一種檢測(cè)原代神經(jīng)干細(xì)胞遷移極化的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及神經(jīng)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種檢測(cè)原代神經(jīng)干細(xì)胞迀移極化的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cell，NSCs)是一種未分化、多潛能、具有自我更新能力的神經(jīng)前體細(xì)胞，可進(jìn)一步分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。此外，NSCs經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞分裂后，仍能穩(wěn)定地保持自身的特性。Sally Temple于1989年首次發(fā)現(xiàn)，在小鼠室管膜下區(qū)(subventricular zone, SVZ)存在自我更新能力和多向潛能的細(xì)胞。1992年，Reynolds B.A.首次從成年小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離出NSCs，并引起人們的廣泛關(guān)注。NSCs存在于動(dòng)物腦內(nèi)的很多部位，包括哺乳動(dòng)物胚胎期的大腦皮質(zhì)、海馬、嗅球、紋狀體等處，另外，在成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)的顆粒下層中也分離出NSCs。
[0003]細(xì)胞迀移，是細(xì)胞在接收到迀移信號(hào)后，通過(guò)一系列黏附與去黏附過(guò)程，在基質(zhì)表面產(chǎn)生的整體位移，是一種重要的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象。根據(jù)迀移的方式可分為無(wú)規(guī)律的自由迀移(free/random migrat1n)和定向遷移(direct1nal migrat1n)。近年的研究表明，不僅在哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育過(guò)程中，而且在神經(jīng)系統(tǒng)疾病狀態(tài)下NSCs都存在有序的定向迀移能力。在胚胎期中，神經(jīng)上皮細(xì)胞不斷向大腦皮層迀移，進(jìn)一步分化為神經(jīng)元，并形成大腦的基本神經(jīng)構(gòu)成。新生動(dòng)物的海馬和側(cè)腦室中的NSCs不斷迀移并分化新的神經(jīng)元，維持海馬和嗅球的神經(jīng)功能；成年動(dòng)物的NSCs處于相對(duì)靜息的狀態(tài)，僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、缺血等病理因素的作用下才被激活和迀移到受損部位發(fā)揮其功能。NSCs的定向迀移不僅對(duì)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育具有至關(guān)重要的作用，對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)也有重大的意義。有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病理改變后，NSCs會(huì)特異性地迀移到損傷部位并可分化并替代缺失的細(xì)胞，與其它的神經(jīng)元建立通路，從而使受損腦組織達(dá)到解剖和功能上的修復(fù)，這無(wú)疑為中樞神經(jīng)疾病的治療帶來(lái)了希望的曙光。目前與NSCs迀移的相關(guān)因素很多:包括細(xì)胞周圍環(huán)境、細(xì)胞間通訊、細(xì)胞代謝產(chǎn)物、NSCs自身及鄰近或遠(yuǎn)隔部位其它細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子、黏附因子、激素和遞質(zhì)等，但定向迀移的具體機(jī)制還不完全清楚，因此了解NSCs定向迀移的機(jī)制對(duì)于利用NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病是必須的。
[0004]細(xì)胞迀移的機(jī)制主要涉及到細(xì)胞骨架和其結(jié)合蛋白以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的變化，在迀移信號(hào)分子的濃度梯度和胞外基質(zhì)的密度梯度等外界信號(hào)的刺激下，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞分子和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)分子產(chǎn)生不對(duì)稱的分布和/或激活，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的形態(tài)、分布和細(xì)胞器的定位在即將發(fā)生迀移的方向上表現(xiàn)出前后不對(duì)稱型，這一過(guò)程被稱作迀移細(xì)胞的極性化(polarizat1n)，細(xì)胞由此分化出運(yùn)動(dòng)的前段和后部，之后在前段形成迀移所需的特殊結(jié)構(gòu)-偽足，粘著斑(focal adhes1n，F(xiàn)A)。在極化過(guò)程中涉及多個(gè)信號(hào)通路和它們下游效應(yīng)因子的作用，而不同信號(hào)通路的作用又必須緊密配合，形成精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，保證極化及迀移的每個(gè)步驟能正確完成并密切銜接，而Rho家族小GTP酶(small GTPase)在細(xì)胞迀移的協(xié)調(diào)過(guò)程中扮演了關(guān)鍵性的角色，尤其Racl蛋白在細(xì)胞迀移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種檢測(cè)原代神經(jīng)干細(xì)胞迀移極化的方法。
[0006]本發(fā)明的再一的目的是，提供上述方法的用途。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
[0008]一種檢測(cè)原代神經(jīng)干細(xì)胞迀移極化的方法，包括如下步驟:
[0009]a.在模具上用二甲基硅氧烷制備下表面有平行顯微通道的PDMS印章；
[0010]b.條帶包被，取消毒的玻片放入培養(yǎng)皿中，加入多聚賴氨酸進(jìn)行包被，將制備好的PDMS印章扣在多聚賴氨酸包被的玻片上，將需要研究的導(dǎo)向因子用FITC-BSA稀釋到作用濃度，然后加入到印章的微通道一端，于通道另一端抽吸使溶液充滿整個(gè)通道，待溶液干后，移除印章，在玻片上形成含有導(dǎo)向因子的平行條帶；
[0011]c.在包被好熒光條帶的玻片上進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)；
[0012]d.使用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行染色，觀察條帶間隙中神經(jīng)干細(xì)胞貼壁后偽足的方向，計(jì)算神經(jīng)干細(xì)胞前端與后端的偽足面積比值，判斷神經(jīng)干細(xì)胞是否極化。
[0013]所述PDMS印章下表面的通道寬為60 μ m、高為100 μ m，每個(gè)平行的通道之間間隔為 90 μ??ο
[0014]所述步驟b中多聚賴氨酸濃度為0.lmg/ml。
[0015]所述判斷神經(jīng)干細(xì)胞是否極化的方法為:當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞前端與后端的偽足面積比值為0.8-1.2時(shí)為未極化；當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞前端與后端的偽足面積比值多1.2時(shí)發(fā)生極化。
[0016]所述的導(dǎo)向因子為對(duì)神經(jīng)纖維有導(dǎo)向作用的因子，所述的導(dǎo)向因子為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)、BDNF (腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)、MAG(乙酰膽堿)。
[0017]為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
[0018]如上任一所述的方法在檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞迀移極化中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
[0020]本發(fā)明的方法不僅有助于使神經(jīng)干/祖細(xì)胞迀移起始-極化可視化，而且對(duì)極化定量分析及機(jī)制的探討具有潛在的開發(fā)價(jià)值。在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，檢測(cè)不同分子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞迀移極化的影響，同時(shí)探索迀移極化的具體分子機(jī)制，然后通過(guò)外源性給予細(xì)胞分泌因子，啟動(dòng)體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的迀移等功能，為神經(jīng)干細(xì)胞治療神經(jīng)退行性疾病奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0021]附圖1為本發(fā)明示意圖；其中A部分為PDMS印章的制備；B部分為條帶包被。
[0022]附圖2為趨化因子CXCL12介導(dǎo)的神經(jīng)祖細(xì)胞極化共聚焦拍照?qǐng)D片；其中A、B中的條帶只含BSA ;C、D中條帶含BSA和趨化因子CXCL12 ;虛線為條帶的邊界;A、C的標(biāo)尺為50 μ m ;C、D 的標(biāo)尺為 20 μ m。
[0023]附圖3為極化細(xì)胞的定量分析，其中虛線左側(cè)為前端，虛線右側(cè)為后部；標(biāo)尺為 20 μ mD
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明所記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0025]實(shí)施例
[0026]一、PDMS印章的制備
[0027]原材料及儀器:模具(模具表面刻有間隔相等的平行微細(xì)凹槽，凹槽寬為60 μm，槽高為100 μπι，每個(gè)凹槽之間的間隔為90 μπι。)，聚二甲基硅氧烷(PDMS) (Momentive RTV615Α液、B液，蘇州汶顥芯片科技有限公司)，厚質(zhì)鋁箔，培養(yǎng)皿(150mm);真空箱，烤箱，手術(shù)刀。
[0028]流程:
[0029]1、大培養(yǎng)皿中鋪鋁箔，稱好A液、B液(分別為預(yù)聚體與偶聯(lián)劑)，充分?jǐn)嚢?，將鋁箔的邊緣翻上來(lái)，放真空箱里抽真空1min(注1:抽真空時(shí)，可一直抽；也可一邊抽一邊放)；
[0030]2、新培養(yǎng)皿中鋪鋁箔，其周圍壓平，在把模具放進(jìn)鋁箔上，將I中抽真空抽好的膠倒入模具的凹槽中(注2:在倒在模具之前，如果還有氣泡，可用針頭刺破)，再抽5min真空，放在85°C Ih ；
[0031]3、將招箔和模具從培養(yǎng)皿中拿出，用合適的手術(shù)刀沿著模具的邊緣小心的分開，去掉鋁箔，將印章拿出，切割。印章大小:長(zhǎng)寬1mmX5mm，其下表面帶有間隔相等的平行顯微通道，通道寬為60 μm、高為100 μm，每個(gè)平行的通道之間的間隔