專(zhuān)利名稱：一種新型pamam的衍生物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地是涉及一種新型PAMAM的衍生物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療對(duì)于遺傳性和后天形成的疾病是一種極其有效的治療途徑，但是要將遺 傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到體內(nèi)仍然是一個(gè)很大的技術(shù)難題，尋找安全、有效和特異性的基因轉(zhuǎn)染方法 仍然是限制基因治療廣泛應(yīng)用的瓶頸。目前基因轉(zhuǎn)運(yùn)主要有兩類(lèi)載體，及病毒性載體和非 病毒性載體。盡管病毒性載體在體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)運(yùn)中均表現(xiàn)出很高的效率，但是它們的 免疫原性、病毒基因的永久整合以及操作的繁瑣限制了它們?cè)诨蛑委熤械膽?yīng)用。相對(duì)而 言，非病毒載體系統(tǒng)(也叫合成基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng))因其操作簡(jiǎn)單、無(wú)免疫原性、基因轉(zhuǎn)運(yùn)能力 大等優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受到人們的重視。但是非病毒轉(zhuǎn)運(yùn)也有轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低和細(xì)胞毒性較大 的弱點(diǎn)。盡管如此，聚陽(yáng)離子樹(shù)狀大分子仍然具有很大的吸引力，一方面是由于它們的結(jié)構(gòu) 比較明確，另一方面在這些大分子的表面具有多個(gè)官能團(tuán)，能夠進(jìn)一步地進(jìn)行化學(xué)修飾從 而得到生物活性和生物相容性更高的新型基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。聚酰胺胺(PAMAM)是目前研究得最多的樹(shù)狀大分子家族之一，研究證明其在體外 具有較強(qiáng)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)能力。由于PAMAM樹(shù)枝狀的表面上具有很多帶正電荷的伯胺基團(tuán)，它 能夠?qū)ж?fù)電荷的DNA或RNA壓縮成一個(gè)多聚的復(fù)合體形式，從而促進(jìn)基因向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。 PAMAM的基因轉(zhuǎn)運(yùn)能力和細(xì)胞毒性是與其表面功能基團(tuán)的性質(zhì)緊密相關(guān)的。表面帶負(fù)電或 中性的樹(shù)狀分子比帶正電荷的樹(shù)狀分子毒性要大。此外，聚合物-DNA/RNA復(fù)合體的溶解 性、胞內(nèi)DNA/RNA釋放的難易度等物理化學(xué)性質(zhì)也對(duì)PAMAM介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)起著決定性的 作用。為了進(jìn)一步增加PAMAM樹(shù)狀分子的基因轉(zhuǎn)運(yùn)能力及其生物相容性，很多種配體被連 接到PAMAM表面的伯胺基團(tuán)上以改變其表面性質(zhì)。經(jīng)過(guò)這些修飾得到的衍生物有的具有顯 著增加的基因轉(zhuǎn)運(yùn)能力，有的細(xì)胞毒性下降，還有一些則在這兩方面均有改善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一提供了 一類(lèi)新型PAMAM的衍生物，該P(yáng)AMAM的衍生物具有很好 的轉(zhuǎn)染效率。一類(lèi)新型PAMAM的衍生物，該衍生物為苯丙氨酸偶聯(lián)修飾PAMAM樹(shù)狀分子，其分子
結(jié)構(gòu)為
3 其中，η 為 50 60。本發(fā)明的另一目的是提供上述PAMAM的衍生物的應(yīng)用。具體技術(shù)方案如下PAMAM的衍生物作為轉(zhuǎn)染試劑在生物學(xué)研究中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述生物轉(zhuǎn)染為質(zhì)粒DNA和小分子RNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染；所述應(yīng)用為siRNA細(xì) 胞轉(zhuǎn)染；或所述應(yīng)用為用于包裝病毒。本發(fā)明的另一目的是提供一種生物轉(zhuǎn)染試劑。具體技術(shù)方案如下一種生物轉(zhuǎn)染試劑，其主要成份為苯丙氨酸偶聯(lián)修飾PAMAM樹(shù)狀分子構(gòu)，分子結(jié)
構(gòu)如下 其中，η 為 50 60。本發(fā)明采用氨基酸偶聯(lián)的方法，通過(guò)比較不同種類(lèi)和數(shù)目的氨基酸對(duì)第4代 PAMAM樹(shù)狀分子的一系列的修飾反應(yīng)，利用HEK 293細(xì)胞和3T3-L1細(xì)胞對(duì)這類(lèi)眾多化合物 的轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)表面連接有苯丙氨酸的衍生物PAMAM-Phe具有顯著增強(qiáng)的基 因轉(zhuǎn)運(yùn)能力和生物相容性。進(jìn)一步的，發(fā)現(xiàn)該化合物具有較強(qiáng)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)運(yùn)能力，且其 可用于siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、病毒包裝等多種廣泛應(yīng)用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作。本發(fā)明所述的PAMAM-Phe較未經(jīng)修飾的PAMAM具有顯著的優(yōu)勢(shì)第一，其基因轉(zhuǎn)運(yùn) 能力大大增強(qiáng)，既表現(xiàn)在對(duì)單個(gè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染上，也表現(xiàn)在siRNA的轉(zhuǎn)染和多個(gè)基因的轉(zhuǎn)染 上，此外，其在體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)能力也大大增強(qiáng)；第二，PAMAM-Phe的基因轉(zhuǎn)染能力不應(yīng)血 清的存在而降低，因此在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前無(wú)需像PAMAM介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染那樣需要換無(wú)血清培養(yǎng)基， 大大簡(jiǎn)化了操作過(guò)程；第三，其生物相容性顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性，為其在基因 治療中的應(yīng)用鋪平了道路；最后，我們的研究證明了 PAMAM-Phe作為一種新型的轉(zhuǎn)染試劑 可以用于siRNA的高效轉(zhuǎn)染、逆轉(zhuǎn)錄病毒以及慢病毒的包裝，說(shuō)明其在生物學(xué)研究中廣泛 應(yīng)用的可行性。


圖1氨基酸偶聯(lián)衍生物PAMAM-Phe合成示意圖；圖2PAMAM和PAMAM-Phe的1H匪R光譜分析圖；
表1合成的19種PAMAM衍生物表；圖3 PAMAM氨基酸偶聯(lián)衍生物的初步篩選示意圖(7號(hào)為PAMAM-Phe，0號(hào)為 PAMAM)；圖4 PAMAM-Phe介導(dǎo)FUGW質(zhì)粒(含eGFP基因)轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞熒光強(qiáng)度定量 示意圖；圖5 PAMAM-Phe介導(dǎo)RSV-Luc質(zhì)粒(含熒光素酶報(bào)告基因)轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞定
量示意圖；圖6 PAMAM-Phe介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞示意圖(A、白光視野；B、 Lipofectamin 2000 ；C、PAMAM-Phe ；D、PAMAM)；圖7 PAMAM-Phe應(yīng)用于病毒包裝(A，C 利用Lipofectamin 2000介導(dǎo)包裝的慢病 毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒分別感染3T3-L1細(xì)胞；B，D 利用PAMAM-Phe介導(dǎo)包裝的慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄 病毒分別感染3T3-L1細(xì)胞)；圖8 PAMAM-Phe對(duì)HEK 293細(xì)胞毒性測(cè)定示意圖；圖9 PAMAM-Phe介導(dǎo)小鼠腓腸肌內(nèi)GFP基因(FUGW質(zhì)粒)轉(zhuǎn)運(yùn)示意圖(A、 PAMAM-Phe 轉(zhuǎn)染FUGW ；B、PAMAM轉(zhuǎn)染FUGW ；C、PAMAM_Phe 單獨(dú)注射；D、FUGW質(zhì)粒單獨(dú)注射)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明化學(xué)合成所用試劑均為常規(guī)商業(yè)試劑，生物實(shí)驗(yàn)所用材料均為商業(yè)產(chǎn)品。本發(fā)明所述PAMAM-Phe，根據(jù)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)，可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的在 有機(jī)溶劑中進(jìn)行，以羥基苯并三唑H0Bt，2-(lH-苯并三唑)-N，N, N’，N’ -四甲基脲磷酸鹽 HBTU，N, N- 二異丙基乙胺DIPEA為催化劑，叔丁氧基羰基Boc為保護(hù)基的苯丙氨酸和端氨 基的PAMAM第4代樹(shù)狀分子為原料發(fā)生縮合反應(yīng)，后以無(wú)水醚沉淀法精制，以三氟乙酸脫去 氨基酸氨基上的Boc保護(hù)基，無(wú)水醚沉淀法精制，在半透膜中以4°C純水透析得到純化的端 氨基酸修飾的PAMAM樹(shù)狀分子。 實(shí)施例1、PAMAM-Phe樹(shù)狀分子的化學(xué)合成與純化如圖1所示，取0.07謹(jǐn)ol的PAMAM G4粉末溶于25ml無(wú)水DMF，以次加入5. 63謹(jǐn)ol 的 Boc-L-苯丙氨酸，5. 63mmol 的 HBTU，5. 63mmol 的 HOBt，5. 63mmol 的 DIPEA，室溫?cái)嚢?12h， 加入冷的無(wú)水乙醚析出沉淀，濾出沉淀，加入IOml無(wú)水DMF溶解中間體，再次加入冷的無(wú)水 乙醚析出沉淀得到粗的中間產(chǎn)物。取中間產(chǎn)物溶于22ml 90%三氟乙酸，室溫?cái)嚢?h，脫去Boc保護(hù)基，加入大量冷 的無(wú)水乙醚析出沉淀，濾出沉淀，加入IOml無(wú)水DMF溶解產(chǎn)物，再次加入冷的無(wú)水乙醚析出 較純凈產(chǎn)物。取產(chǎn)物溶于純水中，轉(zhuǎn)入透析袋4°C透析過(guò)夜，冷凍干燥得到白色粉末狀 PAMAM-Phe 產(chǎn)物。(738mg，產(chǎn)率 47. 6 %，氨基酸修飾度 84. 4% )。1H NMR 光譜(400MHz，D2O) 圖 2，PAMAM-Phe δ 2. 47 (-NCH2CH2CO-Of PAMAM unit, 248Η), 2. 83 (-CONHCH2CH2N-OfPAMAMunit and-NCH2CH2N-of PAMAM unit) , 2. 98 (-CONHCH2CH2NH2 of PAMAM unit), 3. 12 (-NCH2CH2CO- of PAMAM unit and_CHCH2C6H5 of phenylalanine), 3. 36 (-C0NHCH2CH2N-of PAMAM unit and-CONHCH2CH2NHCO-of PAMAM unit)，4. 08(-HCCH2C6H5 of phenylalanine 54H)，7. 27(-HCCH2C6H5 of phenylalanine 270H)。實(shí)施例2、PAMAM氨基酸偶聯(lián)衍生物的初步篩選利用HEK 293細(xì)胞和可以高表達(dá)綠色熒光蛋白的FUGW質(zhì)粒為載體，對(duì)純化得到的 19類(lèi)PAMAM衍生物(表1)的體外基因轉(zhuǎn)運(yùn)能力進(jìn)行初步的鑒定。在96孔板中進(jìn)行篩選， 每孔加FUGW質(zhì)粒0. 1 μ g，PAMAM氨基酸偶聯(lián)衍生物的終濃度為0. 04 μ g/ μ 1，按此比例(N/ P = 40)將FUGW和PAMAM氨基酸偶聯(lián)衍生物加到20 μ 1 PBS中混勻，室溫靜置30min，然后 加入到無(wú)抗性的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 6h，換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24h后在熒光倒置顯 微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸偶聯(lián)衍生物(PAMA-Phe)具有最強(qiáng)的基 因轉(zhuǎn)運(yùn)能力(圖3)。 實(shí)施例3、PAMA-Phe-DNA復(fù)合體的物理化學(xué)性質(zhì)分析進(jìn)行DNA凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，將按不同氮磷比(N/P)形成的PAMA-Phe-DNA復(fù)合體 (PAMA-Phe分子結(jié)構(gòu)式中，η為50 60這一類(lèi))經(jīng)過(guò)1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，觀察 DNA條帶的遷移情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Ν/Ρ > 2時(shí)，DNA在電場(chǎng)中的遷移完全被阻滯，說(shuō)明PAMA-Phe 樹(shù)狀分子與DNA分子形成很?chē)?yán)密的復(fù)合體。進(jìn)一步的，利用動(dòng)態(tài)光散射的技術(shù)測(cè)定復(fù)合體 的粒徑，當(dāng)Ν/Ρ為40時(shí)，形成的復(fù)合體粒徑為233nm，該粒徑大小有利于細(xì)胞的內(nèi)吞作用。實(shí)施例4、PAMA-Phe的體外轉(zhuǎn)染能力測(cè)定
通過(guò)熒光強(qiáng)度定量(圖4)以及熒光素酶報(bào)告基因(luciferase reporter gene) 檢測(cè)(圖5)的方法，測(cè)定在不同N/P比的情況下的體外轉(zhuǎn)染能力，并且對(duì)無(wú)血清和有血清 環(huán)境下的轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行比較。在96孔板中按N/P比為40的比例每孔轉(zhuǎn)染0. Iyg FUGW質(zhì) 粒到HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后四小時(shí)換新鮮完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染后24h，在熒光顯微鏡 下觀察熒光并檢測(cè)熒光強(qiáng)度。類(lèi)似的，在96孔板中按N/P比為40的比例每孔轉(zhuǎn)染0. 05 μ g RSV-Luc質(zhì)粒到HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后四小時(shí)換新鮮完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染后48h，用 熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果顯示PAMA-Phe轉(zhuǎn)染能力與PAMAM相 比顯著增強(qiáng)，而且血清的存在對(duì)其轉(zhuǎn)染效果沒(méi)有明顯的負(fù)作用；
實(shí)施例5、PAMAM-Phe在生物學(xué)研究中的應(yīng)用利用PAMAM-Phe (PAMA-Phe分子結(jié)構(gòu)式中，η為50 60這一類(lèi))來(lái)轉(zhuǎn)染熒光探針 Cy3標(biāo)記的siRNA，轉(zhuǎn)染效率較PAMAM和商業(yè)化的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000明顯要高很 多(圖6)。此外，并用其介導(dǎo)病毒包裝過(guò)程中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，也取得了很好的效果，可以生產(chǎn) 得到滴度很高的逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝，用PAMAM-Phe將pMXs_GFP 質(zhì)粒按N/P40的比例轉(zhuǎn)入Plat-E細(xì)胞；對(duì)于慢病毒的包裝，用PAMAM-Phe將FUGW質(zhì)粒以及 Invitrogen購(gòu)買(mǎi)的Packing Mix(由三種包裝質(zhì)粒混合而成，F(xiàn)UGW與Packing Mix的質(zhì)量 比為1 2)按N/P 40的比例轉(zhuǎn)入Plat-E細(xì)胞。轉(zhuǎn)染四小時(shí)后換完全培養(yǎng)液，分別收集轉(zhuǎn) 染后48h和72h的培養(yǎng)上清，用這兩種上清與新鮮培養(yǎng)基1 1混勻，各感染小鼠3T3-L1 細(xì)胞12h，之后用新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。實(shí)施例6、PAMAM-Phe細(xì)胞毒性測(cè)定在96孔板中鋪HEK 293細(xì)胞，8X IO3個(gè)細(xì)胞/孔，一天后用不同濃度的 PAMAM-Phe (PAMA-Phe分子結(jié)構(gòu)式中，η為50 60這一類(lèi))和PAMAM處理HEK 293細(xì)胞24h， 加入MTT (終濃度lmg/ml) 37°C孵育4h，每孔加150 μ 1 DMS0,測(cè)量570nm的吸光度，結(jié)果表 明(圖7)PAMAM-Phe的細(xì)胞毒性與PAMAM比較顯著降低，而且在其轉(zhuǎn)染應(yīng)用濃度細(xì)胞毒性較小。實(shí)施例7、PAMA-Phe的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染PAMA-Phe (PAMA-Phe分子結(jié)構(gòu)式中，η為50 60這一類(lèi))與FUGW質(zhì)粒按照Ν/Ρ 40的比例形成復(fù)合體，以每克體重注射2μ g質(zhì)粒的劑量注射C57BL/6J小鼠腓腸肌，48h后 取注射區(qū)域冰凍切片，顯微鏡下觀察熒光蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示PAMA-Phe可以較好的介 導(dǎo)小鼠體內(nèi)基因轉(zhuǎn)運(yùn)(圖8)。以上是針對(duì)本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說(shuō)明，但該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的 專(zhuān)利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本案的專(zhuān)利范圍 中。
權(quán)利要求
一種PAMAM的衍生物，其特征是，所述衍生物為苯丙氨酸偶聯(lián)修飾PAMAM樹(shù)狀分子構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)如下其中，n為50～60。FSA00000075306900011.tif
2.權(quán)利要求1所述的PAMAM的衍生物作為轉(zhuǎn)染試劑在生物學(xué)研究中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是，所述生物學(xué)研究中的應(yīng)用為質(zhì)粒DNA和小分 子RNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是，所述應(yīng)用為siRNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是，所述應(yīng)用為用于包裝病毒。
6.一種生物轉(zhuǎn)染試劑，其特征是，其主要成份為苯丙氨酸偶聯(lián)修飾PAMAM樹(shù)狀分子構(gòu)， 分子結(jié)構(gòu)如下 其中，η為50 60。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新型PAMAM的衍生物及其應(yīng)用，所述衍生物為苯丙氨酸偶聯(lián)修飾PAMAM樹(shù)狀分子構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)如下其中，n為50～60。本發(fā)明所述的PAMAM的衍生物作為轉(zhuǎn)染試劑在生物轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用，所述PAMAM-Phe極大地了增強(qiáng)了原始試劑PAMAM的基因轉(zhuǎn)運(yùn)能力，并顯著降低了細(xì)胞毒性，而且其轉(zhuǎn)染能力不受血清存在的影響，無(wú)需轉(zhuǎn)染前換無(wú)血清培養(yǎng)基，極大的簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作的步驟；PAMAM-Phe還可以有效地用于siRNA的轉(zhuǎn)染和基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)染，顯示了其在基因治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101899154SQ20101014228
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日
發(fā)明者丁克, 吳東海, 周毅, 常少華, 楊淑偉, 高學(xué)飛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院