專(zhuān)利名稱(chēng)：一種消除水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛭弧菌，特別涉及一種消除水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌的蛭 弧菌菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，世界各地相繼發(fā)生重大的食品安全事件，不僅帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損 失，還是對(duì)社會(huì)穩(wěn)定和安全的考驗(yàn)，使得食品安全問(wèn)題成為人們?nèi)找骊P(guān)注的問(wèn) 題。對(duì)此，世界各國(guó)和組織都設(shè)定了多種食品安全相關(guān)的法律法規(guī)，以達(dá)到預(yù) 防和控制食品安全問(wèn)題的目的。微生物是污染食品的重要因素之一，由于其個(gè) 體微小、分布廣泛、生存能力強(qiáng)、繁殖迅速等特點(diǎn)，使得如何避免和減少微生 物污染成為食品加工和流通等環(huán)節(jié)考慮的首要問(wèn)題。
養(yǎng)殖病害一直是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的瓶頸之一，僅2004年我國(guó) 監(jiān)測(cè)到的水產(chǎn)病害損失就達(dá)151億元。抗生素及化學(xué)消毒藥物的濫用又使養(yǎng)殖 經(jīng)濟(jì)動(dòng)物抗病能力明顯下降，既不利于養(yǎng)殖動(dòng)物的健康生長(zhǎng)，也不符合健康養(yǎng) 殖理念及可持續(xù)發(fā)展的需要。隨著對(duì)水產(chǎn)品安全要求的提高和對(duì)耐藥菌株危害 的重視，符合環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展的生態(tài)防治技術(shù)則是當(dāng)前和今后水產(chǎn)養(yǎng)殖 病害最有希望的發(fā)展方向之一，而微生物則在其中扮演著最重要的角色。但是， 一些微生態(tài)制劑在應(yīng)對(duì)水生動(dòng)物疾病防治方面還是存在諸多缺陷，而噬菌蛭弧 菌具有獨(dú)特的裂解細(xì)菌的生物學(xué)特性，為水生動(dòng)物的疾病防治開(kāi)辟了新的途徑， 一種綠色、環(huán)保、健康的天然"抗生素"正逐漸走進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。如能在水產(chǎn) 品在養(yǎng)殖期間、運(yùn)輸過(guò)程或食用、加工前，先進(jìn)行致病菌的生物消除工作，則 一方面可以減少或消除食物中毒的機(jī)率，減少或消除藥物殘留的可能，提高產(chǎn) 品質(zhì)量安全系數(shù)，保護(hù)消費(fèi)者的健康，另一方面也可為水產(chǎn)品的加工提供優(yōu)質(zhì) 原材料和加工上的便利，為出口創(chuàng)匯提供強(qiáng)有力的保障。
水產(chǎn)養(yǎng)殖中可引起水產(chǎn)品病害的革蘭氏陽(yáng)性菌主要包括能引發(fā)分枝桿菌病 的分枝桿菌(Myco^jrcten'Mwsp.)、引發(fā)諾卡氏菌病的諾卡氏菌(M ajr^a sp.)、 引發(fā)鏈球菌病的鏈球菌(&^ptococc^sp.)、引發(fā)葡萄球菌病的表皮葡萄球菌(5^ap/y;/ococcws ep/cfenrnVZ/s )、弓I發(fā)梭菌'性腸炎的梭菌(C7oWnW/wwi sp.)、 導(dǎo)致水體養(yǎng)殖環(huán)境發(fā)生變化而影響?zhàn)B殖對(duì)象的健康狀況的紅球菌 (i /zo(iococcws sp.)禾口弓l發(fā)棒狀桿菌病的棒狀桿菌(C。7"eZ acteWwm sp.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種消除水產(chǎn)品 革蘭氏陽(yáng)性致病菌的蛭弧菌菌株。
本發(fā)明的另一 目的在于提供所述蛭弧菌菌株的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種消除水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌 的蛭弧菌菌株，名稱(chēng)為蛭弧菌(^fe//ovAWo sp.) BDS02，于2009年8月7日 保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M209170;
對(duì)所述蛭弧菌BDS02進(jìn)行負(fù)染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察(見(jiàn)圖1): BDS02呈單細(xì)胞，弧形，大小為0.65x0.2^im，端生鞭毛，鞭毛長(zhǎng)度至少1.8hiti; 所述蛭弧菌BDS02以雙層平板法于28"C培養(yǎng)四天可形成直徑l-2mm的透明圓 形噬菌斑；
蛭弧菌BDS02的16S-ITS rDNA序列如下(序列表SEQ ID NO.l所示)一種消除水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌的微生物制劑，含有所述的蛭弧菌 BDS02;
所述的微生物制劑還含有蛭弧菌(^M/ov^n'osp.) BDS01;
所述蛭弧菌BDS01于2009年8月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏編號(hào)為CCTCCNO: M209169;將所述蛭弧菌BDS01進(jìn)行負(fù)染后于電子顯 微鏡下形態(tài)觀察BDS01呈單細(xì)胞，弧形，大小為0.9x0.25pm，端生鞭毛，鞭 毛長(zhǎng)度為4 jim;所述蛭弧菌BDSOl以雙層平板法于28'C培養(yǎng)四天可形成直徑 l-2mm的透明圓形噬菌斑；
所述的蛭弧菌BDS02優(yōu)選通過(guò)申請(qǐng)?zhí)?200710031166.X",名稱(chēng)為"高密 度蛭弧菌游泳體的發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)"國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)的高密度蛭弧菌游泳 體的發(fā)酵方法進(jìn)行發(fā)酵；
所述蛭弧菌BDS01優(yōu)選通過(guò)申請(qǐng)?zhí)?200710031166.X"，名稱(chēng)為"高密度 蛭弧菌游泳體的發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)"國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)的高密度蛭弧菌游泳體 的發(fā)酵方法進(jìn)行發(fā)酵；所述的蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDS01優(yōu)選按細(xì)菌數(shù)1:1混合； 所述微生物制劑應(yīng)用于消除水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌； 所述水產(chǎn)品優(yōu)選淡水產(chǎn)品；
所述水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌包括結(jié)核分枝桿菌(Jl^co6acfer^m ^ercw/as7'51)、星狀諾卡氏菌(M c"Wa 、紅串紅球菌(i /wdococcMS
e/j^ojoo/^ )、糞鏈球菌(ASW/ tococcws々ec"http://51)、表皮葡萄球菌(S鄉(xiāng)/ y/ococcws 、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C7o血鄉(xiāng)w / e^/h'"gms)禾口谷氨酸棒狀桿菌 (Gofywe6acfer/^m w^zm/c/zm );
所述微生物制劑應(yīng)用于消除食用或加工前水產(chǎn)品攜帶的革蘭氏陽(yáng)性致病 菌，應(yīng)用時(shí)蛭弧菌最佳濃度范圍為104 108pfu/mL;
所述微生物制劑應(yīng)用于控制水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌，應(yīng)用 時(shí)蛭弧菌最佳濃度范圍為103 106pfb/mL;
所述微生物制劑應(yīng)用于控制水產(chǎn)品養(yǎng)殖水體中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌，應(yīng)用 時(shí)蛭弧菌最佳濃度范圍則為102 105pfWmL;
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果
1、 本發(fā)明所述的微生物制劑在消除水產(chǎn)品攜帶的革蘭氏陽(yáng)性致病菌的應(yīng) 用效果顯著。
本發(fā)明所述的微生物制劑在消除水產(chǎn)品食用或加工前、運(yùn)輸過(guò)程及其養(yǎng)殖 水體中革蘭氏陽(yáng)性致病菌的應(yīng)用效果顯著，以羅非魚(yú)、南美白對(duì)蝦、河蜆、大
閘蟹例，如圖2 13所示，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性致病菌均有較高的消除率，消除率均 達(dá)90%以上。
2、 在食用前用蛭弧菌消除水產(chǎn)品中致病性革蘭氏陽(yáng)性菌安全性好 蛭弧菌消除水產(chǎn)品中革蘭氏陽(yáng)性致病菌方法是生物的方法，蛭弧菌可侵
染、裂解宿主細(xì)菌的特性使之適合作為抑止或清除生物體及其環(huán)境中致病菌的 生物凈化因子，且其在裂解完宿主細(xì)菌后，會(huì)因饑餓而自動(dòng)消亡，因此對(duì)人和 動(dòng)物無(wú)毒副作用。不僅可提高消費(fèi)者生食水產(chǎn)品的安全系數(shù)，保護(hù)消費(fèi)者的健 康，也為水產(chǎn)品的綠色加工生產(chǎn)提供保障。
3、 將本發(fā)明應(yīng)用于水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中，方便、安全且效果好 水產(chǎn)品在運(yùn)輸過(guò)程中采用蛭弧菌來(lái)控制革蘭氏陽(yáng)性致病菌可防止水質(zhì)惡
化、提高水產(chǎn)品存活率，同時(shí)避免使用抗生素，確保水產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)。
4、 本發(fā)明適合推廣應(yīng)用于水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過(guò)程在養(yǎng)殖期間即進(jìn)行致病菌的消除工作，特別有利于減少或消除化學(xué)藥物如 抗生素的使用和殘留，確保水產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)，以羅非魚(yú)、南美白對(duì)蝦、河蜆、大
閘蟹養(yǎng)殖為例，2株蛭弧菌混合得到的微生物制劑使用時(shí)對(duì)淡水魚(yú)蝦貝蟹養(yǎng)殖 水體中革蘭氏陽(yáng)性致病菌的消除試驗(yàn)的效果如圖13所示，養(yǎng)殖水體中致病菌的 數(shù)量，可控制在100cfli/mL以?xún)?nèi)。
5、本發(fā)明為消除水產(chǎn)品所攜帶的致病菌提供一種新的方法并可適用于水 產(chǎn)品養(yǎng)殖到食用前的全過(guò)程中，有效地減少或消除化學(xué)藥物如抗生素的殘留， 確保水產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)，從根本上避免水產(chǎn)品食物中毒事件的發(fā)生，為出口創(chuàng)匯提 供強(qiáng)有力的保障。


圖1是蛭弧菌BDS02于電鏡下觀察的形態(tài)圖。
圖2是只含BDS02的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品食用前的革蘭氏陽(yáng)性致 病菌產(chǎn)氣莢膜梭菌的效果圖。
圖3是只含BDS02的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品食用前的革蘭氏陽(yáng)性致 病菌紅串紅球菌的效果圖。
圖4是只含BDS02的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品食用前的革蘭氏陽(yáng)性致 病菌谷氨酸棒狀桿菌的效果圖。
圖5是由BDS01和BDS02組成的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品食用前的革 蘭氏陽(yáng)性致病菌的效果圖。
圖6是只含BDS02的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng) 性致病菌產(chǎn)氣莢膜梭菌的效果圖。
圖7是只含BDS02的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng) 性致病菌紅串紅球菌的效果圖。
圖8是只含BDS02的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng) 性致病菌谷氨酸棒狀桿菌的效果圖。
圖9是由BDS01和BDS02組成的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中 的革蘭氏陽(yáng)性致病菌的效果圖。
圖10是只含BDS02微生物制劑用于消除水產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng)性 致病菌產(chǎn)氣莢膜梭菌的效果圖。
圖11是只含BDS02微生物制劑用于消除水產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌紅串紅球菌的效果圖。
圖12是只含BDS02微生物制劑用于消除水產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng)性 致病菌谷氨酸棒狀桿菌的效果圖。
圖13是由BDS01和BDS02組成的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程中 的革蘭氏陽(yáng)性致病菌的效果圖。
圖14是由BDS01和BDS02組成的微生物制劑用于消除淡水產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程 中的致病菌的效果圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式 不限于此。
實(shí)施例1 (1)蛭弧菌BDS02的分離純化
將宿主嗜水氣單胞菌Ueramowos/^Ao; /k7"，購(gòu)于廣東省微生物所菌種保 藏中心，編號(hào)GIM1.172)接種于含100mL滅菌LB (Luria-Bertani)液體培養(yǎng) 基(蛋白胨10g，酵母膏5g，蒸餾水lOOOmL， pH 7.2)的三角瓶中，置于轉(zhuǎn) 速為200rpm，溫度為28°C的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。培養(yǎng) 液在4。C溫度條件下，以6000rpm速度離心20min，棄去上清液，沉淀下來(lái)的 菌體用lmL DNB (dilute nutrient broth)液體培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g，酪蛋白酸 水解物0.5g，酵母精提物O.lg，溶于1000mL蒸餾水中，pH值為7.2 7.6)重 新懸浮后(濃度約為3xl0^fWmL)置于4。C冰箱，待用。
對(duì)采集的泥樣進(jìn)行預(yù)處理，取泥樣約3g加入到含50mL滅菌DNB液體培 養(yǎng)基的三角瓶中，同時(shí)加入已制備好的增殖蛭弧菌的嗜水氣單胞菌菌懸液 0.5mL，將三角瓶置于轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為28°C的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)36h，培 養(yǎng)液先在4°C條件下，1500rpm離心15min離心去泥渣，后6000rpm離心20min 去宿主，上清液再在4。C溫度條件下，以16000rpm速度離心20min，棄去上清 液，沉淀物用lmLDNB液體培養(yǎng)基重新懸浮，成為樣品濃縮液。
采用雙層平板法:取0.5mL樣品濃縮液和0.5mL嗜水氣單胞菌懸浮液混合， 此混合液再與3 3.5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水1000mL， pH7.2， 瓊脂粉7g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g，酪蛋白酸水 解物0.5g，酵母精提物O.lg，蒸餾水1000mL， pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。
9將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12h觀測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。待含宿主菌 的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑，挑取不斷擴(kuò)大的單斑，加入到含有50mLDNB 液體培養(yǎng)基的三角瓶中懸浮，同時(shí)加入相應(yīng)的宿主菌濃縮液，置于轉(zhuǎn)速為 200rpm，溫度為28°C的恒溫?fù)u床中連續(xù)培養(yǎng)30h。然后，培養(yǎng)液在4°C溫度條 件下，以6000rpm的速度離心20min，上清液在4。C溫度條件下，再以16000rpm 的速度離心20min，傾倒雙層瓊脂平板檢驗(yàn)，再次挑取不斷擴(kuò)大的單斑，并重 復(fù)若干次，至單噬菌斑傳代形成形狀、大小、透明均一致的噬菌斑即為一株蛭 弧菌純菌株。挑選形狀規(guī)則、透明且噬菌斑最大的噬菌斑，命名為蛭弧菌 BDS02。將其進(jìn)行負(fù)染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察(圖1):蛭弧菌呈單細(xì)胞， 弧形，大小為0.65x0.2^im，端生鞭毛，鞭毛長(zhǎng)度至少1.8pm;所述蛭弧菌 (^fe〃ov沾n'o sp.) BDS02以雙層平板法于28'C培養(yǎng)四天可形成直徑1 2mm 的透明圓形噬菌斑。根據(jù)伯杰氏手冊(cè)(Bergey， sManual)對(duì)蛭弧菌的描述蛭 弧菌是寄生于其他細(xì)菌上的細(xì)菌，在寄生階段、細(xì)胞呈單個(gè)、小、彎曲、運(yùn)動(dòng) 的桿狀，極生鞭毛運(yùn)動(dòng)，鞭毛有鞘。由此可以確認(rèn)，分離得到的蛭弧菌BDS02 為5A//ovz7^o sp.。應(yīng)用DNA純化試劑盒提取蛭弧菌BDS02的基因組DNA， 擴(kuò)增其16SrDNA。通過(guò)測(cè)序和拼接后(見(jiàn)序列表SEQ ID NO.l)在GenBank 中進(jìn)行同源性搜索，比對(duì)結(jié)果顯示蛭弧菌BDS02的16S-ITS rDNA與其他已經(jīng) 公開(kāi)的蛭弧菌16SrDNA序列相似度高，但不完全相同，說(shuō)明蛭弧菌BDS02是 首次分離得到。所述蛭弧菌BDS02于2009年8月7日在位于中國(guó)武漢市武漢 大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M209170。 (2)消除水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌的微生物制劑的制備 蛭弧菌菌液通過(guò)申請(qǐng)?zhí)?200710031166.X"的國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)的高 密度蛭弧菌游泳體的發(fā)酵方法進(jìn)行發(fā)酵分別在2個(gè)裝有100mLLB (蛋白胨 10g，酵母膏5g，蒸餾水1000mL， pH7.2)液體培養(yǎng)基的錐形瓶中接種嗜水氣 單胞菌(An mo打cw /^&op/w7a，購(gòu)于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號(hào) GIM1.172) ， 250rpm、 30。C搖床培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)液分別于4'C、 6000rpm離 心15min，棄上清。分別將沉淀加入到2個(gè)裝有100mLDNB液體培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng) 肉湯0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000mL蒸餾水中， pH值為7.2 7.6)的錐形瓶中，同時(shí)再分別從雙層平板上挑取蛭弧菌BDS02 和蛭弧菌BDS01 (于2009年8月7日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M209169)的噬菌斑至已加入嗜水氣單胞菌的DNB液體培養(yǎng)基中。恒溫?fù)u床200rpm、 3(TC培養(yǎng)24h。培養(yǎng)液分 別于4°C 6000rpm離心20min，取上清液，再將上清液分別于4°C 16000rpm離 心20min，保留沉淀，加入DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌沉淀物，使蛭弧 菌BDS02菌液和蛭弧菌BDSOl菌液的濃度分別為101QpfU/mL。
微生物制劑為由蛭弧菌數(shù)為101Qpfii/mL的蛭弧菌BDS02菌液組成。 (3)將微生物制劑用于消除水產(chǎn)品食用前的革蘭氏陽(yáng)性致病菌
① 、制備水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌液
產(chǎn)氣莢膜梭菌(C7o欲W^m; ^/h'wgmsATCC13124，購(gòu)于廣東省微生物菌 種保藏中心)，用強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(酵母膏3g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，可 溶性淀粉lg，葡萄糖5g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g， NaC13g， NaAc 3g，蒸餾 水1000mL， pH8.5),厭氧條件下28。C培養(yǎng)24h。紅串紅球菌(及/w必coccws eo^ra/ o/&ATCC4277，購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心)，用ATYP培養(yǎng) 基(KH2P04lg， CaCl20.1g， NaHC033g，乙酸鈉lg， MgCl2 0.5g， NH4Cl lg， NaCl lg，微量元素溶液lmL，維生素溶液lmL，琥珀酸鈉lg，酵母提取物0.5g， 蛋白胨0.5g，蒸餾水1000mL; pH6.8;微量元素配方為FeCl2*4H20 1.8g， CoCl2.6H20 0.25g， NiCl2.6H2O0.01g， CuCl2-2H20 O.Olg， MnCl2 4H20 0.7g， ZnCl20.1g， H3BO30.5g， NaMo042H20 0.03g， Na2Se03'5H20 O.Olg，蒸餾水 lOOOmL;維生素溶液配方為生物素0.1g，煙酸0.35g，鹽酸硫胺素0.3g，對(duì) 氨基苯甲酸0.28，鹽酸吡多胺0.1g，泛酸鈣0.1g，維生素Bu0.05g，蒸餾水 lOOOmL)搖床培養(yǎng)，3CTC160rpm培養(yǎng)48h。谷氨酸棒狀桿菌(C07"e6ac^^附 g/"tow/c/^2 ATCC13032，購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心)用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培 養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL， pH7.4)搖床培 養(yǎng)，28。C160rpm培養(yǎng)24h。上述各菌的培養(yǎng)液分別經(jīng)6000rpm、 4。C離心20min， 棄上清液，沉淀菌體用DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮，分別調(diào)整各自濃度為 109cfli/mL。產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液、紅串球菌菌液和谷氨酸棒狀桿菌菌液以1:1:1 的比例混合，得到水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌液。
② 將微生物制劑用于消除水產(chǎn)品食用前的革蘭氏陽(yáng)性致病菌 試驗(yàn)容器為25L的水族箱，分為試驗(yàn)組(試驗(yàn)組共有3組，其中使用的蛭
弧菌終濃度分別為104pfu/mL、 1(^pfii/mL和108pfu/mL)和對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)平行。試驗(yàn)用水為濾膜過(guò)濾的養(yǎng)殖淡水，每個(gè)水族箱注入16L過(guò)濾水。水族 箱在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)二氯異腈尿酸鈉消毒，水溫為26'C。在每個(gè)水族箱中加入步驟①制備水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌液，終濃度為分別lxl04cfU/mL。然后每個(gè)水 族箱放羅非魚(yú)、南美白對(duì)蝦、河蜆以及大閘蟹各10只。試驗(yàn)所用羅非魚(yú)約重 140 190g，羅非魚(yú)、南美白對(duì)蟲(chóng)下體長(zhǎng)約為15-20cm，河蜆平均體長(zhǎng)為40mm， 大閘蟹規(guī)格為30 40g。對(duì)照組為只加步驟①制備水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌液 但不加蛭弧菌，實(shí)驗(yàn)組分別加入微生物制劑，使用的蛭弧菌終濃度分別為 104pfb/mL、 106pfb/mL、和108pfti/mL。培養(yǎng)72小時(shí)后，取1000 ml水樣，用 0.22 um濾膜(Millipore)過(guò)濾濃縮細(xì)菌，然后在用10ml無(wú)菌水洗下濾膜上的 菌體，再按10倍稀釋法稀釋?zhuān)詈髲拿總€(gè)稀釋梯度樣品中吸取0.2mL的水樣 涂平板進(jìn)行檢測(cè)。做三個(gè)平行樣檢測(cè)。
產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)采用強(qiáng)化梭菌瓊脂(強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中加入瓊脂15g 即可得)選擇性培養(yǎng)，紅串紅球菌的檢測(cè)采用加入丁二酸(1%W/V)的改良 Raymond培養(yǎng)基(Na2C03 O.lg, CaCI2-6H20 O.Olg， MnCI2-4H20 0.007g,Na2HPO4.12H2O 35.8g， KH2 P04 13.6g， MgCl2.6H20 0.16g, NH4C1 2.0g， NaCl 5.0g，瓊脂15g，蒸餾水lOOOmL， 丁二酸1%W/V， pH6.7)選 擇培養(yǎng)，谷氨酸棒狀桿菌的檢測(cè)采用CLED培養(yǎng)基(蛋白胨4g，牛肉粉3.0g, 胰蛋白胨4g，乳糖10g，半胱氨酸0.128g，溴麝香草酚藍(lán)0.02g，蒸餾水 1000mL，瓊脂15g， pH3.0)選擇性培養(yǎng)。計(jì)算活菌數(shù)。
從圖2，圖3和圖4中可知，添加只由蛭弧菌BDS02制成的微生物制劑 72h后，試驗(yàn)系列中試驗(yàn)組的各革蘭氏陽(yáng)性致病菌產(chǎn)氣莢膜梭菌、紅串紅球菌 和谷氨酸棒狀桿菌濃度均呈下降趨勢(shì)。作用72小時(shí)后，蛭弧菌濃度為104pfWmL 時(shí)，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、紅串紅球菌和谷氨酸棒狀桿菌的消除率分別為98.42%、 97.48%和98.00%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用只由蛭弧菌BDS02制成的微生物制劑 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性致病菌進(jìn)行消除時(shí)，蛭弧菌的濃度越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)，消除效 果就越好。
實(shí)施例2
(1) 消除水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌的微生物制劑的制備 制備過(guò)程同實(shí)施例1步驟(2)，區(qū)別僅在于加入生理鹽水重新懸浮蛭弧菌
沉淀物，蛭弧菌BDSOl菌液和蛭弧菌BDS02菌液的濃度分別為101Qpfu/mL，將 蛭弧菌BDS01菌液和蛭弧菌BDS02菌液按細(xì)菌數(shù)1:1混合，得到微生物制劑。
(2) 將微生物制劑用于消除水產(chǎn)品食用前的革蘭氏陽(yáng)性致病菌① 制備水產(chǎn)品所含的革蘭氏陽(yáng)性致病菌液
結(jié)核分枝桿菌(鄉(xiāng)C(^acfen)/m/i^ewM/a^ ATCC607，購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心)，用液體培養(yǎng)基(取嫩椰子汁經(jīng)過(guò)棉紗布?jí)|過(guò)濾后，再通過(guò)Whatmannl號(hào)濾紙過(guò)濾，每80 mL嫩椰子汁濾液加入20 mL馬血清和5 mL甘油，再加苯甲青霉素至混合液中，使培養(yǎng)基中苯甲青霉素最后濃度達(dá)到100IU/mL，混合液再經(jīng)0.22um醋酸纖維素膜過(guò)濾)搖床培養(yǎng)，160rpm 37。C培養(yǎng)7d。星狀諾卡氏菌(A^cfln^ostero/AATCC19247，購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心)用ISP-2培養(yǎng)基(酵母提取物4g，麥芽提取物10g，葡萄糖4g，蒸餾水1000mL，pH73)搖床培養(yǎng)，160rpm28。C培養(yǎng)7d。糞鏈球菌(5^e/ toco"w/flecafeATCC29212，購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心)和表皮葡萄球菌
"top/^/ococcws印W^vwVfo ATCC12228,購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心)分別用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL， pH7.4)搖床培養(yǎng)，160rpm 28。C培養(yǎng)36h。產(chǎn)氣莢膜梭菌(C7oWnV^w/ er/n."gera ATCC13124)、紅串紅球菌(i /2o^cocc附eo^^poto ATCC4277)和谷氨酸棒狀桿菌(Coo^e^c^^wg/wtomzV^w ATCC13032)的培養(yǎng)同實(shí)施例l歩驟(3)①。上述各菌的培養(yǎng)液分別經(jīng)6000rpm、 4。C離心20min，棄上清液，沉淀菌體用DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮，分別調(diào)整各自濃度為10、fu/mL。將上述菌按相同比例混合，得到水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌液。
② 將微生物制劑用于消除水產(chǎn)品食用前的革蘭氏陽(yáng)性致病菌實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例l步驟(3)②，微生物試劑的使用中，蛭弧菌的終濃
度也與實(shí)施例1步驟(3)②相同。培養(yǎng)72小時(shí)后，取1000 ml水樣，用0.22um濾膜(Millipore)過(guò)濾濃縮細(xì)菌，然后在用10ml無(wú)菌水洗下濾膜上的菌體，再按10倍稀釋法稀釋?zhuān)詈髲拿總€(gè)稀釋梯度樣品中吸取0.2mL的水樣涂平板進(jìn)行檢測(cè)。做三個(gè)平行樣檢測(cè)。
結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)采用Middlebrook 7H10 (Difco， DISEASES OFAQUATIC ORGANISMS, Vol. 61: 41-51， 2004)的復(fù)合瓊脂培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，星狀諾卡氏菌的檢測(cè)釆用含氯霉素的沙氏葡萄糖培養(yǎng)基(蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂粉llg，氯霉素O.lg，蒸餾水lOOOmL， pH6.0士0.2)選擇培養(yǎng)，糞鏈球菌的檢測(cè)采用KF鏈球菌瓊脂(蛋白胨10g，酵母粉10g， NaC15g，甘油磷酸鈉10g，麥芽糖20g，乳糖1.0g，疊氮化鈉0.15g，溴甲酚紫0.015g，瓊脂20g， pH7.2)選擇培養(yǎng)，表皮葡萄球菌的檢測(cè)采用甘露醇高鹽瓊脂平板(牛肉浸出粉lg，多價(jià)胨10g，氯化鈉75g，甘露醇10g，酚紅0.025g，瓊脂12g，蒸餾水1000mL， PH7.4i0.2)選擇培養(yǎng)。產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)采用強(qiáng)化梭菌瓊脂選擇培養(yǎng)，紅串紅球菌的檢測(cè)采用加入丁二酸(1%W/V)的改良Raymond培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，谷氨酸棒狀桿菌的檢測(cè)采用CLED培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)。計(jì)算活菌數(shù)。
如圖5,不加蛭弧菌時(shí)，革蘭氏陽(yáng)性菌總濃度有一定的增加；加入蛭弧菌后,革蘭氏陽(yáng)性菌總濃度均減少。當(dāng)蛭弧菌使用終濃度濃度為10VfWmL、l(^pfU/mL、1()Spfi!/mL時(shí)，微生物制劑作用于食用羅非魚(yú)、南美白對(duì)蝦、河蜆和大閘蟹，72小時(shí)后革蘭氏陽(yáng)性菌總濃度的消除率分別為99.90%、 99.95%和99.98%。
實(shí)施例3
將只含有蛭弧菌BDS02的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌，具體過(guò)程如下
試驗(yàn)容器、試驗(yàn)用水和試驗(yàn)所用羅非魚(yú)、南美白對(duì)蝦、河蜆、大閘蟹規(guī)格均同實(shí)施例l。每個(gè)水族箱內(nèi)放4只完好的網(wǎng)格，在每一個(gè)網(wǎng)格中分別放入羅非魚(yú)、南美白對(duì)蝦、河蜆及大閘蟹，封好網(wǎng)格蓋子后立即把它平放到水族箱中，排出箱內(nèi)多余用水，使其水位剛好蓋過(guò)網(wǎng)格。在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)二氯異腈尿酸鈉消毒，水溫為26。C。實(shí)驗(yàn)期間用水連續(xù)充氣。3個(gè)水族箱作為對(duì)照組，僅加入實(shí)施例l步驟(3)①制備的水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌液，終濃度為lxl04cfb/mL。試驗(yàn)組中，3個(gè)水族箱為一組，共四組，除了致病菌加入與對(duì)照組一樣外，還分別加入實(shí)施例1制備的微生物制劑，使用的蛭弧菌終濃度分別達(dá)到103pfii/mL、104pfU/mL、 105pfii/mL、 106pfU/mL。培養(yǎng)72小時(shí)后，取1000 ml水樣，用0.22um濾膜(Millipore)過(guò)濾濃縮細(xì)菌，然后在用10ml無(wú)菌水洗下濾膜上的菌體，再按10倍稀釋法稀釋?zhuān)詈髲拿總€(gè)稀釋梯度樣品中吸取0.2mL的水樣涂平板進(jìn)行檢測(cè)。做三個(gè)平行樣檢測(cè)。
產(chǎn)氣莢膜梭菌(ao^r/A>/w pe/yh'wgms ATCC13124)、紅串紅球菌(^/zo^fococciw ^3^/ ra/7o// s ATCC4277)和谷氣酸棒狀桿菌(Co^y"e6acfe,附g/Wtow/c/^ATCC13032)的檢測(cè)方法同實(shí)施例1，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
消除試驗(yàn)效果如圖6 8所示。圖6 8為試驗(yàn)系列中蛭弧菌終濃度分別為103pfu/mL、 104pfU/mL、 105pfU/mL和106pfu /mL時(shí)產(chǎn)氣莢膜梭菌、紅串紅球菌和谷氨酸棒狀桿菌各自濃度的對(duì)數(shù)值。所有數(shù)據(jù)均為三個(gè)平行樣(水族箱)的平均值。當(dāng)蛭弧菌BDS02濃度為10Spfu/mL時(shí)，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、紅串紅球菌及谷氨酸棒狀桿菌的消除率分別為96.84%、 96.02%和94.99%。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛭弧菌BDS02能有效消除革蘭氏陽(yáng)性菌。將只含有蛭弧菌BDS02的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌，蛭弧菌使用終濃度為103 106pfU/mI^t，革蘭氏陽(yáng)性菌濃度均保持下降趨勢(shì)。隨著蛭弧菌BDS02使用濃度的增大，革蘭氏陽(yáng)性菌的消除率越大。
實(shí)施例4
將含有蛭弧菌BDS02和BDS01的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌，具體過(guò)程如下-
實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例3，區(qū)別僅在于所用的微生物制劑和水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌分別為實(shí)施例2制備的微生物制劑和水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌。
72小時(shí)后，采用實(shí)施例2的方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算活菌數(shù)目。
由圖9可知，與對(duì)照系相比較，試驗(yàn)系列中革蘭氏陽(yáng)性菌總濃度均保持下降趨勢(shì)。當(dāng)蛭弧菌使用終濃度濃度分別為103pfWmL、 104pfb/mL、 105pfb/mL、1(^pfWmL時(shí)，微生物制劑在羅非魚(yú)、南美白對(duì)蝦、河蜆和大閘蟹的運(yùn)輸過(guò)程中對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌總濃度的消除率分別為99.80%、 99.87%、 99.92%和99.95%。
實(shí)施例5
將含有蛭弧菌BDS02的微生物制劑用于消除水產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌，具體過(guò)程如下
試驗(yàn)前，臨時(shí)建造12個(gè)養(yǎng)殖水池(0,5mxO.5mxO.5m=125L)。將養(yǎng)殖水池分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。試驗(yàn)用水為不過(guò)濾的養(yǎng)殖淡水，每個(gè)水池注入IOOL。養(yǎng)殖水池在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)二氯異腈尿酸鈉消毒，試驗(yàn)期間水溫為26°C，每個(gè)水池放羅非魚(yú)、南美白對(duì)蝦、河蜆及大閘蟹各20只，每日早晚各投餌一次。試驗(yàn)所用羅非魚(yú)、南美白對(duì)蝦、河蜆、大閘蟹規(guī)格均同實(shí)施例1。 3個(gè)水池為對(duì)照組，僅加入實(shí)施例1步驟(3)①制備的水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌液，終濃度為lxl04cfU/mL。試驗(yàn)組中，3個(gè)水池為一組，除了致病菌加入與對(duì)照組一樣外，還分別加入實(shí)施例1制備的微生物制劑，使用的蛭弧菌終濃度分別達(dá)到102pfii/mL、 103pfu/mL、 104pfU/mL和105pfb/mL。
72小時(shí)后，采用實(shí)施例1的方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算活菌數(shù)目。消除試驗(yàn)效果如圖10 12所示。圖10 12為試驗(yàn)系列中蛭弧菌終濃度分別為102pfii/mL、 103pfii/mL、 104pfii/mL和105pfo/mL時(shí)產(chǎn)氣莢膜梭菌、紅串紅球菌和谷氨酸棒狀桿菌各自濃度的對(duì)數(shù)值，所有數(shù)據(jù)均為三個(gè)平行樣(養(yǎng)殖水池)的平均值。當(dāng)蛭弧菌BDS02的濃度為1(^pfU/mL時(shí)，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、紅串紅球菌及谷氨酸棒狀桿菌的消除率分別為94.99%、 92.05%和卯.00%。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛭弧菌BDS02能有效消除革蘭氏陽(yáng)性菌。將只含有蛭弧菌BDS02的微生物制劑用于消餘水產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌，蛭弧菌使用終濃度為1(^ 1()SpfU/mL時(shí)，革蘭氏陽(yáng)性菌濃度均保持下降趨勢(shì)。隨著蛭弧菌BDS02使用濃度的增大，革蘭氏陽(yáng)性菌的消除率越大。
實(shí)施例6
將微生物制劑用于消除水產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌，具體過(guò)程如下
實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例5,區(qū)別僅在于所用的微生物制劑和水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌分別為實(shí)施例2制備的微生物制劑和水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌。72小時(shí)后，采用實(shí)施例2的方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算活菌數(shù)目。消除試驗(yàn)效果如圖13所示，所有數(shù)據(jù)均為三個(gè)平行樣(養(yǎng)殖水池)的平均值。
由圖13可知，與對(duì)照組相比較，試驗(yàn)系列中革蘭氏陽(yáng)性菌總濃度均保持下降趨勢(shì)。蛭弧菌使用終濃度為102pfU/mL、 103pfU/mL、 104pfU/mL和105pfu/mL，革蘭氏陽(yáng)性菌的消除率分別為99.00%， 99.60%， 99.75%和99.87%。 2株蛭弧菌聯(lián)用，能明顯消除養(yǎng)殖水體中的革蘭氏陽(yáng)性菌的濃度，保證了淡水養(yǎng)殖過(guò)程中水產(chǎn)品的健康生長(zhǎng)。
實(shí)施例7
將微生物制劑用于消除淡水養(yǎng)殖水體中的致病菌，具體過(guò)程如下嗜水氣單胞菌(4eramoMas/^c/ro; /H7a，購(gòu)于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號(hào)GIM1.172)，惡臭假單胞菌(尸^i^owo"ay ;^/Wfl，購(gòu)于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號(hào)GIM1.193)及大腸桿菌(五"/zmW^ co仏購(gòu)于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號(hào)GIM1.42)分別用用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，160rpm28。C培養(yǎng)12h。培養(yǎng)液分別于4。C6000rpm離心20min，棄上清液，沉淀菌體用無(wú)菌蒸餾水重新懸浮，再將這些沉淀菌體混合，并使其終濃度分別達(dá)到
lxi05cfii/mL。嗜水氣單胞菌的檢測(cè)采用RimLer-shotts選擇性培養(yǎng)基(L-鹽酸鳥(niǎo)氨酸0.05% w/v， L-鹽酸鳥(niǎo)氨酸0.65% w/v，麥芽糖0.35% w/v，次亞硫酸鈉0.68%w/v， L-半脫氨酸鹽酸鹽0.03。/。w/v，溴百里酚藍(lán)0.003% w/v，枸橡酸鐵銨0.08°/。w/v，脫氧膽酸鈉0.1。/。w/v，新生霉素0.0005°/。 w/v，酵母抽提物0.3% w/v，氯化鈉0.5。/。w/v，瓊脂1.35% "，pH7.0)，惡臭假單胞菌的檢測(cè)采用NMS選擇性培養(yǎng)基(KH2P04 0.58 g/1 ; Na2HP04*12H20 2.17 g/l; NaN02 0,85 g/l; K2S040.17 g/l; MgS04*7H20 0.037 g/1; FeS04*7H20 0.012 g/1;微量元素溶液2mL， pH7.0)，遲緩愛(ài)德華菌(請(qǐng)?zhí)峁┚旰蛠?lái)源，是多出的菌株？)的檢測(cè)采用HE選擇性瓊脂培養(yǎng)基(賕胨12g,牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水楊素2g，膽鹽20g氯化鈉5g，溶于400mL蒸餾水，加入20mL甲液(硫代硫酸鈉34g，檸檬酸鐵銨4g，蒸餾水lOOmL) ， 20mL乙液(去氧膽酸鈉10g，蒸餾水lOOmL)，0.4%溴麝香草酚藍(lán)溶液16mL， Andrade指示劑20mL (酸性復(fù)紅0.5g， lmol/L氫氧化鈉溶液16mL，蒸餾100mL，將復(fù)紅溶解于蒸餾水中，加入氫氧化鈉溶液。數(shù)小時(shí)后如復(fù)紅褪色不全，再加氫氧化鈉溶液1 2mL， pH7.5，再與瓊脂混合)，大腸桿菌的檢測(cè)采用TBX (—種顯色培養(yǎng)基)選擇性瓊脂培養(yǎng)基。
將革蘭氏陰性致病菌與步驟(2)制備的革蘭氏陽(yáng)性致病菌按1:1，得到淡水養(yǎng)殖水體中的致病菌。
實(shí)施例2制備的微生物制劑消除淡水養(yǎng)殖水體中的致病菌實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例6，區(qū)別僅在于所用的致病菌為本實(shí)例制備的致病菌。
72小時(shí)后，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
對(duì)養(yǎng)殖水體中革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性致病菌的消除試驗(yàn)的效果如圖14所示。所有數(shù)據(jù)均為三個(gè)平行樣(養(yǎng)殖水池)的平均值。
如圖14，不加蛭弧菌時(shí)，養(yǎng)殖水體中的致病菌濃度有一定的增加；當(dāng)加入濃度為10ifb/mL蛭弧菌時(shí)，致病菌的濃度最初為lxl05cfii/mL，到72h時(shí)，致病菌的濃度還不到100cfU/mL?？芍@2株蛭弧菌合用能很好的控制養(yǎng)殖水體中革蘭氏陽(yáng)性及革蘭氏陰性致病菌的濃度。蛭弧菌發(fā)使用濃度為102 105pfU/mL，蛭弧菌濃度越大，消除致病菌的效果就越好。在淡水養(yǎng)殖水體中加入所述的微生物制劑，既能全面預(yù)防各種病害，同時(shí)又保證了水產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCE LISTING
〈110〉華南理工大學(xué)
〈120〉 一種消除水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用
〈130〉 8
〈160〉 1
〈170> Patentln version 3，2
〈210〉 1
〈211〉 1835
〈212〉 DNA
〈213〉 蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)
〈400〉 1
caggcctaac acatgcaagt cgetacggggt
60
agc犯tacct agtggcgcac gggtgagtaa
cgcgtggata a/tctgccttg gagtggggg3 taactagtcg aaagattagc taataccgca 120
taagaccaca ggagctgcgg ctctaggggt caaaggtttt tcgttccaag atgagtccgc 180
gtaagattag ctagttggtg aggtaatggc tcacc犯ggc gacgatcttt aactggtctg 240
agaggatgat cagtcacact gga^ctgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300
tagggaatat tgcacaatgg aggaaactct gatgcagcga cgccgcgtga gtgatgaagg 360
ccttcgggtc gtaaagctct gtcgcagggg aataacacaa tgaatgtacc ctgtaagaaa 420
ggatcggcta atcttcgtgcc agcagccgcg gtaagacgag ggatcctagc gttgttcgga 480
eitt3ttgggc gtei33gcggei tgtstggtggc tttgt犯gtc agstgtg犯a gcccsgggct 540
caaccctgga agtgceitttg atactgcgaa gcttgagtgt cggagaggtt actagaattg 600
ttggtgtagt ggtgaaatac gtagatatca acaggaatac cggaggcgaa ggcgggtaac GG0
tggccgaaca ctgacactga gatccgaaag cgtggggatc犯acaggatt agataccctg 720
gtagtccacg ccgtaaacga tggatacttg ttgttagagg tattgacccc ttcagtgacg 780
aagctaacgc gttaagtatc ccgcctgggg agtacggtcg c犯gatta犯actcaa3gaa 840
attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca acgcgaagaa 900
ccttacctag gcttgacatg tactggaaga ttggcagaaa tgtcgtcgcc cgcaagggtc 960ggtacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1020
gcaacgagcg caacccctgc atttag"ttgc cagcattcag ttcggcactc tagatggact 1080
gccggtgtta aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttatgccta 1140
gggctaceica cgtgctacaa tggtagtcac agagcgaagc taagccgcga ggtagagcaa 1200
atcgctt犯a agctatctaa gttcaga/ttg atctctgcaa ctcgagatca tgaagttgga 1260
atcgctagta atcgcggaac agaatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1320
cgcccgtcac accatgaaag tcggctgtac cagaagtcgc tgcgctaacc gtaaggaggc 1380
aggcgccc犯ggtatggtcg atgattgggg tg犯gtcgta acaagggagc cgt鄉(xiāng)gg犯 1440
cctgcggctg gatcacctcc tttctaaggt ttatccggtc aatcttcatc aagacttgtt 1500
cttgataagt taaaatgacc caatctteigg tcaacttact cttcccgagt aagtgagtcc 1560
caaaaatcta tctagctgtt tagttttgag agagtg犯gc ctaacgggcc tgtagctcag 1620
ttggttacag cacacgcttg ataagcgtgg ggtcggaagt tcgagtcttc ccaggcccac 1680
caagttctac tgtactggaa tgcggtgtaa gttagagttt tgctgaacgg ttttcgttct 1740
ttgacatttg aatagattga tttagttgat ttttagcgag gttagttcca ttctttt犯g 1800
ctacaaaggg cttacggtgg atgccctggc agtca 183權(quán)利要求
1、一種消除水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌的蛭弧菌菌株，其特征在于，所述蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS02，于2009年8月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNOM209170。
2、 一種消除水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌的微生物制劑，其特征在于， 所述微生物制劑含有權(quán)利要求1所述的蛭弧菌BDS02。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物制劑，其特征在于所述的微生物 制劑含有蛭弧菌(3^//0^'^/0 8 .) BDSOl。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物制劑，其特征在于所述微生物制 劑中蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDS01按細(xì)菌數(shù)1:1混合。
5、 權(quán)利要求2 4任一項(xiàng)所述微生物制劑的應(yīng)用，其特征在于所述 微生物制劑用于消除水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述微生物制劑的應(yīng)用，其特征在于所述水產(chǎn) 品為淡水產(chǎn)品。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述微生物制劑的應(yīng)用，其特征在于所述水產(chǎn) 品革蘭氏陽(yáng)性致病菌為結(jié)核分枝桿菌(聊co6acfe^a附ft^ercw/o^;s)、星狀 諾卡氏菌(M)caWar ay/era/cfes)、紅串紅球菌(朋odococc"s e/j/Zwo/Po/^ )、 糞鏈球菌(iSW/^ococcMs^ecato)、表皮葡萄球菌(S鄉(xiāng)/^/ococcws e/ zV^vmD 、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C7o血A—/ e咖'"ge"s)及谷氨酸棒狀桿 菌(C"o^y打e6acteri^m g/i^amz'cpm )。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述微生物制劑的應(yīng)用，其特征在于所述微生物制劑應(yīng)用于消除食甩或加工前水產(chǎn)品攜帶的革蘭氏陽(yáng)性致病菌；所述微生物制劑應(yīng)用于控制水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌； 所述微生物制劑應(yīng)用于控制水產(chǎn)品養(yǎng)殖水體中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述微生物制劑的應(yīng)用，其特征在于 所述微生物制劑應(yīng)用于消除食用或加工前水產(chǎn)品攜帶的革蘭氏陽(yáng)性致病菌，使用的蛭弧菌終濃度為104 108pfu/mL;所述微生物制劑應(yīng)用于控制水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌， 使用的蛭弧菌終濃度為103 106cfU/mL;所述微生物制劑應(yīng)用于控制水產(chǎn)品養(yǎng)殖水體中的革蘭氏陽(yáng)性致病菌，使用的蛭弧菌終濃度為102 105pfii/mLc
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種消除水產(chǎn)品革蘭氏陽(yáng)性致病菌的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明分離得到一株在電子顯微鏡下觀察呈單細(xì)胞，弧形，大小為0.65×0.2μm，端生鞭毛，鞭毛長(zhǎng)度至少1.8μm的蛭弧菌BDS02。將其以雙層平板法于28℃培養(yǎng)四天可形成直徑1-2mm的透明圓形噬菌斑。應(yīng)用所述蛭弧菌BDS02制備的微生物制劑對(duì)水產(chǎn)品食用前，運(yùn)輸過(guò)程及養(yǎng)殖過(guò)程中的常見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性致病菌，包括結(jié)核分枝桿菌、星狀諾卡氏菌、紅串紅球菌、糞鏈球菌、表皮葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌及谷氨酸棒狀桿菌有顯著的消除作用，不僅可提高消費(fèi)者生食水產(chǎn)品的安全系數(shù)，保護(hù)消費(fèi)者的健康，也為水產(chǎn)品的綠色加工生產(chǎn)提供保障。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101649298SQ20091004227
公開(kāi)日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者敏 張, 蔡俊鵬 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)