專利名稱：一種海洋珍珠貝氨基甙的雙水相萃取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海洋珍珠貝氨基甙的提純方法，具體來說是涉及一種用雙水相萃取來純 化海洋珍珠貝氨基甙的方法。
背景技術(shù)：
氨基甙是由氨基酸分子和糖元部分組成的一類物質(zhì)，其中的糖基由氨基己糖和己糖醛酸 (D-glucuronic和L-iduronic acid)或半乳糖單元交替、無支鏈排列組成，并在不同位置 連有磺酸基。依據(jù)磺酸基取代位置和數(shù)目不同，氨基甙分為硫酸軟骨素(CS)、硫酸皮膚素(DS)、 硫酸肝素(HS)、硫酸角質(zhì)素(KS)等種類。氨基甙的分子結(jié)構(gòu)序列的種類非常繁多，不同結(jié) 構(gòu)氨基多糖分子與其它高分子發(fā)生交互作用時(shí)有高度的選擇性。氨基甙與生物的普通或病態(tài) 生理過程中細(xì)胞間和細(xì)胞組織間的相互作用非常重要，例如在組織形成、胚胎發(fā)育、細(xì)胞識(shí) 別、粘連遷移、生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)、脂類代謝、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和再生、炎癥的消除等過程中， 氨基甙都扮演重要的角色。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)氨基甙具有抗腫瘤、抗凝血、增強(qiáng)免疫力、降血 脂等生物活性。因此氨基甙的制備、分離和純化工作已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外廣泛重視。近年來，海 洋生物成為氨基甙的重要來源。如Souza等報(bào)道了從電鰻中分離純化硫酸軟骨素和硫酸皮膚 素衍生物的過程，張傯等(中國(guó)專利ZL200610037275.8)和范秀萍等分別報(bào)道了珍珠貝氨基 甙的制備和純化；吳紅棉等報(bào)道了波紋巴非蛤氨基多糖的分離純化。已有的報(bào)道中，氨基甙 的制備都包含對(duì)生物組織的酶解制備氨基甙粗品和粗品的純化步驟兩個(gè)重要步驟，其中氨基 甙粗品的純化方法有珍珠貝氨基甙的定重分離方法、等電點(diǎn)沉淀法、柱層析法等。
中國(guó)專利ZL200610037275. 8公開了一種由氨基酸序列為一GASRERCAKLSG—的小肽和硫 酸軟骨素B的重復(fù)結(jié)構(gòu)片段組成，其中硫酸軟骨素B與氨基酸序列中的谷氨酸聯(lián)接，相對(duì)分 子質(zhì)量范圍為1300 33000的海洋珍珠貝氨基甙。所述的硫酸軟骨素B由以下式(l)表示
NH2
式(l)通過超聲波或液氮破細(xì)胞膜，酸解，仿胃液酶解，仿腸液酶解，用不同配比有機(jī)溶劑進(jìn)行定 重分離、離心分離等步驟，制得高純度海洋珍珠白氨基甙。但離心分離氨基甙后余下的上清 液中還殘留有部分海洋珍珠貝氨基甙，與電泳分析中遷移率較低的未知雜質(zhì)混合，并且使用 ZL200610037275.8中提高乙醇濃度的方法也無法將雜質(zhì)分離，因?yàn)槟切╇s質(zhì)和珍珠貝氨基甙 形成共沉淀。要分離提純這部分海洋珍珠貝氨基甙必須尋求新的方法。
雙水相系統(tǒng)是指在一定條件下，互不相容的水溶液系統(tǒng)。常見的雙水相系統(tǒng)有聚合物-聚合物-水、聚合物-無機(jī)鹽-水、聚合物-有機(jī)鹽-水、表面活性劑-水等類型。雙水相萃取技 術(shù)(Aqueous two-phase extraction, ATPE)是利用混合物中不同成分在兩相中溶解度的差異 對(duì)混合物進(jìn)行分離，這種技術(shù)具有分離條件溫和、速度快、能耗低、污染低、高通量、易于 放大應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。自1956年雙水相萃取技術(shù)出現(xiàn)以來，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，雙 水相萃取方法已經(jīng)成為得到廣泛應(yīng)用的生物制品下游分離、濃縮技術(shù)。雙水相萃取法在氨基 甙分離純化的應(yīng)用上尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過雙水相萃取技術(shù)從上述上清液中分離純化得到高純度的海洋珍珠 貝氨基甙。
我們通過將中國(guó)專利ZL200610037275. 8所述方法中離心分離氨基甙后余下的上清液中 的乙醇除去，在得到的水溶液中加入聚乙二醇和磷酸二氫鉀，分層后用氯仿除去聚乙二醇， 得到海洋珍珠貝氨基武和無機(jī)鹽的混合水溶液，脫鹽干燥后得到高純度的海洋珍珠貝氨基甙， 從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的海洋珍珠貝氨基甙的雙水相萃取方法，其特征包括以下步驟
(1) 將殘留有海洋珍珠貝氨基甙的上清液中的乙醇除去，得到無乙醇的含海洋珍珠貝氨 基甙水溶液，所述的殘留有海洋珍珠貝氨基甙的上清液是通過下述步驟得到將海洋珍珠貝 粉碎后，破細(xì)胞膜，加入氟汰酸或乳酸調(diào)節(jié)pH值至6.0 6.5，混合均勻后得酸解液，將酸 解液經(jīng)過仿胃液酶解，再經(jīng)仿腸液酶解后，冷凍干燥得到可溶性粉末，將得到的粉末用水溶 解，加入乙醇至其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)55% 60%，然后取上清液，向上清液中加入乙醇至其乙醇質(zhì)量 分?jǐn)?shù)達(dá)75%,離心分離，取去沉淀部分(海洋珍珠貝氨基甙)后得到殘留有海洋珍珠貝氨基 甙的上清液；
(2) 將聚乙二醇、磷酸二氫鉀和步驟(l)得到的無乙醇的含海洋珍珠貝氨基甙水溶液按質(zhì) 量比3 4:4 7:25充分混合，靜置分層，取上層相(富含聚乙二醇)，用氯仿萃取，去除氯 仿有機(jī)相，得到海洋珍珠貝氨基甙和無機(jī)鹽的混合水溶液；
(3) 將步驟(2)得到的海洋珍珠貝氨基甙和無機(jī)鹽的混合水溶液超濾脫鹽，冷凍干燥后得 到純海洋珍珠貝氨基甙粉末。步驟(l)中在真空下30 4(TC將殘留有海洋珍珠貝氨基甙的上清液中的乙醇除去；無乙 醇的含海洋珍珠貝氨基甙水溶液中海洋珍珠貝氨基甙和雜質(zhì)混合物的總含量最好在質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5% 15%;步驟(2)所述的聚乙二醇的相對(duì)分子質(zhì)量最好是4000或6000，所述的靜置時(shí)間可 以是10 24小時(shí)，所述的氯仿的用量最好為聚乙二醇相體積的0. 5 1. 5倍，萃取次數(shù)為3 5次。
本發(fā)明有操作簡(jiǎn)單，條件溫和，能耗低，所采用的化學(xué)試劑可重復(fù)回收利用，得到的終 產(chǎn)物經(jīng)電泳分析證實(shí)其中的雜質(zhì)已除去，通過理化測(cè)試證實(shí)本發(fā)明得到的產(chǎn)物的特征成分性 質(zhì)與中國(guó)專利200610037275. 8得到的海洋珍珠貝氨基甙的特征性成分一致。


圖l:海洋珍珠貝氨基的電泳圖，其中 1:硫酸軟骨素B標(biāo)樣(0.2mg/mL, 10uL); 2:硫酸軟骨素B標(biāo)樣(2mg/mL， 10uL); 3:進(jìn)行雙水相萃取前的海洋珍珠貝氨基甙(2mg/mL， 10uL); 4:實(shí)施例1得到的海洋珍珠貝氨基甙(2mg/mL， 10uL); 5:實(shí)施例2得到的海洋珍珠貝氨基甙。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
以下實(shí)施例中所采用的聚乙二醇由成都科龍化工廠生產(chǎn)，其余有機(jī)試劑均由天津百世公 司生產(chǎn)(分析純)，無機(jī)試劑購(gòu)自廣州試劑公司(分析純)。純水使用MiniQ純水制備系統(tǒng)制 備。
實(shí)施例1:
將1000g海洋珍珠貝(珍珠貝軟體部和貝殼)粉碎后，用22KHz超聲波破細(xì)胞膜，加蒸 餾水2000mL混合均勻，使用lmol/L氟汰酸調(diào)節(jié)pH值至6. 0，后得酸解液，取1000mL酸解 液加入2. 8g木瓜蛋白酶，然后用0. lmol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)的pH值為7. 5，酶解溫度是50°C， 酶解時(shí)間是6h，得到酶解液。取30g胰蛋白酶，0.025mol，磷酸二氫鉀，O.Olmol氯化鉀， 4rano1牛磺膽酸鈉和lramol磷酯酸膽堿，用少量水溶解后，加入上述得到的酶解液混勻并定 容到1000mL，用0. lmol/LNa0H溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值到8. 0,酶解溫度是45°C，酶解時(shí)間是 2h，冷凍干燥得到可溶性粉末。
將上述得到的粉末用水溶解，加入純乙醇使其乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)60%,取上清液；向上 清液中加入乙醇使其乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)75%， 5000r/min離心取去沉淀部分，余下殘留有海洋 珍珠貝氨基甙的上清液。
將上述殘留有海洋珍珠貝氨基甙的上清液在4CTC真空蒸餾除去乙醇，得到無乙醇的海洋珍珠貝氨基甙水溶液，從中取少量?jī)龈?，?jì)算干物質(zhì)含量約為質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%。
取上述無乙醇的海洋珍珠貝氨基甙水溶液1000mL，加入160g聚乙二醇4000，加入160g
KH2P04,充分?jǐn)嚢杵胶狻５谷?000mL分液漏斗，靜置24小時(shí)，雙水相系統(tǒng)完全分層，此時(shí)雙
水相系統(tǒng)總體積約為1180mL，上相體積約430mL，下相體積約750mL。上下相分離后向分液
漏斗內(nèi)的上相中加入215mL氯仿萃取聚乙二醇，反復(fù)萃取3次，除去聚乙二醇，得海洋珍珠
貝多糖和無機(jī)鹽混合水溶液。
將海洋珍珠貝多糖和無機(jī)鹽混合水溶液用德國(guó)Satorius公司產(chǎn)VIVAFL0W50型板框超濾
器脫 鹽(聚砜膜，截留分子質(zhì)量300 1000u，工作壓力O. lMPa，溫度25。C)，冷凍干燥后得
到海洋珍珠貝氨基甙27g。
取得到的海洋珍珠貝氨基甙進(jìn)行電泳分析，證實(shí)其中的低遷移率雜質(zhì)己被除去，具體見 圖1中4。分析條件0. 05mol/L 1， 3-diaminopropane/acetate緩沖、液，pH 9. 0;電泳用凝膠 板0. 5%瓊脂糖緩沖液溶液制備;電泳參數(shù)IOOV， 60min;顯色固定液0. 1 %CTAB， 200mL 純水，0. 2%CTAB (固定2h);顯色劑0. 1% toluidine blue in acetic acid/ethanol/water (體積比O. 1:5:5)。
將得到的海洋珍珠貝氨基甙進(jìn)行分子質(zhì)量測(cè)定，利用高效液相凝膠滲透色譜法，以標(biāo)準(zhǔn) 肽和硫酸軟骨素為標(biāo)準(zhǔn)品。測(cè)試條件Waters Ultrahydrogel型凝膠柱，流動(dòng)相0. 1 mol/L NaN03。得出的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為1300 30000。
將得到的海洋珍珠貝氨基甙進(jìn)行小肽的氨基酸序列測(cè)定將衍生化的小肽溶于0.1% TFA(三氟乙酸)中，以CCA(ct-氰基-4-羥基肉桂酸)為基質(zhì)。結(jié)晶后，采用脈沖氮激光(337nm) 作為離子解析電離源，以線性一延時(shí)引出模式，在Brucker Biflex III型MALDI-TOF質(zhì)譜儀 上進(jìn)行分析，結(jié)果顯示本產(chǎn)物的純度完全滿足測(cè)序要求。然后在Applied Biosystems Procise model 491 N-端氨基酸測(cè)序儀上進(jìn)行序列分析，循環(huán)終止于第12個(gè)氨基酸殘基，并且小肽的 氨基酸序列為GASRERCAKLSG。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，計(jì)算小肽的分子質(zhì)量為1432. 56u。
將得到的海洋珍珠貝氨基甙進(jìn)行糖基的結(jié)構(gòu)分析
紅外光譜測(cè)定取lmg本發(fā)明產(chǎn)物，采用溴化鉀壓片法進(jìn)行紅外光譜測(cè)定。在1738. 6cm-l 處有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，是羰基的伸縮振動(dòng)，表明含有糖醛酸結(jié)構(gòu)。
全水解及GC分析取6mg本發(fā)明產(chǎn)物，放入試管中，加入4mL的TFA (三氟乙酸)，用 酒精噴燈高溫封管。在IIO'C水解2小時(shí)，在40。C以下減壓除去TFA，然后加入5mL甲醇蒸 干，重復(fù)三次，盡量除去殘留TFA。加入lmL水溶解得到的產(chǎn)物，用纖維素板層析。將薄層 層析分析后得到的樣品(溶出后直接進(jìn)入下一步反應(yīng)，不需稱量)加水至3mL，加入10mg的 NaBH4在室溫下還原2小時(shí)后用冰醋酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至4 5之間，減壓蒸干，重復(fù)三次， 保證還原完全，真空干燥徹底除去水分得到固體粉末，然后加入2mL醋酐密封，在水浴中加熱反應(yīng)2小時(shí)，減壓出去過量的醋酐，加入lmL的甲苯，蒸干，重復(fù)操作三次。將乙?；?的產(chǎn)物用氯仿5mL溶解，加入5mL水，洗滌三次，將氯仿層干燥后濃縮，進(jìn)行GC分析。GC 分析證明，本發(fā)明的的海洋珍珠貝氨基甙中含有氨基半乳糖。
TLC分析證明樣品含有糖醛酸，因此進(jìn)行糖醛酸的還原反應(yīng)。取薄層層析分析后得到的 樣品2mg進(jìn)行糖殘基組成的GC分析，證明為艾杜糖醛酸。
上述理化分析結(jié)果證明，本發(fā)明制得海洋珍珠貝氨基甙特征性成分理化性質(zhì)與 ZL200610037275. 8制得的相同，未發(fā)生變化。
實(shí)施例2:
將1000g海洋珍珠貝(珍珠貝軟體部和貝殼)粉碎后，用24KHz超聲波破細(xì)胞膜，加蒸 餾水2000mL混合均勻，使用lmol/L乳酸調(diào)節(jié)pH值至6. 5，后得酸解液，取1000mL酸解液 加入3. 5g木瓜蛋白酶，然后用0. lmol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)的pH值為7. 0，酶解溫度是45。C ，酶 解時(shí)間是8小時(shí)，得到酶解液。取50g胰蛋白酶，0. 032mol磷酸二氫鉀，0. 03mol氯化鉀， 6mrao1?；悄懰徕c和2mmo1磷酯酸膽堿，用少量水溶解后，加入上述得到的酶解液混勻并定 容到1000mL，用0. lmol/LNa0H溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值到8. 5，酶解溫度50°C，酶解時(shí)間4h， 冷凍干燥得到可溶性粉末。
將上述得到的粉末首先加入純乙醇使其乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)55%，取上清液；向上清液中 加入乙醇使其乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)75%， 4500r/min離心取沉淀部分，余下殘留有海洋珍珠貝氨 基甙的上清液
將上述殘留有海洋珍珠貝氨基武的上清液在3(TC真空蒸餾除去乙醇和部分水份，得到無 乙醇的海洋珍珠貝氨基甙水溶液，從中取少量?jī)銮В?jì)算干物質(zhì)含量約為質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%。
在上述1000mL無乙醇的海洋珍珠貝氨基甙水溶液中，加入120g聚乙二醇6000，加入280g KH2P04,充分?jǐn)嚢杵胶?。倒?000mL分液漏斗，靜置10小時(shí)，雙水相系統(tǒng)完全分層，此時(shí)雙 水相系統(tǒng)總體積約為1200mL，上相體積約360mL，下相體積約840mL。上下相分離后向分液 漏斗內(nèi)的上相中加入540mL氯仿萃取聚乙二醇，反復(fù)萃取3次，除去聚乙二醇，得海洋珍珠
貝多糖和無機(jī)鹽混合水溶液。
將海洋珍珠貝多糖和無機(jī)鹽混合水溶液用德國(guó)Satorius公司產(chǎn)VIVAFL0W50型板框超濾 器脫鹽(聚砜膜，截留分子質(zhì)量1000u，工作壓力0. lMPa,溫度25'C)，冷凍干燥后得到海 洋珍珠貝氨基甙80g。
取得到的海洋珍珠貝氨基甙進(jìn)行電泳分析，證實(shí)其中的低遷移率雜質(zhì)已被除去，具體見 圖1中5。通過同實(shí)施例1的理化分析證明，制得海洋珍珠貝氨基甙特征性成分理化性質(zhì)與 ZL200610037275. 8制得的相同，未發(fā)生變化。
權(quán)利要求
1.一種海洋珍珠貝氨基甙的雙水相萃取方法，其特征包括以下的步驟(1)將殘留有海洋珍珠貝氨基甙的上清液中的乙醇除去，得到無乙醇的含海洋珍珠貝氨基甙水溶液，所述的殘留有海洋珍珠貝氨基甙的上清液是通過下述步驟得到將海洋珍珠貝粉碎后，破細(xì)胞膜，加入氟汰酸或乳酸調(diào)節(jié)pH值至6.0～6.5，混合均勻后得酸解液，將酸解液經(jīng)過仿胃液酶解，再經(jīng)仿腸液酶解后，冷凍干燥得到可溶性粉末，將得到的粉末用水溶解，加入乙醇至其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)55％～60％，然后取上清液，向上清液中加入乙醇至其乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)75％，離心分離，取去沉淀部分后得到殘留有海洋珍珠貝氨基甙的上清液；(2)將聚乙二醇、磷酸二氫鉀和步驟(1)得到的無乙醇的含海洋珍珠貝氨基甙水溶液按質(zhì)量比3～4∶4～7∶25充分混合，靜置分層，取上層相，用氯仿萃取，去除氯仿有機(jī)相，得到海洋珍珠貝氨基甙和無機(jī)鹽的混合水溶液；(3)將步驟(2)得到的海洋珍珠貝氨基甙和無機(jī)鹽的混合水溶液超濾脫鹽，冷凍干燥后得到純海洋珍珠貝氨基甙粉末。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海洋珍珠貝氨基甙的雙水相萃取方法，其特征是步驟(1)中在真空下30 4(TC將殘留有海洋珍珠貝氨基甙的上清液中的乙醇除去；無乙醇的含海洋珍珠貝氨基甙水溶液中海洋珍珠貝氨基甙和雜質(zhì)混合物的總含量在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% 15%;步驟(2)所述的聚乙二醇的相對(duì)分子質(zhì)量是4000或6000，所述的靜置時(shí)間是10 24小時(shí)，所述的氯仿的用量為聚乙二醇相體積的0. 5 1. 5倍，萃取次數(shù)為3 5次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用雙水相萃取來純化海洋珍珠貝氨基甙的方法，其特征包括以下步驟將中國(guó)專利ZL200610037275.8所述方法中離心分離氨基甙后余下的殘留有海洋珍珠貝氨基甙的上清液中的乙醇除去，得到無乙醇的海洋珍珠貝氨基甙水溶液，然后將聚乙二醇，磷酸二氫鉀和無乙醇的海洋珍珠貝氨基甙水溶液按質(zhì)量比3～4∶4～7∶25混合，靜置分層，取上層相，用氯仿萃取，去除氯仿有機(jī)相，得到海洋珍珠貝氨基甙和無機(jī)鹽的混合水溶液，然后超濾脫鹽，冷凍干燥后得到高純度海洋珍珠貝氨基甙粉末。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，條件溫和，能耗低，所采用的化學(xué)試劑可重復(fù)回收利用，得到的海洋珍珠貝氨基甙純度高，與上述專利得到的海洋珍珠貝氨基甙的特征成分一致。
文檔編號(hào)C12P21/06GK101638681SQ200910042239
公開日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者浩 尹, 偲 張, 龍麗娟 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所