動子攜帶67 基因培育抗青枯病煙草的方法，將煙草基因 組中的誘導(dǎo)型啟動子Pl核苷酸序列與抗病基因Glu整合在一起，培育轉(zhuǎn)基因煙草，讓誘導(dǎo) 型啟動子調(diào)控抗病基因在受病原菌侵染時表達(dá)。具體地說，從煙草中克隆誘導(dǎo)型啟動子Ρ1、抗病基因67 構(gòu)建了植物表達(dá)載體， 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將基因轉(zhuǎn)入煙草翠碧一號中。本發(fā)明利用煙草誘導(dǎo)型啟動子Pl與煙草抗病基因Glu培育抗青枯病煙草新材 料，包括煙草誘 導(dǎo)型啟動子Pl及煙草抗病基因的克隆，構(gòu)建植物表達(dá)載體，抗煙草青 枯病新材料的培育，以及抗病新材料的分子檢測篩選、青枯菌的接種鑒定，其特征在于
1.克隆得到誘導(dǎo)型啟動子的核苷酸序列來自于翠碧一號煙草品種，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。2.克隆得到煙草β-1，3 -葡聚糖酶基因即抗病基因GA/的核苷酸序列來自于三 生煙草，具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。3.將這兩個核苷酸序列整合到中間載體上，獲得的載體命名為PSC1300-Pl-67 其中中間載體指的是PCAMBIA1300，啟動子Pl是指煙草誘導(dǎo)型啟動子，基因GA/是指煙草 β-1,3 -葡聚糖酶基因。4.將載體引入農(nóng)桿菌，離體轉(zhuǎn)化煙草葉片，培育獲得轉(zhuǎn)基因煙草。本發(fā)明基于轉(zhuǎn)基因煙草安全性前提下，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)手段，通過對煙草本 身基因組存在的啟動子、目的基因，同源克隆得到誘導(dǎo)型啟動子、煙草抗病基因67"，由誘導(dǎo) 型特異啟動子攜帶抗病基因在受青枯病菌侵染時，誘導(dǎo)基因表達(dá)，有效的抑制青枯病在煙 草種植過程中的蔓延以及給煙葉產(chǎn)量、品質(zhì)帶來的影響。構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)使抗病基因 Glu的植物表達(dá)載體，以及通過組培培育轉(zhuǎn)基因煙草植株，對煙草進(jìn)行接種青枯菌進(jìn)行抗性 鑒定，驗(yàn)證了該基因可抗青枯病，并獲得了抗青枯病新材料。根據(jù)上述培育出來的轉(zhuǎn)基因煙草在受青枯菌侵染時，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抵抗能力 或者免疫能力。已經(jīng)成功獲得一批轉(zhuǎn)pSC1300-Pl-67 的煙草新材料。本發(fā)明所克隆的煙草啟動子序列由1301 bp個核苷酸組成(含兩端的引物長 度)，扣除引物設(shè)計時添加的核苷核序列，所克隆的的實(shí)際長度為1291 bp。通過NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)在線與GenBank中已報道的序列進(jìn)行序列相 似性檢索。結(jié)果與Peng，J. -L等人已發(fā)表的PPPs序列相比，核苷酸序列的同源性為 99%，包含了完整的受病原物誘導(dǎo)的Bac元件。這表明本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)得到了煙草multiple stimulation response gene, Pl 啟動子序列。Pl 序列中含有個 514A、417 個 Τ、164 個 C、 196個G，在整個序列中AT占72. 11%，GC的比例僅占27. 89%。采用植物順式元件查詢數(shù)椐 庫(http://WWW. dna. affrc. go. jp/PLACE/ )對所獲Pl啟動子區(qū)段進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該 啟動子區(qū)域含有1個TATA盒，15個CAAT盒，21個GATA盒，1個CCAAT盒，1個rpoH2基 序，1個rpoS17基序，1個phoB基序，1個rpoD17基序和1個rpoD16基序，他們都與基因 表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。通過NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)在線與 GenBank 中已報道的序列進(jìn)行序列相似性檢索。檢索結(jié)果表明克隆的抗病基因與Sperisen，C.，等人已發(fā) 表的M60403序列相比，僅存在2個核苷酸的差異，核苷酸序列的同源性為99%。結(jié)果表明 我們得到了煙草葡聚糖酶基因片段。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因煙草新材料具有以下優(yōu)點(diǎn)從煙草基因組克隆得到誘導(dǎo)型啟動子、 煙草基因組克隆得到的基因運(yùn)用于煙草分子育種上，提高了轉(zhuǎn)基因安全性，由誘導(dǎo)型 啟 動子攜帶抗病基因在煙草受到外界病原菌侵染時讓基因啟動表達(dá)，對煙草青枯病有較強(qiáng) 的抵抗能力甚至達(dá)到免疫功能。通過對轉(zhuǎn)基因煙草接種青枯菌進(jìn)行抗性鑒定，得到了高抗 煙草青枯病的轉(zhuǎn)基因新材料，為培養(yǎng)高抗煙草青枯病的轉(zhuǎn)基因植株奠定了有利的基礎(chǔ)。


圖 1 為 Pscl300- Pl- Glu 的構(gòu)建；
圖2為轉(zhuǎn)基因煙草PCR分子檢測；其中a為pSC1300-Pl- Glu轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA， b為PCR分子檢測pSC1300-Pl- Glu轉(zhuǎn)基因煙草植株； 圖3為轉(zhuǎn)基因植株青枯菌的接種鑒定。
具體實(shí)施例方式
為了進(jìn)一步更詳細(xì)地闡明本發(fā)明不是限制發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例加以說明。實(shí)施例1煙草基因組DNA的提取以及啟動子、抗病基因的克隆
取翠碧一號煙草品種的葉片0. 3g左右的凍存組織，液氮研成粉末。加入500 μ 1裂解 緩沖液(IOmmol Tris-Cl pH8. 0 ；0. Imol EDTA pH8. 0 ；0. 5% SDS ；20μ g/ml RNase A), 50°C 水浴3-5hr。加入500 μ 1平衡酚，振蕩混勻后，于4°C 12000g離心15min，取上層水相。反 復(fù)抽提一次。加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，振蕩混勻后，于4°C 12000g離心IOmin ； 取上層水相，加入2倍體積的冰預(yù)冷的無水乙醇，置-20°C 20min。以吸頭小心挑取云絮 狀物轉(zhuǎn)入另一 Ep管中，以70%乙醇洗滌1-2次。待沉淀風(fēng)干后，加入100 μ ITE溶液溶解， 置-20 V保存。通過GENBANK已經(jīng)公布的PPS啟動子序列，設(shè)計兩條弓丨物F 5 ’ -GCAAGCTTAT TGATGAAAATTTTGA-3' R:5' -GTGGATCCAGTAGTACTATTTATAGTGATATA
TATTT-3，，利用同源擴(kuò)增PCR克隆得到Pl啟動子，PCR程序?yàn)?4°C 5min - (94°C Imin — 54 "C 30s — 72 "C 2. 5min) IOcycle — (94 "C Imin — 57 "C 30s — 72 "C 2. 5min)20cycle 72°C IOmin0回收目的條帶，用T4連接酶連接到pGEM18_T載體上，大腸 桿菌DH5 α轉(zhuǎn)化涂板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行搖菌，提質(zhì)粒， 送出去測序。結(jié)果與Peng，J. -L等人已發(fā)表的PPPs序列相比，核苷酸序列的同源性為 99%，包含了完整的受病原物誘導(dǎo)的Bac元件。這表明本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)得到了煙草multiple stimulation response gene, /7 啟動子序列。取三生煙草品種的葉片0. 3g左右的凍存組織，液氮研成粉末。加入500 μ 1 裂解緩沖液(IOmmol Tris-Cl pH8. 0 ；0. Imol EDTA pH8. 0 ；0. 5% SDS ；20 μ g/ml RNase A), 50°C水浴3-5hr。加入500 μ 1平衡酚，振蕩混勻后，于4°C 12000g離心15min，取上層水 相。反復(fù)抽提一次。加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，振蕩混勻后，于4°C 12000g離心 IOmin ；取上層水相，加入2倍體積的冰預(yù)冷的無水乙醇，置_20°C 20min。以吸頭小心挑取 云絮狀物轉(zhuǎn)入另一 Ep管中，以70%乙醇洗滌1-2次。待沉淀風(fēng)干后，加入100μ ITE溶液溶 解，置_20°C保存。通過GENBANK已經(jīng)公布的Glu基因序列，設(shè)計兩條引物67i/R-1020-SacI5’ - CGGCGAGCTCTCACCCAAAGTTGATATTATATTTGG -3’ ^wF-I-SmaI 5’ - ATATCC CGGGGCCACCATGGCTGCTATCACACTCCTA -3，克隆得到煙草 β_1，3 -葡聚糖酶基因， 所克隆的煙草β_1，3 -葡聚糖酶基因全長有1011個核苷酸序列，該序列編碼336個 氨基酸，與Sperisen，C.，等人發(fā)表的煙草葡聚糖酶基因的氨基酸序列有1個差異，同源性 為99%。BioXM2. 2軟件推導(dǎo)出其蛋白質(zhì)分子量為36. 87 KDa，等電點(diǎn)為8. 73。融合GST標(biāo) 簽后蛋白分子量為63. 84 KDa0該基因已棄除了 3’端定位于液泡的信號肽，基因產(chǎn)物主要 分泌到胞外。實(shí)施例2煙草Pl誘導(dǎo)型特異啟動子攜帶抗病基因67 的載體構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶PST I、EcoR I雙酶切載體pSPROK和載體PCAMBIA1300，并將回收到的目的片段進(jìn)行純化，用T4連接酶16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci菌株，涂板后，倒 置放在37°C過夜培養(yǎng)后挑起單菌落，用試劑盒提取質(zhì)粒，用PST I , EcoR I雙酶切鑒定，獲 得的重組的載體命名為PSC1300。利用BamH I、Hind III雙酶切載體pSC1300以及Pl啟動子，回收目的片段，用T4 連接酶16°C過夜連接，用大腸桿菌DH5 α菌株轉(zhuǎn)化，涂板后，倒置放在37°C過夜培養(yǎng)后挑 起單菌落，用試劑盒提取質(zhì)粒，用BamH I、Hind III雙酶切鑒定，獲得的重組的載體命名為 PSC1300- Pl0分別用Smal、Sac I單酶切載體Pscl300-Pl和膠回收目的基因GLU,并同時回收 酶切產(chǎn)物，用T4連接酶16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci菌株，涂板后，倒置放在37°C 過夜培養(yǎng)后挑起單菌落，進(jìn)行PCR鑒定，挑單個陽性重組菌于Kan含量為50mg. L-I的LB培 養(yǎng)基中37°C振蕩過夜培養(yǎng)，用試劑盒提取質(zhì)粒，命名為pSC1300- VY-Glu0整個構(gòu)建如圖1 所示。實(shí)施例3煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
1. 煙草無菌苗的獲得以及根瘤農(nóng)桿菌侵染液的制備
往1. 5毫升的離心管中放入大概200粒左右的CB—1煙草種子，用70%的酒精進(jìn)行消 毒1分鐘，在超凈工作臺上用事先準(zhǔn)備好的無菌水清洗三次用0. 1%的砷汞進(jìn)行消毒10-15 分鐘無菌水再次清洗5次，將處理好的無菌種子種植在1/2MS培養(yǎng)基上。雙元載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化1. 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
取-70°C保存的EHA105于含50 μ g/ml鏈霉素平板劃線，28°C培養(yǎng)。挑取單菌落接 種于5ml YEB液體培養(yǎng)基中，220rpm 28°C振蕩培養(yǎng)12-16 hr。取2ml菌液轉(zhuǎn)接于IOOml YEB液體培養(yǎng)基中，28 °C 220rpm振蕩培養(yǎng)至0D600=0. 5。轉(zhuǎn)入無菌離心管，5000rpm離心 5min,去上清液。加入IOml預(yù)冷的0. IM的CaC12溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置20min。 4°C 5000rpm離心5min，去上清。加入4ml預(yù)冷的含15%甘油的0. IM的CaC12溶液，輕輕懸 浮。農(nóng)桿菌懸浮液分裝于無菌Eppendorf管中，每管200 μ 1凍存于-70°C。1. 2.雙元載 體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 取1μ g左右的實(shí)施例2制備的質(zhì)粒pSC1300- Pl- 加入到 200ml EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，冰浴30min，-70°C放置IOmin。再在37°C水浴5min 或42°C水浴lmin，接著冰浴2min，加入800mlYEB液體培養(yǎng)基28°C，175rpm搖培3hr后涂在 含50 μ g/ml Kanamycin與25 μ g/mlRif的Y^平板上。28°C培養(yǎng)到形成單菌落。從YEB固體平板上挑取含有重組質(zhì)粒的單菌落，接種到含有Rif和Km的液體培 養(yǎng)基中，28°C 250rpm培養(yǎng)過夜；取Iml過夜培養(yǎng)的菌液接種到30ml含有相應(yīng)抗生素(或無任何抗生素)的YEB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，至0. D. 600 =0. 6-0. 8,4000rpm, 4°C離心IOmin,棄上清；沉淀用20ml MS液體培養(yǎng)基(MS大量+ MS微量+20 g/Ι蔗糖，pH=5. 8)重 新懸浮備用。分光光度計測得此時菌液的0. D. 600在0.3-0. 6左右。2. 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化
外植體制備取事先培養(yǎng)的無菌苗嫩葉，剪切成0. 5X0. 5cm大小。葉盤法轉(zhuǎn)化將 處理好的外植體投入制備好的菌液中，浸泡侵染5mi后，用含有Cef 500mg/L的無菌水沖 洗3-5次后，接種于共培養(yǎng)基中于28°C暗培養(yǎng)；2天后轉(zhuǎn)入含有Cef 500mg/L, Hyg 10mg/L 的葉片芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，控制溫度為25-28°C、光強(qiáng)為20001eX、每天光照時間為 12-14hr。等葉芽長至Icm大hr，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。待基部伸出大量根系、上部生長至3 4cm的幼苗轉(zhuǎn)至盛有無菌沙土的培養(yǎng)盒內(nèi)，煉苗后轉(zhuǎn)入溫室培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因煙草。誘導(dǎo)培 養(yǎng)基培養(yǎng)基+0. lmg/L NAA+ lmg/L 6-BA，共培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS 培養(yǎng)基+0. lmg/L NAA+ lmg/L 6-BA，誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基MS 培養(yǎng)基+0. lmg/L NAA+lmg/L 6-BA+10mg/L Hyg +500mg/L Cef， 生根培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基5mg/L Hyg +500mg/L Cef。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因煙草的PCR、抗性檢測
1.采用CTAB法快速提取實(shí)施例3獲得的轉(zhuǎn)煙草基因組DNA，葉片粉末取0. Ig,加入 600-700ul CTAB (100 mM Tris 'Cl, pH 8. O ,20 mM EDTA, pH 8. 0,1. 4 M NaCl)，65°C水 浴15min-30min，加入相同體積的氯仿異戊醇，劇烈震動lmin，10，OOOrpm.離心lOmin，取 上清液到新的離心管中，加入相同體積的異丙醇(預(yù)冷)10，OOOrpm離心lOmin，用70%酒精 清洗兩次。并烘干用30-50ul H2O溶解，并加入小量的RNAase，取l_3ul用于PCR檢測，通 過在Pl啟動子的末端合成上游引物promoter -P1-F: 5 ‘ CAAGCAATGACATCTAAGC3，，在 終止子Tnos上游合成引物Tnos-R: 5，TACATGCTTAACGTAATTCAACAGA 3，。檢測的結(jié)果如圖 2所示，結(jié)果表明了已經(jīng)成功的將整個載體PSC1300- Vl-Glu轉(zhuǎn)入煙草翠碧一號品種中，獲 得了轉(zhuǎn)PSC1300- Vl-Glu的轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株。2.將保存的青枯菌種劃板，挑取單克隆于SPA培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，過夜取Iml菌液 于新的SPA培養(yǎng)基培養(yǎng)，5個小時后，檢測濃度，OD=O. 5的時候，取出菌液離心，收集菌體，用 等量的無菌水懸浮。用一毫升容量的注射器吸取重懸的菌液接種于轉(zhuǎn)基因植株葉片上，以 同期生長的CB-I作為對照。轉(zhuǎn)基因煙草植株對青枯菌有一定的抵抗能力，個別轉(zhuǎn)67 基因 煙草植株達(dá)到免疫能力如圖3所示，顯示正常的植株為轉(zhuǎn)基因植株，葉片萎蔫的為對照植 株。結(jié)果表明，在接種同樣量的青枯菌菌液后，轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫能力，對青枯 菌有一定的抑制作用，而對照品種在接種青枯菌過程后，幾天內(nèi)出現(xiàn)葉片萎焉現(xiàn)在，而轉(zhuǎn)基 因陽性植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫能力，半個月后對照植株表現(xiàn)出枯死現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因陽性植 株表現(xiàn)出具有較強(qiáng)的抗性能力，并未發(fā)現(xiàn)枯死現(xiàn)象。
權(quán)利要求
一種利用誘導(dǎo)型啟動子攜帶Glu基因培育抗青枯病煙草的方法，其特征在于將煙草基因組中的誘導(dǎo)型啟動子P1核苷酸序列與抗病基因Glu整合在一起，培育轉(zhuǎn)基因煙草。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將誘導(dǎo)型啟動子P1核苷酸序列與抗病基 因整合到中間載體上，獲得了命名為PSC1300-P1-67"的載體，將載體引入農(nóng)桿菌，離體 轉(zhuǎn)化煙草葉片，培育轉(zhuǎn)基因煙草。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)型啟動子的核苷酸序列來 自于煙草翠碧一號，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述基因的核苷酸序列來自于 三生煙草，具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列及SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)型啟動子攜帶Glu基因培育抗青枯病煙草的方法，該方法將煙草基因組中的誘導(dǎo)型啟動子P1核苷酸序列與抗病基因Glu整合在一起，培育轉(zhuǎn)基因煙草。本發(fā)明從煙草基因組克隆得到誘導(dǎo)型啟動子、煙草基因組克隆得到的Glu基因運(yùn)用于煙草分子育種上，提高了轉(zhuǎn)基因安全性，由誘導(dǎo)型啟動子攜帶抗病基因在煙草受到外界病原菌侵染時讓基因啟動表達(dá)，對煙草青枯病有較強(qiáng)的抵抗能力甚至達(dá)到免疫功能。通過對轉(zhuǎn)基因煙草接種青枯菌進(jìn)行抗性鑒定，得到了高抗煙草青枯病的轉(zhuǎn)基因新材料，為培養(yǎng)高抗煙草青枯病的轉(zhuǎn)基因植株奠定了有利的基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/56GK101886089SQ20101023519
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月24日
發(fā)明者蘭嵐, 莊偉建, 石新國, 程忠, 蔡鐵城, 陳華, 陳順輝 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)