專利名稱：：Pcr結(jié)合核酸探針斑點雜交技術(shù)檢測病料中病毒感染的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交技術(shù)檢測病料中病毒感染，屬于獸醫(yī)微生物學(xué)領(lǐng)域分子生物技術(shù)。
背景技術(shù)：
：目前，在規(guī)模化養(yǎng)禽業(yè)和養(yǎng)豬業(yè)，病毒的多重感染是普遍性的問題，也是臨床發(fā)病的真正原因。但是，對多種病毒的病原學(xué)檢測對養(yǎng)殖場來說是一個困難問題。這是因為，很難對多個個體的不同病料同時做不同病毒的分離培養(yǎng)?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)PCR和核酸探針斑點分子雜交技術(shù)有助于解決這一問題。在一切條件完美時，PCR的靈敏度非常高。但在實際應(yīng)用時，常常出現(xiàn)假陽性和假陰性問題。如，有時PCR產(chǎn)生的DNA條帶雖染大小與預(yù)期的一樣，但測序結(jié)果表明，卻是一種無關(guān)核酸。此外，由于技術(shù)性原因，PCR的可重復(fù)性也較差，特別是其靈敏度的可重復(fù)性較差，常常PCR產(chǎn)物在電泳時看不到核酸條帶。這是因為，PCR產(chǎn)物電泳時，如果加入的DNA量小于50pg，則很難看到條帶。用特異性核酸探針做斑點分子雜交，其特異性較穩(wěn)定，其檢測靈敏度可達(dá)Ipg的同源核酸。但如果病毒感染量小時，在ιμg病料樣品的總DNA中，特異性病毒的核酸可能不足lpg，因而也檢測不出來。如過將PCR和斑點雜交結(jié)合起來，則既能確定PCR產(chǎn)物的特異性，也能提高PCR產(chǎn)物的檢出靈敏度。但如果再結(jié)合斑點雜交，則只要Ipg就可顯現(xiàn)陽性了。而且，電泳顯示的條帶，并不代表是特異的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為克服PCR在實際應(yīng)用時，常常出現(xiàn)假陽性和假陰性問題；用特異性核酸探針做斑點分子雜交，但如果病毒感染量小時，在1μg病料樣品的總DNA中，特異性病毒的核酸可能不足lpg，因而也檢測不出來這些不足，而將PCR和斑點雜交結(jié)合起來，則既能確定PCR產(chǎn)物的特異性，也能提高PCR產(chǎn)物的檢出靈敏度。但如果再結(jié)合斑點雜交，則只要Ipg就可顯現(xiàn)陽性了。先將疑是病毒感染的肉雞樣品DNA用針對可疑病毒的特異性引物PCR擴增后，再對PCR的產(chǎn)物用該病毒的特異性核酸探針做斑點雜交，不僅能顯示PCR產(chǎn)物的特異性，也大大提高了檢出率。發(fā)明的詳細(xì)描述1本發(fā)明主要步驟(1)病料的收集及樣品DNA的制備取因患病引起不同臨床表現(xiàn)的動物、病死動物的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、骨髓等。按常規(guī)方法提取組織DNA，溶解于適量TE緩沖液制備成為樣品DNA。(2)擴增樣品中可疑病毒的特異性核酸片段設(shè)計可疑病毒特異性引物(F2/R2)擴增出樣品DNA可疑病毒特異性核酸片段(樣品PCR擴增的片段大小長于探針)，如圖1所示。用于擴增樣品的引物(F2/R2)必須在探針標(biāo)記用引物(F1/R1)之外，即被標(biāo)記探針DNA序列之外；其擴增的產(chǎn)物長于標(biāo)記探針DNA序列。(3)地高辛PCR法標(biāo)記病毒核酸探針制備及特異性及敏感性的測定利用已知病毒基因組DNA克隆用于標(biāo)記病毒核酸探針。設(shè)計引物(F1/R1)采用地高辛PCR法標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)行地高辛標(biāo)記制備探針，將純化的病毒的特異性DNA片段作為標(biāo)記DNA探針的模板，探針標(biāo)記方法按以上試劑盒操作說明書進(jìn)行。(4)各樣品及其相應(yīng)PCR產(chǎn)物用標(biāo)記的病毒核酸探針進(jìn)行斑點雜交檢測。2本發(fā)明的具體描述(以雞貧血病病毒為例)(1)病料的收集及樣品DNA的制備取疑似雞貧血病病毒(CAV)感染引起不同雞群臨床表現(xiàn)的雞、死雞的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、骨髓等。對組織樣品，各取0.02g研磨，加入0.5mLDNA抽提緩沖液(IOOmmol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl,pH8.0,0.25mmol/LEDTA,ρΗ8.0,0.5%SDS)和終濃度為100yg/mL的蛋白酶K，55°C消化過夜。次日，按常規(guī)方法(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南第二版.科學(xué)出版社，1996)提取組織DNA，溶解于適量TE緩沖液(加適量核糖核酸酶)中，即為樣品DNA。同時提取無特異性病原(SPF)雞相應(yīng)組織的DNA作陰性對照。(2)樣品DNA針對CAV的特異性核酸片段的擴增利用提取的樣品DNA分別用設(shè)計的一對引物CAV-vpl_F2和CAV_vpl-R2擴增出樣品DNA的特異性核酸片段(樣品1-12)，片段長度及引物序列如表1所示，樣品PCR擴增的片段大小長于探針，如圖1所示。表1樣品PCR所用的弓丨物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>(3)地高辛PCR法標(biāo)記病毒核酸探針1)病毒核酸探針的標(biāo)記利用本發(fā)明人保存的雞貧血病毒CAV-vpl基因(李延鵬，崔治中.一株雞傳染性貧血病毒野毒株致病性及全基因組序列比較.微生物學(xué)報，2007年47卷5期)作為CAV特異性探針模板DNA用于標(biāo)記CAV-vpl探針。用Primer5.0軟件設(shè)計一對引物見表1(由上海生物工程公司合成)。采用地高辛PCR法標(biāo)記技術(shù)，用羅氏公司的試劑盒(PCRDIGProbeSynthesisKit,Cat.No.11636090910,VersionDecember2005)進(jìn)行地高辛標(biāo)記制備探針，探針標(biāo)記方法按以上試劑盒操作說明書進(jìn)行。表2=CAV病毒制備核酸探針?biāo)玫囊镄蛄幸锩Q序列片段長度(bp)CAV-vpl-FlGCATTCCGAGTGGTTACTATTCC842CAV-vpl-RlCGTCTTGCCATCTTACAGTCTTAT2)標(biāo)記探針特異性和敏感性的測定取適當(dāng)大小的尼龍膜(羅氏公司)，將上述PCR擴增的探針模板(CAV-vpl基因)DNA片段稀釋成500、50、5、0.5,0.05pg/μL系列濃度，分別取2μL在處理過的尼龍膜上點樣。按照核酸探針標(biāo)記及檢測試劑盒(PCRDIGProbeSynthesisKit,Cat.No.11636090910,VersionDecember2005；DIGNucleicAcidDetectionKit,Cat.No.11175041910，VersionOctober2008)操作說明進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和顯色等步驟，以檢測所制備探針的敏感性。分別取2μLMDV-pp38基因、REV-pol基因和CAV-vpl基因(病毒特異性的DNA)作陰性對照和陽性對照，點于取適當(dāng)大小的尼龍膜上，與變性的核酸探針雜交，加底物顯色，以檢測所制備探針的特異性。PCR法標(biāo)記的核酸探針，均只與自身病毒核酸反應(yīng)顯示棕褐色斑點，而與其它病毒的核酸均不顯顏色，特異性很強(見圖2-1)。每種核酸探針可檢測到Ipg量的特異性核酸片段，具有很高的靈敏度(見圖3-1)。(3)針對CAV病毒樣品的PCR-電泳檢測利用提取的樣品DNA擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖5-1(樣品1_12，并設(shè)分子量大小的標(biāo)志M:2000DL)。(4)各樣品及其相應(yīng)PCR產(chǎn)物用CAV-vpl探針，進(jìn)行斑點雜交檢測將提取的樣品DNA和各樣品的PCR產(chǎn)物分別點在NC膜上，經(jīng)變性、中和、烤膜、預(yù)雜交、雜交、洗膜、堿性磷酸酶標(biāo)記的ELASA檢測后，通過斑點的有無判斷結(jié)果。具體步驟如下(本發(fā)明所用試劑購自羅氏公司PCRDIGProbeSynthesisKit,Cat.No.11636090910和DIGNucleicAcidDetectionKit,Cat.No.11175041910)1)取一張適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜(NC膜，購自羅氏公司)，劃好格子(0.7cmX0.7cm)，做好標(biāo)記。2)把每個提取的樣品DNA分別點到NC膜上。3)NC膜(點樣面朝上)放于已用變性液(0.5mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl)飽和的雙層濾紙上變性lOmin，再放于已用中和液(0.5mol/LTris-Cl，3.0mol/LNaCl,pH7.4)飽和的雙層濾紙上中和5min。4)NC膜室溫干燥30min，然后在80°C干烤2h固定DNA。5)將NC膜放于預(yù)雜交液(5XSSC，0.2%SDS,2%BlockingReagen,)于68°C反應(yīng)2h，期間經(jīng)常搖動NC膜。6)將探針于沸水中變性lOmin，取出后立即置于冰浴中冷卻5min。7)將變性的探針倒入預(yù)雜交液中，充分混勻即成雜交液，使NC膜在其中68°C(溫度可調(diào)整)雜交6h以上。8)將NC膜放于洗液I(2XSSC，0.1%SDS)中室溫洗滌15min，2次。9)將NC膜放于洗液11(0.5XSSC,0.1%SDS)中68V洗洚15min，2次。10)置NC膜于緩沖液1(0.lmol/LTris-Cl,0.15mol/LNaCl,ρΗ7.5)中洗lmin。11)置NC膜于緩沖液II(BufferI中加入2%BlockingReagen)中反應(yīng)30min,再用緩沖液I洗lmin。12)在20ml緩沖液II中加入4μ1抗狄可辛抗體的堿性磷酸酶標(biāo)記物，用之前經(jīng)10000r/min離心5min，)，將膜放于其中37°C浸泡30min。13)用緩沖液I洗滌NC膜；5minX5次。14)置NC膜于緩沖液111(0.lmol/LTris-Cl,0.lmol/LNaCl，0.05mol/LMgCl2,pH9.5)中反應(yīng)浸泡2min。15)在適當(dāng)大小的容器中加入IOml緩沖液III和100μ1顯色液(NBT和BCIP混合物)，將NC膜放入其中顯色一定時間，加入蒸餾水終止顯色反應(yīng)。探針片段的陽性PCR產(chǎn)物、陰性PCR產(chǎn)物和長于探針片段的陽性PCR產(chǎn)物，斑點雜交，尼龍膜上出現(xiàn)了明顯的褐色斑點，斑點雜交呈現(xiàn)陽性結(jié)果。而長于探針片段的陰性PCR產(chǎn)物，尼龍膜上沒有出現(xiàn)任何斑點，斑點雜交呈現(xiàn)陰性結(jié)果，如圖4-1所示。(6)樣品PCR電泳、斑點雜交、PCR產(chǎn)物斑點雜交結(jié)果分別用PCR-電泳、斑點雜交和PCR產(chǎn)物斑點雜交(PCR-斑點雜交)檢測各樣品，檢測結(jié)果見表3。PCR-電泳、斑點雜交和PCR-斑點雜交的部分結(jié)果見圖5-1，圖6-1。經(jīng)PCR-電泳檢測為陰性的某些樣品，樣品DNA直接經(jīng)斑點雜交檢測卻有陽性反應(yīng)；相應(yīng)樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)斑點雜交檢測卻有較強的信號；某些經(jīng)PCR-電泳檢測目的條帶模糊的樣品，相應(yīng)PCR產(chǎn)物經(jīng)斑點雜交檢測卻有很強的信號。這些現(xiàn)象說明，核酸探針斑點雜交方法比PCR-電泳靈敏，運用PCR產(chǎn)物斑點雜交方法會更靈敏，能有效地減少漏檢，充分避免PCR中的假陰性現(xiàn)象。表3=PCR-電泳、斑點雜交PCR-斑點雜交結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>圖1兩對引物位置及擴增片段長度圖2-1CAV探針的靈敏性檢測結(jié)果、2-2MDV-pp38探針的靈敏性檢測結(jié)果、2-3REV-pol探針的靈敏性檢測結(jié)果Al:SPF雞胚組織DNA，BlIng量的探針模板DNA，ClIOOpg量的Ing量的探針模板DNA，D1=IOpg量的探針模板DNA，E1=Ipg量的探針模板DNA，F(xiàn)l0.Ipg量的探針模板DNA。圖3-1CAV探針的特異性檢測結(jié)果Bl=CAV探針模板DNA；Cl=SPF雞胚組織DNA；A2:MDV-pp38基因DNA；B2:REV_pol基因DNA。圖3-2MDV-pp38探針的特異性檢測結(jié)果Al:MD_pp38探針DNA；Bl=SPF雞胚組織DNA-M:CAV-vp3DNA；B2:REV_polDNA。圖3-3REV-pol探針的特異性檢測結(jié)果Al=SPF雞胚組織DNA；Bl:REV_pol探針模板DNA；Cl:MD-pp38DNA；Dl:CAV_vp3DNA。圖4-lCAV_vp3兩段片段的斑點雜交結(jié)果Al探針外片段陽性PCR產(chǎn)物；Bl探針外片段陰性PCR產(chǎn)物；Cl探針陽性PCR產(chǎn)物；Dl探針陰性PCR產(chǎn)物。圖4-2:MD-pp38兩段片段的斑點雜交結(jié)果Al探針陰性PCR產(chǎn)物，Bl探針陽性PCR產(chǎn)物，Cl探針外片段陰性PCR產(chǎn)物，Dl探針外片段陽性PCR產(chǎn)物。圖4-3:REV-pol兩段片段的斑點雜交結(jié)果Al=SPF雞胚組織DNA；Bl長于探針片段DNA；Cl長于探針片段陰性PCR產(chǎn)物；Dl探針片段DNA；El探針片段陰性PCR產(chǎn)物圖5-1部分樣品的CAV-vpl基因的PCR-電泳結(jié)果M:2000DL；1-12樣品PCR產(chǎn)物結(jié)果。圖5-2部分樣品的MDV1-PPSS基因的PCR-電泳結(jié)果M:2000DL；A陽性對照；1-7樣品PCR產(chǎn)物結(jié)果。圖5-3部分樣品的REV-pol基因的PCR-電泳結(jié)果M:2000DL；A陰性對照；B陽性對照；1-7樣品PCR產(chǎn)物結(jié)果。圖6-1部分樣品DNA和樣品PCR產(chǎn)物斑點雜交結(jié)果Al雙蒸水；Bl:SPF雞胚組織DNA；Cl=TEbuffer；D1/F1空白對照；El=CAV探針模板DNA；A2-F2/A4-F4樣品DNA直接斑點雜交結(jié)果；A3-F3/A5-F5相應(yīng)樣品PCR產(chǎn)物斑點雜交結(jié)果。圖6-2部分樣品DNA和樣品PCR產(chǎn)物斑點雜交結(jié)果Al雙蒸水；1:SPF雞胚組織DNA；Cl馬立克腫瘤組織DNA；Dl探針模板DNA；A2-D3樣品DNA直接斑點雜交結(jié)果；F3-I4樣品PCR產(chǎn)物斑點雜交結(jié)果。圖6-3部分樣品DNA和樣品PCR產(chǎn)物斑點雜交結(jié)果Al雙蒸水，Bl=SPF雞胚組織DNA,Cl:REV探針模板DNA，D1/C4空白對照，E1-B4樣品DNA直接斑點雜交結(jié)果，D4-H6相應(yīng)樣品PCR產(chǎn)物斑點雜交結(jié)果。本發(fā)明的積極意義在于本發(fā)明涉及一種PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法。本發(fā)明將疑是CAV感染的肉雞樣品DNA用特異性引物通過PCR擴增后，對PCR產(chǎn)物再用特異性核酸探針做斑點雜交，不僅能顯示PCR產(chǎn)物的特異性，也大大提高了檢出率。在22個樣品的PCR產(chǎn)物電泳后，只有7個呈現(xiàn)相應(yīng)大小的DNA條帶，其余15個樣品則不現(xiàn)條帶。但是，對PCR產(chǎn)物再用CAV特異性核酸探針做斑點雜交后，全部顯現(xiàn)陽性。結(jié)果表明，PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交技術(shù)檢測病料中病毒感染，可顯著提高病毒感染檢測的靈敏度和特異性。實施例本發(fā)明提供的實施例為進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但這些實施例不構(gòu)成對本發(fā)明作出限制。實施例1PCR結(jié)合斑點雜交技術(shù)檢測自然發(fā)病雞群中MDV的感染(以I型雞馬立克氏病病毒為例)。1病料的收集及樣品DNA的制備取疑似雞I型馬立克氏病病毒(MDV)感染引起不同雞群臨床表現(xiàn)的雞、死雞的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、骨髓等。對組織樣品，各取0.02g研磨，加入0.5mLDNA抽提緩沖液(IOOmmol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl,pH8.0,0.25mmol/LEDTA，pH8.0,0.5%SDS)禾口終濃度為100yg/mL的蛋白酶K，55°C消化過夜。次日，按常規(guī)方法(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南第二版.科學(xué)出版社，1996)提取組織DNA，溶解于適量TE緩沖液(加適量核糖核酸酶)中，即為樣品DNA。同時提取無特異性病原(SPF)雞相應(yīng)組織的DNA作陰性對照。2樣品DNA針對MDV特異性核酸片段的擴增利用提取的樣品DNA分別用設(shè)計的一對引物MDV-pp38-F2和MDV-pp38_R2擴增出樣品DNA特異性核酸片段(樣品1-7)，片段長度及引物序列如表4所示，樣品PCR擴增的片段大小長于探針，如圖1所示。表4樣品PCR所用的引物序列引物名稱序列片段長度(bp)MDV-pp38^F2C^GGCATGGGAAAACAGA__________722MDV-pp38-R2CACTCCCCCAACGACAATG3地高辛PCR法標(biāo)記病毒核酸探針(1)病毒核酸探針的標(biāo)記利用MDVpp38基因克隆質(zhì)粒(姜世金，丁家波，孟珊珊等.型馬立克氏病病毒PP38和pp24基的真核表達(dá).中國病毒學(xué)，2005年20卷4期)，大小為981bp用于標(biāo)記MDV-pp38探針。用Primer5.0軟件設(shè)計一對引物見表5(由上海生物工程公司合成)。采用地高辛PCR法標(biāo)記技術(shù)，用羅氏公司的試劑盒進(jìn)行地高辛標(biāo)記制備探針，探針標(biāo)記方法按試劑盒操作說明進(jìn)行。表5=MD病毒制備核酸探針?biāo)玫囊镄蛄?lt;table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)標(biāo)記探針特異性和敏感性的測定取適當(dāng)大小的尼龍膜(羅氏公司)，將上述PCR擴增的探針模板(MDV-pp38基因)DNA片段稀釋成500、50、5、0.5,0.05pg/μL系列濃度，分別取2μL在處理過的尼龍膜上點樣。按照核酸探針標(biāo)記及檢測試劑盒操作說明進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和顯色等步驟，以檢測所制備探針的敏感性。分別取2μLCAV-vp基因l、REV_pol基因、和MDV_pp38基因(病毒特異性的DNA)點于取適當(dāng)大小的尼龍膜上，與變性的核酸探針雜交，加底物顯色，以檢測所制備探針的特異性。PCR法標(biāo)記的核酸探針，均只與自身病毒核酸反應(yīng)顯示棕褐色斑點，而與其它病毒的核酸均不顯顏色，特異性很強(見圖2-2)。每種核酸探針可檢測到Ipg量的特異性核酸片段，具有很高的靈敏度(見圖3-2)。(3)針對MDV樣品的PCR-電泳檢測利用提取的樣品DNA擴增產(chǎn)物(樣品1-7)，并設(shè)M:2000DL和陽性對照(MDV_pp38基因DNA片段)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖5-2。(4)各樣品及其相應(yīng)PCR產(chǎn)物用MD-pp38探針，進(jìn)行斑點雜交檢測將提取的樣品DNA和各樣品的PCR產(chǎn)物分別點在NC膜上，經(jīng)變性、中和、烤膜、預(yù)雜交、雜交、洗膜、免疫學(xué)檢測后，通過斑點的有無判斷結(jié)果。探針片段的陽性PCR產(chǎn)物、陰性PCR產(chǎn)物和長于探針片段的陽性PCR產(chǎn)物，斑點雜交，尼龍膜上出現(xiàn)了明顯的褐色斑點，斑點雜交呈現(xiàn)陽性結(jié)果。而長于探針片段的陰性PCR產(chǎn)物，尼龍膜上沒有出現(xiàn)任何斑點，斑點雜交呈現(xiàn)陰性結(jié)果，如圖4-2所示。(5)樣品PCR電泳、斑點雜交、PCR產(chǎn)物斑點雜交結(jié)果分別用PCR-電泳、斑點雜交和PCR產(chǎn)物斑點雜交(PCR-斑點雜交)檢測各樣品，檢測結(jié)果見表3。PCR-電泳、斑點雜交和PCR-斑點雜交的部分結(jié)果見圖5-2，圖6_2。經(jīng)PCR-電泳檢測為陰性的某些樣品，樣品DNA直接經(jīng)斑點雜交檢測卻有陽性反應(yīng)；相應(yīng)樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)斑點雜交檢測卻有較強的信號；某些經(jīng)PCR-電泳檢測目的條帶模糊的樣品，相應(yīng)PCR產(chǎn)物經(jīng)斑點雜交檢測卻有很強的信號。這些現(xiàn)象說明，核酸探針斑點雜交方法比PCR-電泳靈敏，運用PCR產(chǎn)物斑點雜交方法會更靈敏，能有效地減少漏檢，充分避免PCR中的假陰性現(xiàn)象。PCR-電泳和斑點雜交和PCR-斑點雜交比較結(jié)果見表6。表6MDVJCR-電泳、斑點雜交PCR-斑點雜交結(jié)果比較—~PCR-電泳斑點雜交+-+-PCR產(chǎn)物斑點雜交+6211413實施例2PCR結(jié)合斑點雜交技術(shù)檢測自然發(fā)病雞群中REV病毒的感染1病料的收集及樣品DNA的制備取疑似禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒(REV)感染引起不同雞群臨床表現(xiàn)的雞、死雞的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、骨髓等。對組織樣品，各取0.02g研磨，加入0.5mLDNA抽提緩沖液(IOOmmol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl,pH8.0,0.25mmol/LEDTA，pH8.0,0.5%SDS)禾口終濃度為100yg/mL的蛋白酶K，55°C消化過夜。次日，按常規(guī)方法(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南第二版.科學(xué)出版社，1996)提取組織DNA，溶解于適量TE緩沖液(加適量核糖核酸酶)中，即為樣品DNA。同時提取無特異性病原(SPF)雞相應(yīng)組織的DNA作陰性對照。2樣品DNA針對REV特異性核酸片段的擴增利用提取的樣品DNA分別用設(shè)計的一對引物REV-pol-F2和REV-pol_R2擴增出樣品DNA特異性核酸片段(樣品1-7)，片段長度及引物序列如表7所示，樣品PCR擴增的片段大小長于探針，如圖1所示。表7樣品PCR所用的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3地高辛PCR法標(biāo)記病毒核酸探針(1)病毒核酸探針的標(biāo)記利用本發(fā)明人保存的REV-pol(王玉，崔治中，姜世金.網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒中國分離株HA9901全基因組核苷酸序列的測定與分析，中國科學(xué)，C輯，2005，351-9)，基因大小為3482bp，用于標(biāo)記REV-pol探針。用Primer5.0軟件設(shè)計一對引物見表8(由上海生工合成)。采用地高辛PCR法標(biāo)記技術(shù)，用羅氏公司的試劑盒進(jìn)行地高辛標(biāo)記制備探針，作為標(biāo)記DNA探針的模板，探針標(biāo)記方法按試劑盒操作說明進(jìn)行。表8:REV病毒制備核酸探針?biāo)玫囊镄蛄?lt;table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2)標(biāo)記探針特異性和敏感性的測定取適當(dāng)大小的尼龍膜(羅氏公司)，將上述PCR擴增的探針模板(REV-pol基因)DNA片段稀釋成500、50、5、0.5,0.05pg/μL系列濃度，分別取2μL在處理過的尼龍膜上點樣。按照核酸探針標(biāo)記及檢測試劑盒操作說明進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和顯色等步驟，以檢測所制備探針的敏感性。分別取2μLCAV-vpl、MDV-pp38和REV-pol探針模板DNA點于取適當(dāng)大小的尼龍膜上，與變性的核酸探針雜交，加底物顯色，以檢測所制備探針的特異性。PCR法標(biāo)記的核酸探針，均只與自身病毒核酸反應(yīng)顯示棕褐色斑點，而與其它病毒的核酸均不顯顏色，特異性很強(見圖2-3)。每種核酸探針可檢測到Ipg量的特異性核酸片段，具有很高的靈敏度(見圖3-3)。(3)針對REV樣品的PCR-電泳檢測利用提取的樣品DNA分別擴增REV特異性核酸片段(樣品1_7)，并設(shè)M:2000DL、陰性對照(SPF雞相應(yīng)組織的DNA作為模板的PCR產(chǎn)物)和陽性對照(用已知REV-pol基因為模板的PCR產(chǎn)物)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖5-3。(4)各樣品及其相應(yīng)PCR產(chǎn)物用REV-pol探針，進(jìn)行斑點雜交檢測將提取的樣品DNA和各樣品的PCR產(chǎn)物分別點在NC膜上，經(jīng)變性、中和、烤膜、預(yù)雜交、雜交、洗膜、免疫學(xué)檢測后，通過斑點的有無判斷結(jié)果。探針片段的陽性PCR產(chǎn)物、陰性PCR產(chǎn)物和長于探針片段的陽性PCR產(chǎn)物，斑點雜交，尼龍膜上出現(xiàn)了明顯的褐色斑點，斑點雜交呈現(xiàn)陽性結(jié)果。而長于探針片段的陰性PCR產(chǎn)物，尼龍膜上沒有出現(xiàn)任何斑點，斑點雜交呈現(xiàn)陰性結(jié)果，如圖4-3所示。(5)樣品PCR電泳、斑點雜交、PCR產(chǎn)物斑點雜交結(jié)果分別用PCR-電泳、斑點雜交和PCR產(chǎn)物斑點雜交(PCR-斑點雜交)檢測各樣品，檢測結(jié)果見表9。PCR-電泳、斑點雜交和PCR-斑點雜交的部分結(jié)果見圖5-3，圖6_3。經(jīng)PCR-電泳檢測為陰性的某些樣品，樣品DNA直接經(jīng)斑點雜交檢測卻有陽性反應(yīng)；相應(yīng)樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)斑點雜交檢測卻有較強的信號；某些經(jīng)PCR-電泳檢測目的條帶模糊的樣品，相應(yīng)PCR產(chǎn)物經(jīng)斑點雜交檢測卻有很強的信號。這些現(xiàn)象說明，核酸探針斑點雜交方法比PCR-電泳靈敏，運用PCR產(chǎn)物斑點雜交方法會更靈敏，能有效地減少漏檢，充分避免PCR中的假陰性現(xiàn)象。PCR-電泳和斑點雜交和PCR-斑點雜交比較結(jié)果見表9。表9:REVPCR-電泳、斑點雜交PCR-斑點雜交結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求一種PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法，其特征在于先將疑是病毒感染的動物組織樣品DNA用針對可疑病毒的特異性引物PCR擴增后，再對PCR的產(chǎn)物用該病毒的特異性核酸探針做斑點雜交。2.如權(quán)利要求1所述的一種PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法，其特征在于本發(fā)明在利用PCR技術(shù)結(jié)合斑點雜交檢測樣品時，用于擴增樣品DNA的引物F2/R2必須在探針標(biāo)記用引物F1/R1之外，也就是在被標(biāo)記核酸探針DNA序列之外。3.如權(quán)利要求1、2所述的一種PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法，其特征在于檢測禽貧血病毒的探針標(biāo)記的引物CAV-vpl-Fl/CAV-vpl-Rl為序列1/序列2，擴增樣品的引物CAV-vpl-F2/CAV-vpl-R2為序列4/序列5。4.如權(quán)利要求1、2所述的一種PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法，其特征在于檢測I型馬立克氏病病毒的探針標(biāo)記的引物MDV-pp38-Fl/MDV-pp38-Rl為序列6/序列7，擴增樣品的引物MDV-vpl-F2/MDV-pp38-R2為序列9/序列10。5.如權(quán)利要求1、2所述的一種PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法，其特征在于檢測禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒的探針標(biāo)記的引物REV-pol-Fl/REV-pol-Rl為序列11/序列12，擴增樣品的引物REV-pol-F2/REV-pol-R2為序列14/序列15。全文摘要本發(fā)明涉及一種PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法。本發(fā)明將疑是病毒感染的動物組織樣品DNA用針對可疑病毒的特異性引物PCR擴增后，對PCR產(chǎn)物再用該病毒特異性核酸探針做斑點雜交，不僅能顯示PCR產(chǎn)物的特異性，也大大提高了檢出率。本發(fā)明試驗結(jié)果表明，PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交技術(shù)檢測病料中病毒感染，可顯著提高病毒感染檢測的靈敏度和特異性。文檔編號C12Q1/68GK101824487SQ20101014226公開日2010年9月8日申請日期2010年4月9日優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日發(fā)明者崔治中申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)