專利名稱：：一種新的復(fù)方頭孢他啶舒巴坦鈉的檢測(cè)方法一種新的復(fù)方頭孢他啶舒巴坦鈉的檢測(cè)方法
背景技術(shù)：
：頭孢他啶(Ceftazidime)是由Callaghan等人于1978年研制成功的第三代半合成頭孢菌素類抗生素，其特點(diǎn)是對(duì)綠濃桿菌、腸桿菌屬、厭氧菌、脆弱性桿菌等有殺菌作用；同時(shí)仍對(duì)各種革蘭氏陽性及陰性菌有較大的抗菌活性；對(duì)酶十分穩(wěn)定、安全，副作用小且抗菌譜廣泛，因而被認(rèn)為是氨基糖甙類抗生素的理想取代品。該產(chǎn)品上市多年，在全世界多個(gè)國(guó)家與地區(qū)使用，受到廣泛好評(píng)，至今仍是臨床一線用藥(劉煜婷，2004)。由于大量和廣泛的臨床應(yīng)用，甚至近年來濫用的出現(xiàn)，臨床上產(chǎn)生了耐頭孢他啶的耐藥菌，如耐藥的檸檬酸細(xì)菌屬和普通變形桿菌的假單胞菌屬和腸桿菌科，克雷伯氏菌屬，以及抗青霉素的葡萄球菌、單核細(xì)胞增多性李司忒(氏)菌。導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的最主要機(jī)制為產(chǎn)生特異性的e-內(nèi)酰胺酶，包括由質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜e-內(nèi)酰胺酶(ExtendedSpectrumP-Lactamase，ESBLs)和主要由染色體編碼的AmpC酶(Matindale2002;JacobyGAetal，1991;李真等，2002)。舒巴坦鈉(SulbactamSodium)是一個(gè)廣譜酶抑制劑，雖對(duì)大多數(shù)臨床感染菌不具有或僅具有微弱的抗菌活性，但它是不可逆的e-內(nèi)酰胺酶抑制劑，可顯著增強(qiáng)e-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)細(xì)菌的抗菌活性。因此，采用"抗生素+e-內(nèi)酰胺酶抑制劑"的復(fù)方組合能有效地抑制了產(chǎn)酶菌的耐藥問題。由這種思路開發(fā)的復(fù)方制劑如"阿莫西林克拉維酸"、"頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉"、"哌拉西林鈉舒巴坦鈉"等在臨床上獲得了很大的成功。按照協(xié)同式藥物組合的研發(fā)思路，我們開發(fā)了"注射用頭孢他啶舒巴坦鈉"。頭孢他啶和舒巴坦鈉兩者合用后，具有良好的協(xié)同作用，可增加頭孢他啶的抗菌活性，并擴(kuò)大其抗菌譜。之前對(duì)于頭孢他啶、舒巴坦鈉均有比較成熟的檢驗(yàn)方法(彭軍等，2001;)，但由于以前沒有復(fù)方制劑，實(shí)踐中均是對(duì)單一成分做檢測(cè)，因此針對(duì)兩者混合后的復(fù)方的檢驗(yàn)需要建立新的檢測(cè)方法，這樣的檢測(cè)方法必須同時(shí)能夠檢測(cè)出復(fù)方中單一成分的含量和有關(guān)雜質(zhì)，同時(shí)，這一檢測(cè)方法對(duì)單一成分的測(cè)定還不能受到另一成分的影響，而且能夠達(dá)到專屬靈敏、簡(jiǎn)便操作等要求，并能夠在制劑工廠以及各地檢測(cè)機(jī)構(gòu)或醫(yī)院的條件下對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行檢查，針對(duì)這樣的要求我們建立了一個(gè)新的檢測(cè)復(fù)方頭孢他啶舒巴坦鈉的方法。
發(fā)明內(nèi)容我們釆用在工廠、藥品檢驗(yàn)所、醫(yī)院等單位的條件下容易開展的高效液相色譜法(HPLC)，通過優(yōu)化流動(dòng)相、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)等指標(biāo)，建立了一種新的檢測(cè)方法，這種方法可以同時(shí)檢測(cè)復(fù)方頭孢他啶舒巴坦鈉中兩種單一成分的含量和有關(guān)物質(zhì)，而不會(huì)出現(xiàn)兩種成分相互影響與干擾，該方法簡(jiǎn)便易行、操作步驟少，方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、線性范圍大、重復(fù)性好等，可用于復(fù)方制劑和原料的常規(guī)檢測(cè)。專利實(shí)例實(shí)施例一、復(fù)方原料與制劑的初步檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用"注射用頭孢他啶舒巴坦鈉"，比例為2:1，規(guī)格為2.0g，因其他配比和規(guī)格在制劑上簡(jiǎn)單的裝量變化，其原料來源、制備工藝均無顯著差異。故用該配比、規(guī)格樣品進(jìn)行研究。試驗(yàn)樣品為白色或類白色粉末或結(jié)晶性粉末，進(jìn)行以下各種試驗(yàn)。1、鑒別試驗(yàn)該復(fù)方中有鈉離子的存在，故灼燒時(shí)應(yīng)呈現(xiàn)鈉鹽的火焰反應(yīng)。取鉑絲，用鹽酸濕潤(rùn)后，蘸取本品，在無色的火焰中燃燒，火焰即顯鮮黃色。碳酸鹽化學(xué)鑒別因本品的頭孢他啶原料中已混有碳酸鈉，加強(qiáng)酸能使碳酸根游離成碳酸并分解成為二氧化碳，二氧化碳又與鈣離子復(fù)合生成沉淀。取本品適量，加稀酸，即泡騰，發(fā)生二氧化碳，導(dǎo)入氫氧化鈣試液中，生成白色沉淀。兩種組分舒巴坦鈉和頭孢他啶極性不同，可通過HPLC法進(jìn)行分離，并用對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照鑒別。取本品和舒巴坦和頭孢他啶的標(biāo)準(zhǔn)品，分別用流動(dòng)相制成每lml含0.48mg頭孢他啶和0.08mg舒巴坦鈉的溶液，按照本專利以下描述的含量測(cè)定項(xiàng)下高效液相色譜法試驗(yàn)，結(jié)果供試品峰與對(duì)照品峰一致。(試驗(yàn)方法見實(shí)施例二、三)2.檢測(cè)試驗(yàn)試驗(yàn)樣品酸度檢査取試驗(yàn)樣品加注射用水制成每ml含lOOmg的溶液，用酸度計(jì)測(cè)定，結(jié)果試驗(yàn)樣品的pH在5.5—7.5之間，為合格產(chǎn)品。試驗(yàn)樣品溶液澄清度檢査取試驗(yàn)樣品5瓶，分別加水制成每lml中約含本品0.lg的溶液，與1號(hào)濁度標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比較，檢查澄清度。結(jié)果試驗(yàn)樣品為澄明液體，未超過l號(hào)濁度標(biāo)準(zhǔn)液，澄清度符合相關(guān)規(guī)定，為合格樣品。試驗(yàn)樣品溶液顏色檢查取試驗(yàn)樣品5瓶，加水溶解，置于25ml的納氏比色管中，加水稀釋至10ml，與黃色色調(diào)標(biāo)準(zhǔn)比色液比較。結(jié)果試驗(yàn)樣品為澄明液體，顏色不深于6號(hào)黃色或黃綠色標(biāo)準(zhǔn)比色液，符合相關(guān)規(guī)定，為合格樣品。試驗(yàn)樣品澄明度檢查取試驗(yàn)樣品本品五瓶，分別加水制成每ml中含100mg的溶液，置光照度為10001500Lx的澄明度檢查儀上檢査，不合格率均小于5%，符合澄明度檢查細(xì)則和判斷標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，為合格樣品。試驗(yàn)樣品水分檢査取試驗(yàn)樣品lg,按水分檢測(cè)法測(cè)定，結(jié)果試驗(yàn)樣品水分含量均在9%左右符合標(biāo)準(zhǔn)，為合格樣品。由于該制劑是由無菌原料直接分裝的，所以，原料與制劑的成分、含量上完全一樣，沒有差別，采用本專利的檢測(cè)方法對(duì)復(fù)方的原料進(jìn)行的檢測(cè)，得到與制劑相同的結(jié)果。實(shí)施例二、制劑的分析和質(zhì)量控制方法為控制產(chǎn)品的質(zhì)量，必須對(duì)產(chǎn)品中的有可能出現(xiàn)的雜質(zhì)進(jìn)行分析研究。之前由于沒有將兩個(gè)物質(zhì)混合在一起使用的經(jīng)驗(yàn)，所以現(xiàn)有的資料也只有對(duì)單一頭孢他啶(或舒巴坦鈉)中有關(guān)雜質(zhì)的檢驗(yàn)方法。這樣的檢驗(yàn)方法雖然是對(duì)單一物質(zhì)檢驗(yàn)有效，但是否能夠檢驗(yàn)混合物中的有關(guān)雜質(zhì)還不清楚，因?yàn)橹苽涑苫旌现苿┮院髢煞N主要成分是否會(huì)相互影響對(duì)方的檢測(cè)，兩種雜質(zhì)是否也會(huì)影響對(duì)方的檢測(cè)有很多不確定因素，需要進(jìn)行大量的試驗(yàn)來驗(yàn)證。所以，我們根據(jù)頭孢他啶、舒巴坦鈉單一物質(zhì)檢測(cè)方法，建立了相應(yīng)的對(duì)復(fù)方物質(zhì)中雜質(zhì)的檢測(cè)方法。1、有關(guān)雜質(zhì)物質(zhì)檢測(cè)由于HPLC方法已經(jīng)能夠很好地用于單一的兩種成分檢測(cè)，因此我們采用HPLC方法建立復(fù)方的雜質(zhì)檢測(cè)方法。試驗(yàn)首先進(jìn)行破壞性試驗(yàn)，1)、酸破壞分別取頭孢他啶、舒巴坦鈉和注射用頭孢他啶舒巴坦鈉適量于10ml量瓶中，用0.1啦1/1鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖5勻，備用；2)、堿破壞分別取頭孢他啶、舒巴坦鈉和注射用頭孢他啶舒巴坦鈉適量，于10ml量瓶中，用0.lmol/1氫氧化鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用；3)、水解取注射用頭孢他啶舒巴坦鈉適量，于10ml量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，室溫條件下放置4小時(shí)，備用；4)、氧化分別取頭孢他啶、舒巴坦鈉和注射用頭孢他啶舒巴坦鈉適量，于10ml量瓶中，用水溶解后，加入0.5ml30%過氧化氫溶液，加水稀釋至刻度，搖勻，備用。取經(jīng)過上述四種破壞性試驗(yàn)的溶液精密量取5ml，置25ml量瓶中，用流動(dòng)相(配方見后)稀釋至刻度，在下述色譜條件下測(cè)試，檢測(cè)舒巴坦鈉、頭孢他啶是否有明顯降解，以降解產(chǎn)物峰與主峰分離〉2.0,頭孢他啶降解產(chǎn)物與舒巴坦鈉主峰分離度M.5為合格標(biāo)準(zhǔn)的判斷指標(biāo)。我們首先采用如下的色譜條件進(jìn)行篩選最佳的檢測(cè)方法-色譜條件(l):試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱:UltimateXB-NH2正相分析柱；規(guī)格5um，4.6*50咖；流動(dòng)相正己垸-氯仿溶液(2:1);檢測(cè)波長(zhǎng)220咖—260nra;流速0.13ral/min;進(jìn)樣量1030iU。色譜條件(2):試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱ZORBAXSB-C18250X4.6鵬，5um;流動(dòng)相乙腈-[磷酸二氫鉀溶液(0.03mol/L)-四丁基氫氧化銨溶液(10%)(795:15)(用磷酸調(diào)pH值為4.0)](9:91);檢測(cè)波長(zhǎng)220咖—260nm;流速0.13ml/min;進(jìn)樣量1030ul。色譜條件(3):試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱DiamonsilC18250X4.6咖5um;流動(dòng)相乙腈-磷酸二氫鉀溶液(0.015mol/L)-甲醇(10%)(290-305:675-690:35-5)(用磷酸調(diào)pH值為4.0);檢測(cè)波長(zhǎng)220nm一260咖;流速0.13ml/min;進(jìn)樣量1030p1。色譜條件(4):試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱DiamonsilC18250X4.6咖5um;流動(dòng)相乙腈-磷酸二氫鉀溶液(0.015mol/L)-乙醇(20%)(290-305:675-690:35-5)(用磷酸調(diào)pH值為4.0);檢測(cè)波長(zhǎng)220咖一260nm;流速0.l~3ml/min;進(jìn)樣量1030"1。采用上述方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，色譜條件(1)、(3)、(4)雖然也可以用于檢測(cè)但兩者的分離度都小于l.O，兩組分都分不開，而色譜條件(2)的分離度較好，但還需優(yōu)化。經(jīng)過三種破壞性試驗(yàn)的樣品在色譜條件(2)試驗(yàn)條件下舒巴坦鈉、頭孢他啶均無明顯降解，頭孢他啶雜質(zhì)峰與舒巴坦鈉主峰分離度〉1.5。哪是不是方法學(xué)不夠靈敏沒檢測(cè)出雜質(zhì)？還是本身就沒有出現(xiàn)雜質(zhì)？對(duì)此，我們首先采用LC-MS對(duì)樣品進(jìn)行了檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過上述破壞試驗(yàn)的樣品，在LC-MC檢測(cè)條件下也沒有發(fā)現(xiàn)有雜質(zhì)出現(xiàn)，說明本檢驗(yàn)方法是可靠。更進(jìn)一步，我們提取頭孢他啶峰、舒巴坦峰在200nm400nm的二極管陣列光譜圖，進(jìn)行峰純度檢査，結(jié)果頭孢他啶峰、舒巴坦峰的純度角均小于他們的純度閾值，表明頭孢他啶峰、舒巴坦峰均為純色譜峰。我們以上述溶液作為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)我們建立的HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化，最后確定了以下方法作為最佳鑒定方法試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱Z0RBAXSB-C18250X4.6咖，5um;流動(dòng)相乙腈-[磷酸二氫鉀溶液(0.03mol/L)-四丁基氫氧化銨溶液(10%)(795:15)(用磷酸調(diào)pH值為4.0)](9:91);檢測(cè)波長(zhǎng)230,流速lml/min;進(jìn)樣量10nl。我們以上述檢驗(yàn)方法，對(duì)檢驗(yàn)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如下樣品溶液制備取本品適量，精密稱定，用流動(dòng)相溶解制成每lml中含頭孢他啶0.48mg和舒巴坦鈉0.08mg的溶液，作為供試品溶液。精密量取0.33ml至10ml量瓶，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為對(duì)照溶液。精密量取供試品溶液lml，置100ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液10pl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分峰高為滿量程的2025%，再取供試品溶液20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。試驗(yàn)檢驗(yàn)了三批生產(chǎn)樣品有關(guān)物質(zhì)檢査結(jié)果均符合規(guī)定。結(jié)果見表1及圖廣3。表l有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)論由上表可知，三批供試品溶液所顯雜質(zhì)峰面積總和均不大于4.0%。2、頭孢他啶聚合物由于頭孢他啶還有聚合物產(chǎn)生，如果聚合物含量高會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生，需要在產(chǎn)品中控制聚合物的含量，按照相關(guān)要求必須對(duì)聚合物進(jìn)行檢測(cè)。以往，只有在單方頭孢他啶中進(jìn)行聚合物的檢測(cè)，還沒有關(guān)于復(fù)方頭孢他啶舒巴坦鈉混合后中進(jìn)行聚合物測(cè)定的研究報(bào)告，是否單方測(cè)定的條件可以準(zhǔn)確反應(yīng)復(fù)方中的情況，或者說，復(fù)方混合物是否會(huì)影響原來?xiàng)l件的檢測(cè)的準(zhǔn)確性，對(duì)此，我們也進(jìn)行了研究。我們首先進(jìn)行了頭孢他啶聚合物色譜條件與測(cè)定方法試驗(yàn)。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用葡聚糖凝膠G-10(40120um)為填充劑，玻璃柱內(nèi)徑為1.31.5cm，床體積為5060ml;流動(dòng)相A為磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鈉21.85g和磷酸二氫鈉5.38g，加水1000ml使溶解，混勻，調(diào)節(jié)pH值為7.0)，流動(dòng)相B為O.OW的十二烷基硫酸鈉溶液；流速為每分鐘lml;檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。以流動(dòng)相A為流動(dòng)相，用lmg/L藍(lán)色葡聚糖2000溶液進(jìn)樣200y1進(jìn)行測(cè)定，理論板數(shù)以藍(lán)色葡聚糖2000峰計(jì)算應(yīng)不低于700，拖尾因子應(yīng)在0.751.5之間。對(duì)照品溶液以流動(dòng)相B為流動(dòng)相，重復(fù)進(jìn)樣200ul，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)小于5.0%。對(duì)照品溶液的制備取頭孢他啶對(duì)照品約25mg，精密稱定，置250ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。測(cè)定法取本品約0.2g，精密稱定，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，立即取200ul注入色譜儀，以流動(dòng)相A為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖；另取對(duì)照品溶液200yl注入色譜儀，以流動(dòng)相B為流動(dòng)相，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算。舒巴坦鈉干擾性實(shí)驗(yàn)取舒巴坦鈉原料適量，精密稱定，加流動(dòng)相A溶解并制成每ml含舒巴坦20mg的溶液，作為供試品溶液，照頭孢他啶聚合物方法測(cè)定(見圖3)。結(jié)果表明舒巴坦鈉對(duì)本品頭孢他啶聚合物測(cè)定無干擾。檢出限取頭孢他啶對(duì)照溶液，依次稀釋成不同濃度，用上述色譜條件進(jìn)行檢觀lj，結(jié)果見附圖IO。頭孢他啶的檢出量為35ng，檢出限約為頭孢他啶量的0.009%。測(cè)定結(jié)果及限度取三批試制樣品，測(cè)定頭孢他啶聚合物，結(jié)果見表2及圖4—7。表2頭孢他啶聚合物檢査結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根據(jù)測(cè)試結(jié)果和注射用頭孢他啶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中擬定本品頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計(jì)不得過1.0%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這樣的情況，我們對(duì)于上述方法采用了LC-MS驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用上述方法測(cè)定的結(jié)果和LC-MS方法測(cè)定的結(jié)果能夠很好的對(duì)應(yīng)，說明復(fù)方藥物雖然是混合物，但是這樣的混合物并不影響原來測(cè)定聚合物方法的專屬性和靈敏度。實(shí)施例三、用于該復(fù)方制劑的新檢測(cè)方法的建立和制劑含量測(cè)定驗(yàn)證為控制產(chǎn)品的質(zhì)量，對(duì)復(fù)方制劑中兩個(gè)主要成分的含量控制是個(gè)重要指標(biāo)，對(duì)于單一頭孢他啶、舒巴坦鈉兩種含量檢測(cè)已經(jīng)有比較多的研究方法建立，中國(guó)藥典也有指定的方法。但是，在制備成混合物后，是否這樣的方法仍然能夠用于混合物中成分的檢測(cè)？或者說，混合物中兩個(gè)物質(zhì)是否會(huì)相互影響對(duì)方的檢測(cè)？這樣的問題尚無人進(jìn)行研究，其中還有很多不確定因素需要面對(duì)和解釋。對(duì)此，我們對(duì)于如何開展復(fù)方制劑中兩種成分的含量進(jìn)行檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。由于HPLC方法已經(jīng)能夠很好地用于單一的兩種成分檢測(cè)，同時(shí)HPLC方法也是中國(guó)藥典推薦的方法，因此，我們采用HPLC方法建立復(fù)方的兩個(gè)成分含量的檢測(cè)方法。色譜條件選用試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱Z0RBAXSB-C18250X4.6mm，5um;流動(dòng)相乙腈-[磷酸二氫鉀溶液(0.03mol/L)-四丁基氫氧化銨溶液(10%)(795:15)(用磷酸調(diào)pH值為4.0)](9:91);檢測(cè)波長(zhǎng)230nm;流速lml/min;進(jìn)樣量lOtil。流動(dòng)相的選擇和優(yōu)化本品為復(fù)方制劑，流動(dòng)相的選擇主要考慮兩主峰的出峰時(shí)間，分離效果以及主峰與雜質(zhì)峰的分離情況。優(yōu)化選用乙腈-磷酸二氫鉀溶液(0.015mol/L)-甲醇(10%)時(shí)，兩組份的分離度太小，而且頭孢他啶的保留時(shí)間過長(zhǎng)，不適于測(cè)定。適當(dāng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相組成。為避免頭孢他啶保留時(shí)間過長(zhǎng)，采用乙腈_[磷酸二氫鉀溶液(0.03mol/L)-四丁基氫氧化銨溶液(10%)(795:15)(用磷酸調(diào)pH值為4.0)](9:91)作為本品的流動(dòng)相，該流動(dòng)相能夠使樣品中的兩個(gè)組分有效檢出，分離度均大于1.5，能獲得較佳的分離效果。pH對(duì)色譜峰形狀與分離度的影響分別考察了不同pH條件下的流動(dòng)相對(duì)樣品的洗脫情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，頭孢他啶與舒巴坦隨流動(dòng)相pH的增高(大于4.2)，峰形變寬，柱效降低；若流動(dòng)相pH太低(小于3.8)，頭孢他啶與舒巴坦不能分離，因而流動(dòng)相的最佳pH值為4.0。流動(dòng)相比例對(duì)色譜峰形狀與分離度的影響分別考察了不同流動(dòng)相比例條件下的流動(dòng)相對(duì)樣品的洗脫情況，實(shí)驗(yàn)過程為乙腈作為A相，磷酸二氫鉀溶液(0.03mol/L)-四丁基氫氧化銨(10%)(795:15)(磷酸調(diào)節(jié)pH值4.0)作為B相，以注射用頭孢他啶舒巴坦鈉的水溶液作為待分離樣品，在不同比例的流動(dòng)相中各組份的保留時(shí)間、理論板數(shù)和分離度見表3及附圖17。表3不同流動(dòng)相比例對(duì)分離的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>綜合考慮兩組份的保留時(shí)間、理論板數(shù)以及各峰之間的分離度，選用乙腈一磷酸二氫鉀溶液(0.05mol/L)-四丁基氫氧化銨(10%)(795:15)(磷酸調(diào)節(jié)pH值4.0)(9:91)作為本色譜條件的流動(dòng)相的最佳比例。檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇和優(yōu)化:取頭孢他啶、舒巴坦對(duì)照品適量，分別加水溶解，在200400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果表明頭孢他啶在256nm波長(zhǎng)處有最大吸收，在220260nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)均有較強(qiáng)吸收；舒巴坦水溶液沒有明顯的最大吸收峰位，在240nm波長(zhǎng)以下范圍有吸收，在230nm以下吸收較強(qiáng)；頭孢他啶與舒巴坦在230nm波長(zhǎng)處有共同的強(qiáng)吸收，且舒巴坦鈉原料的含量測(cè)定HPLC法中所選波長(zhǎng)亦為230nm，因此本法選擇230nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。紫外掃描圖譜見附圖12。在上述研究的基礎(chǔ)上，我們采用選定的色譜條件首先進(jìn)行了系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，在上述色譜條件下,溶劑峰保留時(shí)間約3min，不干擾主成分測(cè)定。分別稱取頭孢他啶原料和舒巴坦鈉原料，按照含量測(cè)定方法制備單組份及混合組分的樣品溶液作為供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果頭孢他啶和舒巴坦的理論板數(shù)均大于3000,兩組份之間以及與其它雜質(zhì)峰之間的分離度均符合規(guī)定。我們進(jìn)一步對(duì)檢測(cè)方法的線性范圍進(jìn)行了研究-①頭孢他啶線性關(guān)系取頭孢他啶對(duì)照品適量，精密稱定，用水制成每lml含頭孢他啶3614.88ug的溶液，精密量取適量并用水稀釋制成每lml含頭孢他啶為18.07、90.37、180.74、451.86、722.98、903.72、1807.44和3614.88ug的溶液。分別取5ul，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見附圖18)。結(jié)果見表4，頭孢他啶濃度-峰面積線性關(guān)系圖見附圖32。表4頭孢他啶濃度與峰面積的關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)論在該色譜條件下，頭孢他啶濃度在18.073614.88yg/ml范圍內(nèi)，其峰面積A與濃度C呈良好線性關(guān)系。②舒巴坦線性關(guān)系考察取舒巴坦對(duì)照品適量,精密稱定，用流動(dòng)相制成每lral含舒巴坦3170iig的溶液，精密量取適量并稀釋成每lml含舒巴坦為31.7、63.41、158.52、317.03、475.55、634.06、1268.13、2536.26wg的溶液。分別取5ul，注入色譜儀，記錄色譜圖(見附圖19)。結(jié)果見表5，舒巴坦?jié)舛?峰面積線性關(guān)系見附圖31。表5舒巴坦?jié)舛扰c峰面積的關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)果表明，在該色譜條件下，舒巴坦?jié)舛仍?1.70ug/ml3675.25ug/ml之時(shí)，其峰面積A與濃度C呈良好線性關(guān)系。再進(jìn)一步，我們對(duì)這個(gè)檢測(cè)方法的精密度進(jìn)行了試驗(yàn)，分別取頭孢他啶對(duì)照品和舒巴坦對(duì)照品適量，加水制成每lml約含頭孢他啶0.67mg和舒巴坦0.33mg的混合溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，分別計(jì)算頭孢他啶和舒巴坦峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表6。表6精密度試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>我們對(duì)這個(gè)方法的靈敏度也進(jìn)行了最低檢測(cè)限(LOD)與最低定量限(LOQ)研究取線性考察項(xiàng)下溶液依次稀釋后進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)信噪比約為3:1時(shí)樣品的量為檢出限；當(dāng)信噪比約為10:1時(shí)樣品的量即為定量限。結(jié)果見表7及附圖21。表7檢出限及定量限結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>頭孢他啶的檢出限為0.21ng，舒巴坦的檢出限為56.6ng;定量限分別為0.63ng和O.17ng。我們還對(duì)這個(gè)檢測(cè)方法進(jìn)行了穩(wěn)定性試驗(yàn)，取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下的溶液，分別在O、2、6、12小時(shí)內(nèi)測(cè)定，記錄色譜圖，分別計(jì)算頭孢他啶和舒巴坦峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表8。表8穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>我們還進(jìn)行了樣品檢測(cè)的回收率試驗(yàn)，取已知含量的頭孢他啶原料和舒巴坦鈉原料，精密稱定，三水平各三份，分別置100ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，取溶液各進(jìn)樣三次，用回歸方程計(jì)算含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表9。表9含量測(cè)定回收率試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從上面的試驗(yàn)結(jié)果表明，我們建立的這個(gè)含量測(cè)定方法，具有靈敏度、穩(wěn)定性好，重復(fù)性高。是個(gè)理想的用于檢驗(yàn)復(fù)方藥物兩個(gè)成分的方法。由于該制劑是由無菌原料直接分裝的，所以，原料與制劑的成分、含量上完全一樣，沒有差別，采用本專利的檢測(cè)方法對(duì)原料進(jìn)行的檢測(cè)，得到與制劑相同的結(jié)果。實(shí)施例四、采用新的檢測(cè)方法對(duì)復(fù)方頭孢他啶舒巴坦鈉樣品進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)一步，我們采用這個(gè)新的檢驗(yàn)方法對(duì)三批GMP條件下生產(chǎn)的試驗(yàn)樣品含量測(cè)定。按照前述含量測(cè)定方法進(jìn)行，取本品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每ml含頭孢他啶0.5mg和含舒巴坦鈉0.25mg的溶液，精密量取10u1,注入色譜儀；另取頭孢他啶和舒巴坦鈉對(duì)照品適量，同法稀釋并測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算供試品中舒巴坦鈉和頭孢他啶的含量。A樣xW對(duì)x對(duì)％xW裝標(biāo)示量％x100%A對(duì)x樣xW樣x標(biāo)示量說明W對(duì)對(duì)照品的稱樣量，W樣樣品的稱樣量，W裝樣品的平均裝量，A標(biāo)對(duì)照品的峰面積，A樣樣品的峰面積，對(duì)％:對(duì)照品的純度，標(biāo)示量樣品的標(biāo)示量按上述色譜條件對(duì)三批樣品的含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表10及附圖25。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由于該制劑是由無菌原料直接分裝的，所以，原料與制劑的成分、含量上完全-樣，沒有差別，采用本專利的檢測(cè)方法對(duì)原料進(jìn)行的檢測(cè)，得到與制劑相同的結(jié)果<實(shí)施例五、新檢測(cè)方法對(duì)不同配比的復(fù)方原料與制劑的檢測(cè)采用上述實(shí)例建立的檢測(cè)方法，我們對(duì)不同配比的頭孢他啶舒巴坦鈉的復(fù)方制劑進(jìn)行了檢測(cè)，以觀察這樣的方法是否可以用于不同的配比的復(fù)方制劑的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于頭孢他啶/舒巴坦鈉20:1，10:1，8:1,6:1，4:1，5:1，3:1，2:1，1:1,1:2，1:4，1:5，1:6,1:8，1:10，1:20等17個(gè)不同配比的樣品的檢測(cè)，本專利建立的新方法均能很好的對(duì)兩個(gè)組成成分進(jìn)行測(cè)定，該方法有很好的靈敏度和可靠性。由于該制劑是由無菌原料直接分裝的，所以，原料與制劑的成分、含量上完全一樣，沒有差別，采用本專利的檢測(cè)方法對(duì)復(fù)方的原料進(jìn)行的檢測(cè)，得到與制劑相同的結(jié)果。實(shí)施例六、采用該種檢驗(yàn)方法評(píng)判為合格制劑的進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果根據(jù)GMP規(guī)范進(jìn)行三批樣品制備，按照本專利實(shí)例一、二、三的方法對(duì)三批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，采用上述標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格的制劑樣品進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，檢査通過上述新檢測(cè)方法檢驗(yàn)合格的樣品是否能夠符合動(dòng)物試驗(yàn)的要求。試驗(yàn)樣品首先進(jìn)行無菌檢查。在無菌室內(nèi)進(jìn)行無菌操作，取三批試驗(yàn)樣品各6支，分別加入100ml0.9M無菌氯化鈉溶液使溶解，搖勻，打開濾器蓋，在火焰旁打開樣品供試液的塞子使瓶口通過火焰，立即倒入濾器中，并閉濾器蓋，打開排液架的閥門，啟動(dòng)真空泵進(jìn)行減壓抽濾，待干后，用滅菌生理鹽水照上述操作沖洗濾膜3次，每次100ml。打開抽氣瓶排氣管，將過濾器取下，用滅菌鑷子將濾膜取出放入滅菌雙碟中。用滅菌剪刀將濾膜平均分成3份，分別置于各含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中一份做陽性對(duì)照。按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)。結(jié)果無細(xì)菌生長(zhǎng)，無菌試驗(yàn)符合規(guī)定，為合格產(chǎn)口叩o試驗(yàn)樣品進(jìn)行異常毒性檢查取三批試驗(yàn)樣品，加氯化鈉注射液制成每lml中含0.15g的溶液，取15只小鼠分成三組，每組5只尾靜脈注射同一批號(hào)的溶液0.5ml，觀察48小時(shí)的內(nèi)無異常反應(yīng)也無死亡，結(jié)果為合格產(chǎn)品。試驗(yàn)樣品進(jìn)行熱原檢查取三批試驗(yàn)樣品，加滅菌注射用水制成每lml中含0.15g的溶液，取9只家兔分成3組，每組3只，測(cè)定其正常體溫后15分鐘內(nèi)，劑量按家免體重每lkg注射lml，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫?zé)嶂?8°C的供試品溶液,然后每隔30分鐘測(cè)量其體溫1次，共測(cè)6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高溫度。各兔體溫升高均低于0.6X:，而且每組家兔體溫升高總和低于1.4'C，因此三批樣品可判斷為熱源檢査符合規(guī)定，三批樣品為合格產(chǎn)品。結(jié)果見表ll_表ll:熱原檢査結(jié)果_家兔體注射前家兔平均注射后家兔體溫批號(hào)結(jié)果SAT,結(jié)論重(Kg)體溫(。C)△U'c)2.738.70.3薩S04012.539.10.10.6符合規(guī)定2.638.80.22.439.00.2麗S04022.738.90.20,5符合規(guī)定2.239.10.12.738.70.2菌S04032.339.00.30.8符合規(guī)定2.539.10.:圖1是WMZS0401批有關(guān)物質(zhì)檢査圖譜圖3是柳ZS0403批有關(guān)物質(zhì)檢查圖譜圖5是頭孢他啶聚合物WMZS0401圖圖7頭孢他啶聚合物WMZS0403圖圖9是頭孢他啶線性與范圍圖圖11是舒巴坦精密度中濃度圖圖13是頭孢他啶精密度低濃度圖圖15是頭孢他啶精密度高密度圖圖17是舒巴的L0D與LQD圖圖19是舒巴坦回收率(100%)圖圖21是舒巴坦回收率(80%)圖圖23是標(biāo)準(zhǔn)品中舒巴坦圖圖25是WMZS0402舒巴坦含量圖圖27標(biāo)準(zhǔn)品中頭孢他啶圖圖29是WMZS0402頭孢他啶含量圖圖31是頭孢他啶線性圖圖2是WMZS0402批有關(guān)物質(zhì)檢査圖譜圖4是頭孢他啶聚合物對(duì)照液圖圖6是頭孢他啶聚合物ffMZS0402圖圖8是舒巴坦線性與范圍圖圖IO是舒巴坦精密度低濃度圖圖12是舒巴坦精密高濃縮圖圖14是頭孢他啶精密度中濃度圖圖16是頭孢他啶的LOD與LQD圖圖18是舒巴坦回收率(80%)圖圖20是舒巴坦回收率(120%)圖.圖22舒巴坦回收率(100%)圖圖24是WMZS0401舒巴坦含量圖圖26是WMZS0403舒巴坦含量圖圖28是WMZS0401頭孢他啶含量圖圖30是WMZS0403頭孢他啶含量圖圖32是舒巴坦線性圖。1權(quán)利要求1、一種新的用于頭孢他啶與舒巴坦鈉復(fù)方原料和制劑的檢測(cè)方法。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法采用高效液相色譜法，所采用的流動(dòng)相可以是正已垸，氯仿，二氯甲垸，四丁基氫氧化胺、乙腈、磷酸二氫鉀、甲醇、水等，其中優(yōu)選的采用磷酸二氫鉀、乙腈和四丁基氫氧化銨。3、根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法，其特征在于該方法所采用的檢測(cè)波長(zhǎng)可以是210260nm，優(yōu)選的波長(zhǎng)采用230咖。4、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3所述的方法，其特征在于該方法所采用的流動(dòng)相流速可以是0.13.Oml/niin，優(yōu)選地流速采用1.Oml/rain;5、根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述的方法，其特征在于該方法所采用的可以是胺基柱，氰基柱，十八垸基硅垸鍵合硅膠柱，八烷基硅垸鍵合硅膠柱，四垸基硅烷鍵合硅膠柱，苯基硅烷鍵合硅膠柱等；優(yōu)選地采用十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(C18柱)。6、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4、5所述的方法，其特征在于該方法對(duì)于不同比例的頭孢他啶舒巴坦鈉復(fù)方均能檢測(cè)，頭孢他啶舒巴坦鈉兩者成分的比例可以包括1:5050:1，優(yōu)選地用于1:2020:1。7、根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6所述的方法，其特征在于該方法可以用于頭孢他啶舒巴坦鈉復(fù)方的原料檢測(cè)，也可以用于該復(fù)方的制劑檢測(cè)。8、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7所述方法，這種檢測(cè)頭孢他啶舒巴坦鈉復(fù)方的方法，對(duì)兩個(gè)組分的含量及雜質(zhì)能很好地檢測(cè)，并且這樣的檢驗(yàn)不受另一成分的干擾，有很好的靈敏度、專屬性、簡(jiǎn)便易行，該方法可以用于制藥公司在該復(fù)方的原料與制劑生產(chǎn)過程中對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)量的檢測(cè)，也可以用于藥檢所、醫(yī)院等單位對(duì)制劑質(zhì)量的監(jiān)控。全文摘要一種新的高效液相色譜(HPLC)方法，可以同時(shí)檢測(cè)頭孢他啶舒巴坦鈉復(fù)方中兩種單一成分的含量及有關(guān)雜質(zhì)，兩種成分不相互干擾與影響，該方法操作簡(jiǎn)單易行，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，線性范圍大，穩(wěn)定性好，可用于復(fù)方制劑與原料的檢測(cè)。文檔編號(hào)G01N33/15GK101650356SQ20081003008公開日2010年2月17日申請(qǐng)日期2008年8月11日優(yōu)先權(quán)日2008年8月11日發(fā)明者孫明杰,霆王,鄧桂興,馬宏強(qiáng)申請(qǐng)人:廣州威爾曼新藥開發(fā)中心有限公司;湘北威爾曼制藥有限公司