專利名稱：可表達(dá)外源性基因的人神經(jīng)干細(xì)胞及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人神經(jīng)干細(xì)胞和基因治療相結(jié)合的方法，具體涉及人神經(jīng)干細(xì)胞的分離和克隆及外源性基因轉(zhuǎn)移入神經(jīng)干細(xì)胞的方法。
神經(jīng)干細(xì)胞是具有自身更新和多潛能分化能力的一類神經(jīng)細(xì)胞，它對治療腦、脊髓損傷，腦中風(fēng)和神經(jīng)變性性疾病如帕金森氏病等具有潛在的治療價值。神經(jīng)干細(xì)胞分布于胚胎發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)，并定點存在于成年哺乳類動物的腦神經(jīng)組織中。神經(jīng)干細(xì)胞亦可從胚胎干細(xì)胞(ES Cells)或非神經(jīng)組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。神經(jīng)干細(xì)胞研究不僅可為臨床多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的途徑，而且還可推動人們對細(xì)胞跨系分化(trans-differetiation)的發(fā)育調(diào)控和腦學(xué)習(xí)記憶功能的細(xì)胞分子基礎(chǔ)等生物學(xué)研究進(jìn)行新的探索。目前神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的分離方法有下列幾種1、從畸胎瘤和神經(jīng)腫瘤的細(xì)胞中分離，如NTERA-2細(xì)胞系；2、用永生化基因轉(zhuǎn)化神經(jīng)細(xì)胞，常用V-myc基因；3、用b-FGF、EGF和LIF(白血病抑制因子)等生長因子作為刺激分裂因子維持神經(jīng)干細(xì)胞生存；4、用β-微管蛋白啟動子和神經(jīng)巢蛋白啟動子基因操作標(biāo)記分離人神經(jīng)干細(xì)胞。上述方法中存在致癌的危險因素或分離克隆成功率低。
本發(fā)明的目的是提供一種可表達(dá)外源性基因的人神經(jīng)干細(xì)胞及其制備方法。
本發(fā)明采用Hoechst33342四步驟法分離和克隆人胚神經(jīng)干細(xì)胞FZ-B9和FZ-B7。為了使神經(jīng)干細(xì)胞能表達(dá)外源性基因，采用重組腺病毒相關(guān)病毒載體(rAAV)為載體將標(biāo)記性基因LacZ基因(市售)和治療性基因膠質(zhì)細(xì)胞起源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)基因(U.S.A GeneBank)轉(zhuǎn)移入神經(jīng)干細(xì)胞。從而將干細(xì)胞治療和基因治療相結(jié)合。
本發(fā)明制備方法包括下述步驟一、神經(jīng)干細(xì)胞的產(chǎn)生和培養(yǎng)本發(fā)明遵守醫(yī)學(xué)倫理原則。使用中國人胎齡為7周和9周的流產(chǎn)胚胎組織在無菌條件下收集并保存在4℃磷酸氫鈉緩沖液(PBS Ph7.4)中。分離出前腦組織，并制備成細(xì)胞懸液和細(xì)胞團(tuán)塊的半混合狀態(tài)加入到用多聚賴胺酸(PLL)預(yù)制表面的培養(yǎng)板(Costar)中，使用DMEM/F12/N2培養(yǎng)液(GibcoBRL)，其中含有人胰島素25ng/ml，人轉(zhuǎn)鐵蛋白100μg/ml，人前列腺素20nM，谷胺酰氨2nM，葡萄糖6％，丁二胺60μM，氯化硒30nM，碳酸氫鈉3mM，HEPES 5mM，肝素2μg/ml。9周胚胎細(xì)胞原代培養(yǎng)液加有10％胎牛血清(FCS)，原代細(xì)胞培養(yǎng)12小時后貼壁，部分細(xì)胞形成神經(jīng)球體樣。第三天后原代培養(yǎng)換為無血清培養(yǎng)液。7周胚胎細(xì)胞開始即為無血清培養(yǎng)，呈半懸浮狀態(tài)生長。在含有bFGF和EGF的無血清條件下培養(yǎng)10-14天后，部分細(xì)胞死亡，部分球體樣細(xì)胞生長旺盛，用吸管吹打分散后可傳代培養(yǎng)。
二、神經(jīng)干細(xì)胞的分離和克隆(1)將培養(yǎng)板中形成球體樣形態(tài)的細(xì)胞在倒置顯微鏡下用微量吸管分離出來至上述培養(yǎng)液中，其中多富含干細(xì)胞成份；(2)從原代細(xì)胞開始在培養(yǎng)液中加入人堿性纖維母細(xì)胞生長因子(bFGF)20ng/ml(R&D Systems,USA)和人表皮生長因子(EGF)20ng/ml(R&D)，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖；(3)使用Hoechst33342進(jìn)行熒光流式細(xì)胞分離(FACS)。因Hoechst33342熒光物質(zhì)可結(jié)合到富含C-G堿基的細(xì)胞DNA上，干細(xì)胞具有將這種Hoechst33342泵出細(xì)胞的能力，從而可分離出SP細(xì)胞(Side population，邊際細(xì)胞)。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5ng/ml熒光染料Hoechst33342(Sigma)和2％FCS以及HEPES 1mM，37℃溫育1.5小時后保存在冰中。然后使用FACS流式細(xì)胞分離儀(Bector Dickinson,San Jose.CA)。Hoechst33342的激發(fā)光波長為350nm，使用450Bp20和675EFLP兩個波長的濾光器分離微量而均勻的SP細(xì)胞。分離后的SP細(xì)胞放入12孔培養(yǎng)板中，加入含有bFGF和EGF的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
(4)單細(xì)胞克隆化采用有限稀釋法在96孔板上進(jìn)行。細(xì)胞克隆增殖后移至24孔板內(nèi)繼續(xù)擴(kuò)增。SP細(xì)胞克隆化成功率為1/32，而未進(jìn)行FACS的細(xì)胞克隆化率為1/384)。單克隆化有助于鑒別干細(xì)胞分化潛力是自于單一克隆細(xì)胞還是由于多克隆混合培養(yǎng)的結(jié)果。
三、神經(jīng)干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇。凍存方法通過低速離心〔800g〕收集細(xì)胞。用新鮮生長培養(yǎng)液洗滌一遍后，將細(xì)胞懸浮在神經(jīng)干細(xì)胞凍存液中(凍存液成份為1％二甲亞砜，40％FCS，50％MEF/F12/N2培養(yǎng)液)，用吸管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到2ml細(xì)胞凍存管中。在冰水中放置15分鐘后，放入細(xì)胞凍存用梯度溫度降低盒中(Cryo 1 FreezingContainer，Nalgene Co.USA，Cat.No.5100-0001)，以每分鐘下降1℃的速度緩慢降至-80℃，然后保存在液氮中。低溫復(fù)蘇方法凍存管快速在37℃水浴箱中復(fù)溫后，將細(xì)胞小心懸浮在12ml生長培養(yǎng)液中。用同樣培養(yǎng)液洗滌兩遍后置入培養(yǎng)板中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。神經(jīng)干細(xì)胞的凍存復(fù)蘇率為62-85％。
四、細(xì)胞分化實驗在用PLL預(yù)制表面的8孔玻片上進(jìn)行。培養(yǎng)液中去除生長因子并加入10％FCS進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。BrdU摻入法用于檢測細(xì)胞增殖。神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)在含有BrdU 20uM的培養(yǎng)液中48小時，然后進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色。
克隆后FZ-B9的增殖速度快于FZ-B7。它們均表達(dá)神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記神經(jīng)巢蛋白(nestin)，Vemintin也為陽性。雖然我們在單細(xì)胞克隆化過程中使用了bFGF和EGF，但克隆建株后的神經(jīng)干細(xì)胞的生長對bFGF和EGF對這兩種生長因子的依賴性不同。在培養(yǎng)中去除bFGF僅用EGF的神經(jīng)干細(xì)胞增殖速度顯著降低，并難以維持生長。然而僅用bFGF不用EGF，細(xì)胞生長速度有所減慢，但維持增殖狀態(tài)。生長因子對FZ-B9和FZ-B7的作用相似。說明克隆化后細(xì)胞培養(yǎng)密度增加，這二株的神經(jīng)干細(xì)胞對EGF依賴性降低，僅用bFGF也可維持其生長。
將神經(jīng)干細(xì)胞分散后加入10％FCS到培養(yǎng)液中，這些細(xì)胞逐漸伸出突起，形態(tài)多樣，免疫細(xì)胞組化染色表現(xiàn)為神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記物β-微管蛋白Ⅲ和神經(jīng)絲蛋白(NF)陽性。一部分細(xì)胞CNPase陽性表明已分化成少枝膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP也為陽性。使用BrdU標(biāo)記細(xì)胞，約40-50％為陽性。這說明這些細(xì)胞不但具有向多種神經(jīng)細(xì)胞分化的能力，同時仍然自身更新，不斷增殖。
五、重組腺病毒相關(guān)病毒(AAV)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。
為了使神經(jīng)干細(xì)胞能表達(dá)外源性基因，本發(fā)明采用rAAV為載體將LacZ基因和膠質(zhì)細(xì)胞起源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)基因轉(zhuǎn)移入神經(jīng)干細(xì)胞。GDNF已在基因治療的實驗中顯示有促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元存活和生長從而治療帕金森氏病的作用。rAAV載體由HEK293細(xì)胞(ATCC，美國組織細(xì)胞庫)生產(chǎn)。將HEK293細(xì)胞同時轉(zhuǎn)染pAd/AAV輔助質(zhì)粒和載體質(zhì)粒。載體質(zhì)粒中LacZ基因和GDNF基因均在人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子控制下。rAAV載體病毒的純化采用兩次氯化銫梯度離心法。3×105細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板，加入rAAV載體，載體和細(xì)胞的比例(MOD)為500。感染12小時后，換為新的培養(yǎng)液。細(xì)胞表達(dá)LacZ基因產(chǎn)物β-半乳糖苷酶(β-gal)用X-gal染色測定。GDNF在培養(yǎng)上清中的表達(dá)用抗GDNF單克隆抗體進(jìn)行ELASA(固相酶聯(lián)免疫吸附法)測定。AAV介導(dǎo)的LacZ基因轉(zhuǎn)移到神經(jīng)干細(xì)胞后，用X-gal染色顯示98-100％細(xì)胞轉(zhuǎn)移效率。在AAV-GDNF基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天，細(xì)胞培養(yǎng)上清中GDNF表達(dá)濃度為800pg/ml。
本發(fā)明經(jīng)動物腦內(nèi)移植實驗證實神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)移植后經(jīng)過遷移、融合到腦實質(zhì)中，能發(fā)育成熟分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，并且穩(wěn)定地表達(dá)轉(zhuǎn)基因蛋白。
動物腦內(nèi)移植實驗如下新生后24小時的CD-1小鼠被進(jìn)行側(cè)腦室神經(jīng)干細(xì)胞移植。小鼠在0℃條件下凍冷麻醉2分鐘，使用纖維光源頭部透射顯示兩側(cè)側(cè)腦室，使用微玻璃纖維注射管將2微升神經(jīng)干細(xì)胞懸液(6×104cell/ul)注入側(cè)腦室內(nèi)，在電熱毯上復(fù)溫蘇醒后，幼鼠被放入母鼠籠中接受哺育。動物每天腹腔注射免疫抑制劑環(huán)胞霉素-A(10mg/kg)。細(xì)胞移植后2、18、21天分別麻醉處死動物取腦組織切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。把神經(jīng)干細(xì)胞注入到新生小鼠的側(cè)腦室內(nèi)，這些細(xì)胞在48小時內(nèi)移行進(jìn)入腦室下增殖區(qū)(SVZ)。然后隨著腦的發(fā)育信號，向腦內(nèi)多方向遷徙移并融合到宿主的腦實質(zhì)中去。這些移植的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)LacZ基因，X-gal染色后，切片上可見清晰的藍(lán)色細(xì)胞。部分細(xì)胞沿著頭側(cè)移行流(RMS)遷移到嗅球區(qū)，18-21天后在那兒分化成神經(jīng)元細(xì)胞，在腦嗅球區(qū)的切片上用β-半乳糖苷酶的抗體和抗神經(jīng)核抗原(NeuN)抗體進(jìn)行免疫熒光染色可見很多雙標(biāo)記的供體起源的神經(jīng)元。另一部分細(xì)胞從SVZ向兩側(cè)皮層下區(qū)遷移，在白質(zhì)纖維束處它們表現(xiàn)為CNPase標(biāo)記陽性的少枝膠質(zhì)細(xì)胞。并可見A2B5抗體陽性的雙潛能膠質(zhì)細(xì)胞。在皮層下區(qū)和皮層，神經(jīng)干細(xì)胞可分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP為陽性。
本發(fā)明所選用rAAV進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)有5個優(yōu)點1、AAV是一種人類單鏈DNA病毒，從未發(fā)現(xiàn)可引起任何人類疾病，臨床應(yīng)用安全。2、AAV對神經(jīng)干細(xì)胞有很高的轉(zhuǎn)移效率，實驗中LacZ基因轉(zhuǎn)移率為98-100％。3、重組AAV病毒載體去除全部病毒編碼基因，不產(chǎn)生病毒編碼蛋白，不引起T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，這對神經(jīng)干細(xì)胞的存活具有重要意義。4、AAV可長期穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因。5、AAV可將轉(zhuǎn)基因定向嵌入到19號染色體，減少因隨機(jī)插入有觸發(fā)致癌的顧慮。
本發(fā)明從人胚腦組織中分離出神經(jīng)干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)中顯示有自身更新和向三種神經(jīng)細(xì)胞分化的能力，在移植入發(fā)育狀態(tài)的動物腦內(nèi)后能隨著受體腦發(fā)育信息進(jìn)行遷移、融合和分化成神經(jīng)元、少枝膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。并且經(jīng)rAAV介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，神經(jīng)干細(xì)胞可在體外、體內(nèi)表達(dá)轉(zhuǎn)基因蛋白。為進(jìn)一步神經(jīng)疾病的治療和應(yīng)用提供了新用途。


圖1為bFGF和EGF對FZ-B9神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)作用。聯(lián)合使用bFGF和EGF，神經(jīng)干細(xì)胞呈現(xiàn)快速增殖狀態(tài)。僅用EGF，細(xì)胞增殖速度顯著降低，細(xì)胞生長難以維持。單用bFGF生長速度有所減慢，但仍然維持增殖性生長狀態(tài)。
圖2為神經(jīng)干細(xì)胞FZ-B9體內(nèi)移植后，在小鼠腦內(nèi)遷移和轉(zhuǎn)基因表達(dá)。FZ-B9LacZ細(xì)胞移植到發(fā)育中的CD-1小鼠側(cè)腦室內(nèi)，21天后腦組織切片X-gal組織化學(xué)染色，細(xì)胞表達(dá)LacZ基因產(chǎn)物β-半乳糖苷酶呈現(xiàn)藍(lán)色。冠狀切片顯示很多神經(jīng)干細(xì)胞從側(cè)腦室(LV)遷移到皮質(zhì)下區(qū)域(短箭頭顯示)，融合在宿主腦組織中。尚有小部分細(xì)胞仍停留在腦室下區(qū)(長箭頭顯示)。
權(quán)利要求
1.一種可表達(dá)外源性基因的人神經(jīng)干細(xì)胞，其特征在于由人胚神經(jīng)細(xì)胞為原始細(xì)胞分離克隆出人神經(jīng)干細(xì)胞；采重組腺病毒相關(guān)病毒為載體，將外源性基因轉(zhuǎn)移入內(nèi)制成。
2.按權(quán)利要求1所述的可表達(dá)外源性基因的人神經(jīng)干細(xì)胞，其特征在于所述的分離克隆出的人神經(jīng)干細(xì)胞為FZ-B9和FZ-B7。
3.按權(quán)利要求1所述的可表達(dá)外源性基因的人神經(jīng)干細(xì)胞，其特征在于所述的外源性基因為標(biāo)記性基因LacZ基因和治療性基因膠質(zhì)細(xì)胞起源的神經(jīng)營養(yǎng)因子基因。
4.一種可表達(dá)外源性基因的人神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法，包括下述步驟(1)產(chǎn)生和培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞取7周和9周的流產(chǎn)胚胎組織，無菌收集，分離前腦組織，制備細(xì)胞混合液，加入DMEM/F12/N2培養(yǎng)液；(2)Hoechst33342四步驟法分離和克隆A.分離球體樣形態(tài)細(xì)胞至DMEM/F12/N2培養(yǎng)液中；B.加堿性纖維母細(xì)胞生長因子和人表皮生長因子入培養(yǎng)液；C.使用Hoechst33342進(jìn)行熒光流式細(xì)胞分離邊際細(xì)胞；D.采用有限稀釋單細(xì)胞克隆化；(3)重組腺病毒相關(guān)病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移。
5.按權(quán)利要求4所述的可表達(dá)外源性基因的人神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于所述的DMEM/F12/N2培養(yǎng)液含如下成分人胰島素25ng/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白100μg/ml人前列腺素20nM谷氨酰胺2nM葡萄糖6％丁二胺60μM氯化硒30nM碳酸氫鈉3μMHEPES 5mM肝素2μg/ml
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人神經(jīng)干細(xì)胞和基因治療相結(jié)合的辦法,具體涉及人神經(jīng)干細(xì)胞的分離、克隆及外源性基因轉(zhuǎn)移入神經(jīng)干細(xì)胞的方法。本發(fā)明分離出的神經(jīng)干細(xì)胞,在體外培養(yǎng)中顯示有自身更新和向三種神經(jīng)細(xì)胞分化的能力,經(jīng)外源性基因轉(zhuǎn)移后,可在體內(nèi)、體外表達(dá)轉(zhuǎn)基因蛋白,為進(jìn)一步神經(jīng)疾病的治療提供新途徑。
文檔編號C12N5/10GK1299867SQ00127979
公開日2001年6月20日 申請日期2000年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月22日
發(fā)明者朱劍虹 申請人:復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬華山醫(yī)院