一種測定人血清中胃蛋白酶原i/ii含量的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種采用乳膠增強免疫比濁法測定人血清中胃蛋白酶原I和胃蛋白 酶原II含量的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃蛋白酶原（Pepsinogen，PG)是胃液中胃蛋白酶的無活性前體，是胃粘膜分泌的一種 門冬氨酸蛋白酶前體，是分子量42000Da的單鏈多肽，在胃內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘奈傅鞍酌浮?br>[0003] 根據(jù)生化性質(zhì)、免疫原性、細(xì)胞來源及組織內(nèi)分布，胃蛋白酶原可分成胃蛋白 酶原I(PGI)、胃蛋白酶原II(PGII)兩個亞群：其中1~5組分免疫原性近似，稱為 PGI(PGA)，主要由胃底腺的主細(xì)胞和頸粘液細(xì)胞分泌；6~7組分被稱為PGII(PGC)，除 由上述兩種細(xì)胞分泌外，幽門腺的黏液細(xì)胞、賁門腺以及十二指腸上段的Brunner腺也能 產(chǎn)生PGII，胃粘膜合成的PGII約為總量的25%。
[0004]目前檢測血清胃蛋白酶原含量的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)、放射免 疫分析（RIA)、化學(xué)發(fā)光法和膠乳免疫比濁法等。
[0005]ELISA方法精確、定量，具有很高的敏感性，但操作程序繁瑣，耗時長，不能適應(yīng)大 規(guī)模體檢篩查或急診的需要；RIA方法靈敏度高，特異性強，但放射免疫反應(yīng)是競爭性的反 應(yīng)，測得的值是相對量而非絕對量，且存在輻射和放射性污染；化學(xué)發(fā)光法精確度高，檢測 速度快，但成本高昂，對配套設(shè)施要求高，無法應(yīng)用于廣大中、基層的醫(yī)院和醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)； 膠乳免疫比濁法具有操作簡便快速、自動化、定量準(zhǔn)確、敏感度高等優(yōu)點，可滿足門、急診和 大規(guī)模體檢篩查等需要。
[0006] 現(xiàn)有膠乳免疫比濁試劑，由于其檢測原理是測定反應(yīng)形成的免疫復(fù)合物的濁度， 因此極易受到乳糜干擾的影響。目前應(yīng)對這個問題的方法，主要是使用專門的乳糜消除劑 對樣本進行預(yù)處理。而在大規(guī)模的人群普查、健康體檢篩查和臨床病人檢驗時，經(jīng)常會遇到 大量的乳糜、溶血等渾濁樣本，此時通過購置樣本處理劑，對這些樣本進行單獨處理，將會 極大地增加操作人員的工作量，提高運營成本，也為臨床檢驗的組織安排帶來難題。中國專 利文獻CN103698525A公開了一種試劑盒，利用脂肪酶或聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂來消除乳 糜干擾，這種方法提高了試劑盒的抗乳糜干擾能力，但是對于重型乳糜檢測效果不夠理想； 其次，僅公開了適用胃蛋白酶原I的方法，沒有提及胃蛋白酶原II。
[0007]因此，研制一種能夠更好地消除乳糜干擾的膠乳免疫比濁法的胃蛋白酶原I/II檢測試劑盒，顯得十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明實現(xiàn)了以下技術(shù)： 一種測定人血清中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II含量的試劑盒，包含試劑Rl，R2以及 校準(zhǔn)液；所述試劑Rl為PH值為7. 2-8. 6的緩沖液，所述試劑R2為抗人PGI抗體膠乳試劑 或抗人PGII抗體膠乳試劑；所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有定量的PGI或PGII的重組蛋白或者是從人 血清中提取出來的天然PGI或PGII;其特征在于，所述試劑盒還包括用于消除乳糜的試劑 R3,所述試劑R3的由辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸 菊聚糖鎂組成。
[0009] 所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂100-200。
[0010] 所述的PGI/PGII檢測試劑盒中的Rl試劑主要包含緩沖液，無機鹽，加速劑和防 腐劑。
[0011] 所述的PGI/PGII檢測試劑盒中R2試劑主要包含穩(wěn)定劑，抗人單（多）克隆抗 體膠乳顆粒，緩沖液，穩(wěn)定劑和防腐劑。其中乳膠微球直徑為80-200nm。
[0012] 試劑Rl所述的無機鹽選自氯化鈉，氯化鉀，硫酸鉀一種或幾種。緩沖液為：Tris緩 沖液，MES緩沖液，磷酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中一種或幾種。 加速劑為聚乙二醇4000,聚乙二醇6000,聚乙二醇8000中一種或幾種。
[0013] 試劑R2所選用的抗體為鼠抗人PGI/PGII單克隆抗體，羊抗人PGI/PGII單克 隆抗體，兔抗人PGI/PGII單克隆抗體一種或者幾種混合。也可以選鼠抗人PGI/PGII 多克隆抗體，羊抗人PGI/PGII多克隆抗體，兔抗人PGI/PGII多克隆抗體其中一種。
[0014] 試劑R2中的穩(wěn)定劑選自小牛白蛋白，明膠，甘氨酸，吐溫20,曲拉通中的一種或者 幾種。
[0015] 本發(fā)明所述的試劑R2為抗人PGI/PGII抗體膠乳試劑，采用的是抗人的PGI/ PGII抗體與膠乳顆粒相偶聯(lián)。經(jīng)過離心（過濾）的方法去掉未反應(yīng)的偶聯(lián)劑以及未反應(yīng)的 抗體，在含有穩(wěn)定劑和防腐劑的緩沖液中分散而成。 所述抗人PGI抗體和抗人PGII抗體的膠乳試劑的制備包括以下步驟： 步驟1 :將羧化的膠乳在PH7. 0的溶液活化； 步驟2 :洗滌去掉溶液中的碳化二亞胺，加PH7. 5-9. 0的緩沖液，加入PGI或PGII抗體， 在37度反應(yīng)4小時； 步驟3 :將步驟2所得的液體用PH7. 5-9. 0的固定液固定6小時； 步驟4 :將步驟3所得的液體用PH7. 5-9. 0的封閉液體封閉12小時； 步驟5 :將步驟4所得的液體離心去上清液，取沉淀后用含有穩(wěn)定劑和防腐劑的緩沖液 洗滌分散既得。
[0016] 步驟1中所用的緩沖液為PBS緩沖液，MES緩沖液，Tris緩沖液中的任何一種緩沖 液，且濃度在20-100mmol/L，PH在6. 5-7. 5之間。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟1中所用的膠乳可以是羧基化的聚苯乙烯膠乳或者是氨基化的聚 苯乙稀膠乳。其孔徑在80nm-200nm均可。
[0018] 作為優(yōu)選，步驟1中含有1- (3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺、1- (3-二甲基 氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽或N-羥基硫代琥珀酰亞胺中的一種或者多種。
[0019] 作為優(yōu)選，在步驟5中，所用的穩(wěn)定劑是小牛血清白蛋白，明膠，甘氨酸，脫脂奶粉 一種或者幾種相混合。
[0020] 本發(fā)明檢測的原理是：利用抗原抗體反應(yīng)，先加入試劑Rl，使血清中的PGI和PGII 的位點暴露，當(dāng)加入抗人的PGI或PGII膠乳顆粒溶液，使溶液中的抗原抗體反應(yīng)形成不溶 于溶液的抗原抗體復(fù)合物，從而產(chǎn)生一定的濁度，在人血清中PGI或PGII的含量在一定的 范圍內(nèi)PGI或PGII的含量與池度成正比。再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進行計算，從而得到PGI或PGII 的含量。
[0021] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下特點： 1)本發(fā)明試劑盒具有較高的檢測靈敏度，PGI試劑盒最低檢測能夠達到3ng/ml，PGII試劑盒的最低檢測能夠達到2ng/ml。操作簡單、快速，從檢測到出結(jié)果最多只需要5分 鐘，甚至更短。
[0022] 2)本發(fā)明的試劑盒R2試劑中的抗體膠乳的制備由于采用的化學(xué)偶聯(lián)法，穩(wěn)定性 好，在2-8度至少可以保存12個月。
[0023] 3)本發(fā)明試劑盒與進口試劑盒對樣品中的PGI或PGII含量檢測的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計分 析，無顯著性差異，檢測結(jié)果可靠，在臨床上可以替代進口試劑，大幅降低成本以及檢測時 間。 4)本發(fā)明試劑盒抗乳糜干擾能力極強，可適用于含有重度乳糜的檢測。
【具體實施方式】
[0024] 下面以具體的實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0025] 實施例1 一種測定人血清中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II含量的試劑盒，包含試劑Rl，R2以及 校準(zhǔn)液；所述試劑Rl為PH值為7. 2-8. 6的緩沖液，所述試劑R2為抗人PGI抗體膠乳試劑 或抗人PGII抗體膠乳試劑；所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有定量的PGI或PGII的重組蛋白或者是從人 血清中提取出來的天然PGI或PGII;其特征在于，所述試劑盒還包括用于消除乳糜的試劑 R3,所述試劑R3的由辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸 菊聚糖鎂組成。
[0026] 所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯20 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂100。
[0027] 對添加了不同乳糜單位濃度的血清樣本進行對照測定，重復(fù)3遍，計算均偏差。偏 差范圍在±10%以內(nèi)視為無干擾，偏差范圍超過±10%視為干擾。
[0028] 表1未添加R3試劑的的血清樣本結(jié)果
表1結(jié)果顯示，隨乳糜濁度從O到8000的范圍變化，試劑盒A的檢測值偏差也隨 之增大，但小于10%，而當(dāng)乳糜濁度單位大于8000時，檢測值與未添加干擾時檢測值的偏差 均大于10%，判定為存在干擾。
[0029] 表2結(jié)果顯示，隨乳糜濁度從0到16000的范圍變化，試劑盒B的檢測值偏 差的變化較小，檢測值與未添加干擾時檢測值的偏差均在±10%以內(nèi)，判定為不存在干 擾。
[0030] 本試驗顯示了相比現(xiàn)有的免疫比濁方法試劑盒，本發(fā)明所述的胃蛋白酶原檢測試 劑盒明顯提高了對乳糜的抗干擾能力。
[0031] 實施例2 與實施例1不同的是： 所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂200。
[0032] 實施例3 與實施例1不同的是： 所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯30 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚40 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂120。
[0033] 實施例4 與實施例1不同的是： 所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯40 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚70 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂150。
[0034]實施例5 與實施例1不同的是： 所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯35 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚55 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂115。
【主權(quán)項】
1. 一種測定人血清中胃蛋白酶原I/II含量的試劑盒，包含試劑R1，R2以及校準(zhǔn)液；所 述試劑Rl為PH值為7. 2-8. 6的緩沖液，所述試劑R2為抗人PGI抗體膠乳試劑或抗人PGII 抗體膠乳試劑；所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有定量的PGI或PGII的重組蛋白或者是從人血清中提取 出來的天然PGI或PGII;其特征在于，所述試劑盒還包括用于消除乳糜的試劑R3,所述試 劑R3的由辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂組 成。2. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的試劑盒，其特征在于所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂100-200。
【專利摘要】一種測定人血清中胃蛋白酶原I/II含量的試劑盒，包含試劑R1，R2以及校準(zhǔn)液；所述試劑R1為PH值為7.2-8.6的緩沖液，所述試劑R2為抗人PGI抗體膠乳試劑或抗人PGII抗體膠乳試劑；所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有定量的PGI或PGII的重組蛋白或者是從人血清中提取出來的天然PGI或PGII;其特征在于，所述試劑盒還包括用于消除乳糜的試劑R3，所述試劑R3的由辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂組成。本發(fā)明試劑盒具有較高的檢測靈敏度，抗乳糜干擾能力極強，可適用于含有重度乳糜的檢測。
【IPC分類】G01N33/573
【公開號】CN105067815
【申請?zhí)枴緾N201510588756
【發(fā)明人】梁朝陽
【申請人】浙江凱成生物科技有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年9月16日