專利名稱：葡萄球菌蛋白a活性比較試劑盒及活性比較方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及了一種比較葡萄球菌蛋白A 活性的ELISA試劑盒，以及一種葡萄球菌蛋白A的活性比較方法。
背景技術(shù)：
葡萄球菌蛋白A的發(fā)現(xiàn)從一開始就與IgG (免疫球蛋白G)相關(guān)聯(lián)，早在 1940年，Vevwey發(fā)現(xiàn)在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種在雙向擴散試驗中能 與正常人血清形成沉淀的物質(zhì)。Jensen (1959)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，并將其命名為 A抗原。直到1963年Lofkvist等分離了該抗原，并證明它是一種蛋白質(zhì)。為與 糖相區(qū)別，Grov (1960)將其命名為葡萄球菌蛋白A，簡稱葡萄球菌蛋白A或 葡萄球菌蛋白A。 1978年，有研究者將加熱滅活并經(jīng)福爾馬林固定的金黃色葡 萄球菌用于一種癌癥的治療，顯示出一定的療效，這是世界上第一次利用葡萄球 菌蛋白A的抗體吸附性治療相關(guān)疾病的報道。UWen等在1984年闡明了葡萄球 菌蛋白A的全基因序列和相應(yīng)的氨基酸序列。2003年，L.Yang等應(yīng)用表面張力 探針證明每個葡萄球菌蛋白A分子可結(jié)合兩個IgG分子。葡萄球菌蛋白A的基因編碼序列由1464個堿基組成(若加上氨基端信號肽 序列則為1572個堿基)，共編碼488個氨基酸，分子量約42KD。整個葡萄球菌 蛋白A分子包含六個結(jié)構(gòu)域E、 D、 A、 B、 C和X (從氨基端至羧基端)，其 中，E、 D、 A、 B、 C這五個結(jié)構(gòu)域均具備結(jié)合IgG的能力。X結(jié)構(gòu)域的作用是 將葡萄球菌蛋白A嵌合入金黃色葡萄球菌的細胞壁。葡萄球菌蛋白A可與人類和哺乳動物血清中的免疫球蛋白分子Fc段結(jié)合， 特別是IgG和含IgG的免疫復(fù)合物，這是一種非免疫反應(yīng)性結(jié)合，具有高度的 親和力。葡萄球菌蛋白A的應(yīng)用主要基于其抗體結(jié)合能力。將葡萄球菌蛋白A 通過化學(xué)方法交聯(lián)至各種支架結(jié)構(gòu)上，如與瓊脂糖凝膠共價耦合，能耐受溫度、 pH變化和變性劑的作用而不脫失。這種由葡萄球菌蛋白A和瓊脂糖凝膠合成的填料可用于抗體的分離純化。隨著免疫吸附血液凈化治療技術(shù)的快速發(fā)展，這種 合成填料逐漸被應(yīng)用于自身免疫疾病、惡性腫瘤、移植排斥等疾病的治療，當(dāng)患 者血漿通過時，基質(zhì)中葡萄球菌蛋白A可與血漿中致病性抗體，特別是IgG型 抗體結(jié)合，這是一種可逆性、pH敏感的結(jié)合，將pH降至2.3 2.5時，葡萄球 菌蛋白A與所結(jié)合抗體解離，抗體被洗脫清除，將pH恢復(fù)至7.0時，葡萄球菌 蛋白A又恢復(fù)吸附能力，這樣可不斷重復(fù)循環(huán)吸附致病性抗體，從而達到治療 疾病的目的，這種免疫吸附的方法稱為葡萄球菌蛋白A免疫吸附(Protein A Immunoadsorption ， PAIA)。由于金黃色葡萄球菌是致病菌，且葡萄球菌蛋白A在該菌體的含量并不高(約占細胞壁蛋白成分的6.7%)，因此，從發(fā)酵培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中提純葡 萄球菌蛋白A的方法風(fēng)險較大且難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要。近年來，人們開 始轉(zhuǎn)向采用基因工程法來生產(chǎn)葡萄球菌蛋白A，尋求既能避免致病菌的危險，又 能大規(guī)模生產(chǎn)葡萄球菌蛋白A的可行而有效的途徑。由于利用基因工程的方法 可制備出不同結(jié)構(gòu)的重組葡萄球菌蛋白A，它們與IgG結(jié)合的活性也不同，因此， 比較不同葡萄球菌蛋白A的活性，從而選擇具有高活性的重組葡萄球菌蛋白A， 并確保作為原料的葡萄球菌蛋白A符合活性質(zhì)量要求，對高性能的免疫吸附血 液凈化治療產(chǎn)品的生產(chǎn)至關(guān)重要。本發(fā)明利用ELISA技術(shù)建立了比較葡萄球菌蛋白A活性的試劑盒，該試劑 盒將待比較活性的葡萄球菌蛋白A樣品包被于ELISA板，再使人IgG與葡萄球 菌蛋白A結(jié)合，由于在相同用量的條件下，葡萄球菌蛋白A的活性越強，與之 結(jié)合的人IgG越多，與HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合并經(jīng)顯色反應(yīng)后，顏色的深淺程度(以A45。表示)與葡萄球菌蛋白A的活性成正比，這樣即可以比較不同葡萄球 菌蛋白A的活性大小。另外，在一定范圍內(nèi)根據(jù)葡萄球菌蛋白A的不同濃度的 及相應(yīng)的A450值作一曲線，則該曲線的斜率可以相對的表示該葡萄球菌蛋白A 活性的大小，這樣即可以將活性差異定量化。本發(fā)明的葡萄球菌蛋白A活性比較試劑盒適用于比較不同結(jié)構(gòu)葡萄球菌蛋 白A的活性并能將活性差異定量化，操作簡便快捷，結(jié)果可信度高。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種葡萄球菌蛋白A活性比較試劑盒，該試劑盒性能 穩(wěn)定，檢測準(zhǔn)確，使用方便。本發(fā)明所述的一種葡萄球菌蛋白A活性比較試劑盒，包括人IgG，辣根 過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG，包被緩沖液，封閉液，樣品稀釋液，洗 滌液，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液和終止液。本發(fā)明的另一個目的是提供一種葡萄球菌蛋白A的活性比較方法。該方法包括以下步驟1) 包被葡萄球菌蛋白A:用包被緩沖液將待比較的葡萄球菌蛋白A樣品稀釋至合適濃度，在ELISA板中每孔加入100pL， 37'C60min;根據(jù)一般情況下ELISA板的每個板孔能吸附的蛋白量，并保證葡萄球菌蛋 白A的用量與顯色的深淺程度(A450)成正比關(guān)系，經(jīng)實驗確定，葡萄球菌蛋白 A的合適濃度為0~100ng/mL。2) 封閉甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入封閉液，200pL/孔， 37°C 2hr;3) 加人IgG:甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入稀釋好的人IgG， 100pL/孔，37。C 60min;由于人IgG的用量必須使其與葡萄球菌蛋白A的結(jié)合達到飽和或過量，人 IgG的工作濃度為20嗎/mL。4) 加酶標(biāo)羊抗人IgG:甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入稀釋好 的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG， 10(^L/孔，37。C60min;5) 加底物顯色甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入TMB底物， 100nL/孔，37。C孵育15-30min;6) 讀數(shù)加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定OD450值。本發(fā)明利用葡萄球菌蛋白A與IgG結(jié)合的特性，采用間接ELISA方法建立 了一種有效的比較不同葡萄球菌蛋白A與IgG結(jié)合活性的試劑盒。所述試劑盒 可適用于不同來源的葡萄球菌蛋白A活性差異的比較，具有快速性、客觀性和 準(zhǔn)確性等優(yōu)點。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了不同葡萄球菌蛋白A活性的比較方 法。目前比較不同結(jié)構(gòu)或來源的葡萄球菌蛋白A活性多采用將葡萄球菌蛋白A5偶聯(lián)于瓊脂載體上制成吸附柱，測其吸附IgG的含量，此法步驟繁瑣、技術(shù)復(fù)雜、 耗時長，而本發(fā)明利用ELISA方法比較不同葡萄球菌蛋白A的活性，簡便快捷，準(zhǔn)確性高。


圖1是本發(fā)明的原理示意圖。圖中1.酶聯(lián)反應(yīng)板，2.包被葡萄球菌蛋白 A， 3.人IgG， 4. HRP標(biāo)記羊抗人IgG。圖2是利用本發(fā)明的試劑盒比較不同葡萄球菌蛋白A與IgG結(jié)合活性差異 的結(jié)果圖。
具體實施方式
以下通過實施例結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明，這并不限制本發(fā) 明的保護范圍。實施例一葡萄球菌蛋白A活性比較試劑盒的制備本發(fā)明所述的一種葡萄球菌蛋白A活性比較試劑盒，如圖1所示，包括人IgG,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG，包被緩沖液，封閉液，樣 品稀釋液，洗滌液，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液和終止液。 1 ) 制備人IgG:用本發(fā)明申請人制備的葡萄球菌蛋白A瓊脂糖凝膠吸附填料 從人血漿中分離純化人IgG，純度在90%以上。2) HRP標(biāo)記的羊抗人IgG和TMB顯色液，購自武漢博士德生物工程有限 公司。3) 制備以下溶液包被緩沖液35mmol/LNaHC03， 15mmol/L Na2C03， pH 9.6 封閉液lxPBS， 1%BSA樣品稀釋液lxPBS， 0.1%BSA， 0.05%Tween-20， pH 7.2±0.2 洗滌液lxPBS， 0.05% Tween-20 終止液2mol/LH2S04葡萄球菌蛋白A活性比較試劑盒由上述試劑組成。實施例二利用本發(fā)明的試劑盒比較不同葡萄球菌蛋白A與IgG結(jié)合活性的差 異1) 用包被緩沖液將待比較的葡萄球菌蛋白A配成濃度依次為50ng/mL， 25ng/mL， 12.5ng/mL， 6.25ng/mL， 3.125ng/mL的溶液。2) 各取上述溶液1004L加入96孔板，陰性對照以包被緩沖液代替樣品， 空白對照除底物外，其余反應(yīng)成分均不加入，每個濃度做2個重復(fù)。置于37QC lh。3) 甩掉板孔中溶液，每孔加入洗滌液200pL，振蕩3min，甩干，重復(fù) 洗漆4次，最后一次徹底甩干液體。4) 每孔加入封閉液lOO(aL，置于37Gcih。5) 洗滌，步驟同3)。6) 每孔加入人IgG溶液(用樣品稀釋液配至20pg/mL) 100pL，置于 370C lh。7) 洗滌，步驟同3)。8) 每孔加入羊抗人IgG-HRP溶液(稀釋20000倍)10(VL，置于3,C lh。9) 洗滌，步驟同3)。10) 每孔加入TMB顯色液100pL，置于37QC15min。11) 每孔加入終止液(2mol/LH2S04) lOOpL，終止反應(yīng)。12) 于酶標(biāo)儀中測定A450。本發(fā)明人通過基因工程法制備了不同的重組葡萄球菌蛋白A: SPA-B3、 SPA-B4、 SPA-B5、 SPA-B6，其所包含的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域依次增加。基于分子結(jié) 構(gòu)和功能關(guān)系的分析，預(yù)期上述葡萄球菌蛋白A的活性依次增強，且SPA-B4的 活性略低于天然葡萄球菌蛋白A (SigmaSPA，美國Sigma公司)，SPA-B5的活 性與天然葡萄球菌蛋白A相當(dāng)，SPA-B6的活性則高于天然葡萄球菌蛋白A。利 用本發(fā)明的試劑盒對上述不同葡萄球菌蛋白A的活性比較結(jié)果(圖2)顯示1) 僅從圖2中各曲線的發(fā)展趨勢(即不同葡萄球菌蛋白A的A450隨濃度增 加而上升的趨勢)就可以看出，活性比較結(jié)果符合預(yù)期。2) 通過計算，各曲線的斜率依次為0.0244 (SPA-B3)、 0.0291 (SPA-B4)、 0,0316 (SPA-B5)、 0.0325 (SigmaSPA)、 0.0366 (SPA-B6)，以SPA-B3的活性為1，則SPA-B4、SPA-B5、SigmaSPA、SPA-B6的活性依次為1.193、 1.295、 1.332禾卩1.5?？梢钥闯?，SPA-B4、 SPA-B5、 SPA-B6的活性分別 比SPA-B3高19.3%、 29.5%、 50%; SPA-B4的活性比SigmaSPA低10.5%， SPA-B5的活性僅比SigmaSPA低2.77%， SPA-B6的活性則比SigmaSPA 高12.6%。以上結(jié)果也符合預(yù)期。 3) 分別將SPA-B3、 SPA-B4、 SPA-B5、 SPA-B6通過化學(xué)方法與瓊脂糖凝膠 交聯(lián)，合成葡萄球菌蛋白A瓊脂糖凝膠吸附填料，并進行抗體吸附試驗， 結(jié)果顯示，每毫升填料的抗體吸附量依次約為20mg (SPA-B3)、 24mg (SPA-B4)、27mg(SPA-B5)、30mg(SPA-B6)，據(jù)此計算，SPA-B4、 SPA-B5、 SPA-B6的活性分別比SPA-B3高20%、 35%、 50%，此結(jié)果很好地驗證了 利用本發(fā)明的試劑盒對上述不同葡萄球菌蛋白A的活性比較結(jié)果的正確 性。
權(quán)利要求
1.一種葡萄球菌蛋白A活性比較試劑盒，包括人IgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG，包被緩沖液，封閉液，樣品稀釋液，洗滌液，四甲基聯(lián)苯胺顯色液和終止液。
2. —種葡萄球菌蛋白A的活性比較方法，包括以下步驟1) 包被葡萄球菌蛋白A:用包被緩沖液將待比較的葡萄球菌蛋白A樣品稀釋至合適濃度0~100ng/mL，在ELISA板中每孔加入100pL， 37°C 60min;2) 封閉甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入封閉液，200pL/孔， 37。C 2hr;3) 加人IgG:甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入稀釋好的人IgG， 人IgG的工作濃度為20|xg/mL， 100nL/孔，37°C 60min;4) 加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG:甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍 干，加入稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG， 100pL/孔，37°C 60min;5) 加底物顯色甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入四甲基聯(lián)苯胺底 物，100pL/孔，37。C孵育15-30min;6) 讀數(shù)加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定OD45Q值。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種葡萄球菌蛋白A活性比較試劑盒，主要包括人IgG，HRP標(biāo)記的羊抗人IgG，包被緩沖液，封閉液，樣品稀釋液等。該試劑盒利用葡萄球菌蛋白A與IgG結(jié)合的特性，采用間接ELISA的方法比較不同葡萄球菌蛋白A結(jié)合IgG的活性。本發(fā)明的葡萄球菌蛋白A活性檢測試劑盒適用于不同來源或結(jié)構(gòu)的葡萄球菌蛋白A活性差異的比較，并能將差異定量化，具有快速性、客觀性和準(zhǔn)確性等優(yōu)點，并為高性能的免疫吸附血液凈化治療產(chǎn)品的生產(chǎn)提供保證。
文檔編號G01N33/543GK101329351SQ20081002999
公開日2008年12月24日 申請日期2008年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月30日
發(fā)明者余波光, 張旭鋒, 楊東升, 苗 趙, 陳校園 申請人:廣州康盛生物科技有限公司