專利名稱：可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類轉(zhuǎn)基因的人羊膜細(xì)胞，具體涉及可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞及其制備方法以及在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病是長期困擾人類的疾病，一直缺乏有效的治療手段和藥物，如腦缺血性疾病、腦出血性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退變性疾病(帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷死亡率高、致殘率高，全球每年有1640萬人遭受腦中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷和脊髓損傷，其中，410萬人因此喪失生命。這些疾病給全球千千萬萬的人帶來難以擺脫的痛苦甚至死亡，在現(xiàn)代社會(huì)中已顯得越發(fā)突出。
基因治療正在成為常規(guī)方法難以治愈的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新治療手段。CNS疾病的基因治療主要有三種策略1.應(yīng)用反義技術(shù)或RNAi降低非顯性突變蛋白的活性。針對CNS疾病基因缺陷引起的非顯性突變蛋白表達(dá)，需要選擇性阻斷其生物合成，可采取反義核苷酸技術(shù)或RNAi，阻斷特異性mRNA轉(zhuǎn)錄而達(dá)到。2.應(yīng)用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物替代腦內(nèi)缺陷的酶或功能蛋白。3.應(yīng)用保護(hù)性蛋白對神經(jīng)元的存活提供支持，包括營養(yǎng)因子、抗氧化酶、熱休克蛋白和抗凋亡因子等[Natsume Exp Neurol，2001，169231-238；Berry M，Curr Opin Mol Ther，2001，3338-349]?，F(xiàn)在主要采用五種病毒載體類型1)反轉(zhuǎn)錄病毒載體，僅感染正在分裂的細(xì)胞。2)腺病毒載體，不能整合，僅瞬間表達(dá)，且產(chǎn)生抗原。3)腺相關(guān)病毒載體不能插入較大的外源基因，缺少高效的包裝細(xì)胞，制備過程復(fù)雜，制備滴度低。4)單純皰疹病毒載體，僅用在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中。5)慢病毒載體，不具有以上病毒存在的明顯缺陷，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在所有時(shí)間點(diǎn)上均明顯高于腺相關(guān)病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，而且這種載體存在長期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，而且無明顯免疫反應(yīng)。因此慢病毒載體有可能成為未來CNS基因治療的最佳載體[Englund U，.Neuroreport，2000，113973-3977；Kafri T，Mol Ther，2000，1516-521]。但是直接以工程病毒攜帶治療性基因進(jìn)入體內(nèi)在有效性、可操作性和安全性等方面面臨著不少問題，如病毒載體在體內(nèi)的穩(wěn)定性，是否會(huì)產(chǎn)生基因的重組，重排，缺失，突變等；病毒的靶細(xì)胞特異性，會(huì)不會(huì)進(jìn)入其他不相關(guān)細(xì)胞，尤其是生殖系細(xì)胞；基于這些未可知的因素，使單純的基因治療在臨床應(yīng)用上很難開展。以細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療在一定程度上避免了這些問題，人們已利用胚胎干細(xì)胞和多種成體干細(xì)胞如神經(jīng)干細(xì)胞，造血干細(xì)胞，CD34+前體細(xì)胞，臍帶血干細(xì)胞以及中腦腹側(cè)細(xì)胞等.進(jìn)行細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療。[Georgievska B，Eur J Neurosci.2004；20(11)3121-30；Englund U，Exp Neurol.2002Jan；173(1)1-2；Kahn J，Byk T，Blood.2004；103(8)2942-9；De Palma M，Nat Med.2003Jun；9(6)789-95；Imren S，Humphries RK.J Clin Invest.2004953-62]，但胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的移植若要在臨床上應(yīng)用還面臨很多問題，如安全性、免疫排斥反應(yīng)，細(xì)胞來源有限，倫理道德等。
羊膜(Amnion)，也可稱作胎膜，是母體與胎兒間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要組織。羊膜主要可分為上皮層、基底層、致密層、纖維母細(xì)胞層和海綿層五部分。羊膜細(xì)胞(humanamniotic cell，hAEC)主要由上皮層的羊膜上皮細(xì)胞和基底層的間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，是與發(fā)育中的胎兒的聯(lián)系緊密的胚胎發(fā)育早期產(chǎn)物。羊膜細(xì)胞可表達(dá)早期干細(xì)胞的一些不同標(biāo)記如神經(jīng)細(xì)胞特異的膠質(zhì)纖維相關(guān)蛋白(GFAP)，神經(jīng)元特異性標(biāo)記(MAP2)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記(nestin)，肝薄壁組織細(xì)胞蛋白，α-甲胎蛋白等。這說明既然羊膜形成于胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育早期，就有可能保留未成熟低分化的細(xì)胞，具有多能分化潛能。[Knezevic V.Anat.1996；189(Pt 1)1-7；Yuge I，Transplantation.200415；77(9)1452-4；Takashima S，Cell Struct Funct.2004；29(3)73-84；Sakuragawa N，Neurosci Lett.1996；209(1)9-12；Wei JP，Cell Transplant.2003；12(5)545-52]。另外，人羊膜細(xì)胞本身自身缺乏I，II類抗原如HLA-A，-B，C和-DR抗原以及β2免疫球蛋白[Akle CA，Lancet，1981；2(8254)1003-5；M.Adinolfi，nature vol 29528]移植后不會(huì)產(chǎn)生免疫原性，此外人羊膜細(xì)胞同時(shí)存在HLA-E、G抗原，它們具有免疫抑制活性[Ueta M et al Clin Exp Immunol 2002；129(3)464-70]。同時(shí)人羊膜細(xì)胞來源非常廣泛，不會(huì)產(chǎn)生倫理或者道德的問題，因此人羊膜細(xì)胞適合作為細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療的工程性細(xì)胞載體，但因人羊膜細(xì)胞自身的特點(diǎn)使其轉(zhuǎn)基因操作比較困難，目前只有利用很少幾例腺病毒和電轉(zhuǎn)的報(bào)道[Sakuragawa N，J Hum Genet.2000；45(3)171-6；Nakajima T，Cell Transplant.2001；10(4-5)423-7]，但電轉(zhuǎn)方式效率低，對細(xì)胞損傷大，而腺病毒不能把外源基因整合到染色體，而且會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生免疫原性，移植后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)[Takahashi S，Tohoku J Exp Med 193(4)279-92]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明之一在于提供了一類可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞。
本發(fā)明之一在于提供了可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞的制備方法。
本發(fā)明之一在于提供了一類可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞制劑。
本發(fā)明之一在于提供了可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞制劑在制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所涉及的外源性基因?yàn)闃?biāo)記基因，其選自LacZ、EGFP、GFP。
本發(fā)明所涉及的外源性基因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)基因，其選自神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)、β-葡萄糖醛酸甙酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)、多巴胺合成酶、酪氨酸羥化酶、BH4合成酶、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、bcl-2、膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶、睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)，其中優(yōu)選GDNF。
本發(fā)明所涉及的上述外源性基因還帶有基因調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)元件，其選自RNAi系統(tǒng)、Cre-LoxP系統(tǒng)、強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)系統(tǒng)。
本發(fā)明所涉及的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其選自腦缺血性疾病、腦出血性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退變性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等，其中優(yōu)選腦缺血性疾病。
近來發(fā)現(xiàn)一些基因與某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，如神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)生長因子、β-葡萄糖醛酸甙酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、多巴胺合成酶、酪氨酸羥化酶、BH4合成酶、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、bcl-2、膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶、睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子[Bemelmans AP，et al Hum Gene Ther，1999，102987-2997；Ghodsi A.Hum Gene Ther，1998，92331-2340；Snyder EY，et al Nature，1995，374367-370；Palella TD，etal.Gene，1989，80137-144；Bjorklund A，et al.Brain Res，2000，88682-98；Kang UJ，et al.Hum Cell，2001，1439-48；Yamada M，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1999，964078；Tuszynski MH，et al.Exp Neurol，1998，154573-82；Saille C，et al.Neuroscience，1999，921455-63；Haase G，et al Ann Neurol，1999，45296-304；Mohajeri MH，et al.Hum Gene Ther，1999，101853-1866；Azzouz M，et al.Hum Mol Genet，2000，9803-811；Adachi Y，et al.HumGene Ther，2000，1177-89]，因此可以利用表達(dá)相應(yīng)外源基因的羊膜細(xì)胞來治療相應(yīng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。本發(fā)明以GDNF基因?yàn)槔?，GDNF，屬轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員，它對多種原因引起的神經(jīng)損害都有很好的保護(hù)作用。本發(fā)明將慢病毒PWPT-GDNF感染的人羊膜細(xì)胞植入大鼠短暫腦缺血模型腦內(nèi)，注射部位一側(cè)腦組織GDNF的表達(dá)量升高，同時(shí)出現(xiàn)更多的神經(jīng)元和神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記，缺血面積減少，明顯地改善了癥狀。
本發(fā)明所涉及的可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞是采用第三代慢病毒載體將外源性基因轉(zhuǎn)入人羊膜細(xì)胞的。和原始的HIV-1相比，第三代慢病毒的改造主要有以下幾個(gè)方面，在沒有影響病毒的包裝和滴度的前提下，刪除3’LTR的U3區(qū)域約400bp的片斷，刪除一些調(diào)控因子如vif，vpr，vpu，nef，tats等，同時(shí)用口腔皰疹病毒衣殼蛋白(VSVG)替換HIV-1中的ENV，同時(shí)把這些片斷插入到不同的載體上，最大程度上避免了重組復(fù)合體的形成，這使安全性得到更高的保證。同時(shí)為了調(diào)控外源性基因的表達(dá)，在慢病毒載體中可分別加上RNAi，Cre-LoxP系統(tǒng)、強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)系統(tǒng)等基因調(diào)控結(jié)構(gòu)元件，使外源基因在體外培養(yǎng)條件下能進(jìn)行有效地被調(diào)控，移植入體內(nèi)后也能使外源基因的表達(dá)受調(diào)控。
本發(fā)明所涉及的制備方法，包括下列步驟一、人羊膜細(xì)胞來源和培養(yǎng)人羊膜從剖腹產(chǎn)孕婦的胎盤上剝離下來后，刮掉下面的海綿層和成纖維細(xì)胞層，酶消化分離羊膜細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；二、慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移1.細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒的包裝所需包裝細(xì)胞293T及檢測細(xì)胞HeLa細(xì)胞系用DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清、streptomycin 100μg/ml、penicillin 100U/ml、glutamine 0.3mg/ml)培養(yǎng)。慢病毒的包裝是通過Ca3(PO4)2方法混合20μg轉(zhuǎn)移載體(PWPT或PLVTHM或PWPT-GDNF等圖1)，10μg pMDLg/pRRE或者pCMVdR8.2，和5μg pRSVrev，5μpMD2.G.加水至250μl加入250μl 0.5M的CaCl2，混合后加入到500μl的HeBS2x(0.28M NaCl，0.05MHEPES，1.5M Na2HPO4)，靜置大約30分鐘后加入到293T的培養(yǎng)基中，14小時(shí)后加入更換新培液，培養(yǎng)28個(gè)小時(shí)，收集上清液。1500rpm離心15分鐘，用0.45μm膜過濾，在80000g 4℃下超速離心90分鐘。棄上清，沉淀用1mlPBS懸浮，保存于-80℃冰箱，從而分別得到了包裝好的帶有不同外源基因的慢病毒。病毒梯度稀釋后加入1×105HeLa培養(yǎng)細(xì)胞中，通過流式細(xì)胞儀檢測感染效率后根據(jù)公式(1×105HeLa細(xì)胞×％EGFP陽性細(xì)胞×1000/μl病毒顆粒)得到病毒的滴度大約在0.1-1×109TU/ml之間。
2.慢病毒感染人羊膜細(xì)胞人羊膜細(xì)胞體外培養(yǎng)，然后分別加入包裝好的慢病毒和終濃度1-10μg/mlpolybrene，培養(yǎng)處理24小時(shí)，然后PBS清洗3次，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)利用了慢病毒不會(huì)產(chǎn)生免疫原性的特點(diǎn)和人羊膜細(xì)胞本身缺乏I，II類抗原卻存在具有免疫抑制活性的HLA-E、G抗原的特征，避免了移植可表達(dá)外源基因羊膜細(xì)胞時(shí)所面臨的免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)本發(fā)明結(jié)合慢病毒為基礎(chǔ)的RNAi系統(tǒng)，Cre-LoxP系統(tǒng)以及強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)控，使外源基因在培養(yǎng)條件下進(jìn)行有效的調(diào)控，移植入體內(nèi)后也能在一定程度上調(diào)控外源基因的表達(dá)，使其安全性更高。本發(fā)明將慢病毒PWPT-GDNF感染的人羊膜細(xì)胞植入大鼠腦缺血模型腦內(nèi)，結(jié)果表明缺血面積減少，明顯地改善了癥狀。因此在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療應(yīng)用方面，本發(fā)明所提供了可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞，將具有廣闊的臨床應(yīng)用前景和開發(fā)價(jià)值。
在本發(fā)明中，使用如下定義本文中，術(shù)語“含有”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的細(xì)胞和細(xì)胞制劑。因此，術(shù)語“主要由…組成”和“由…組成”包含在術(shù)語“含有”中。
本文中，“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。更佳地，“藥學(xué)上可被接受”是指不影響細(xì)胞活性的無毒物質(zhì)。
本文中，術(shù)語“安全有效量”指按本發(fā)明的方式使用時(shí)足以獲得需要的治療反應(yīng)而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的成分的量。顯然，具體的“安全有效量”因各種因素而異，如受治療的特殊病情、患者的身體條件、受治療的哺乳動(dòng)物的種類、療程、同時(shí)進(jìn)行的治療的種類(如果有的話)、所應(yīng)用的具體制劑和化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)劑量在本發(fā)明中，對可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞的劑量沒有特別限制，可用任何合適的劑量。在使用可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病時(shí)，細(xì)胞的用量取決于疾病的性質(zhì)、病程、輕重、藥物反應(yīng)情況以及病人接受治療的情況等，最終由處方醫(yī)生決定給予病人多少劑量。
一般，在治療腦缺血性疾病時(shí)，可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞的有效劑量范圍通常為105-109/人。
劑量單元包括一種可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞，或者多種可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞所形成的混合物。劑量單元還可含有稀釋劑、生物材料載體等。劑量單位是液體或凝膠形式，它們適合顱內(nèi)注射或者顱內(nèi)填埋。
劑型本發(fā)明經(jīng)顱內(nèi)填埋移植的可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞組合物可采用凝膠形式。這些凝膠物中混合了1種或1種以上的可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞和至少1種生物材料載體，例如，膠原、羥丙基纖維素、微晶纖維素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、果膠、硅鋁酸鎂、鋁酸鎂。
經(jīng)顱內(nèi)注射移植的可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞組合物包括藥學(xué)上可接受的溶液劑，通常可以是PBS、Hank’s液、無酚紅細(xì)胞培養(yǎng)基。
治療方法治療方法可以是，治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的任何合適有效方法。治療可以是顱內(nèi)注射或者顱內(nèi)填埋。
本發(fā)明的可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞制劑還可與其他治療和輔助治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的物質(zhì)聯(lián)用，以進(jìn)一步提高治療效果。


圖1.慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)移載體的結(jié)構(gòu)插入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(WPRE或者WHV)和多聚嘌呤片斷(cPPT)，以提高病毒的轉(zhuǎn)染效率，啟動(dòng)子采用CMV或者EFs，這兩個(gè)啟動(dòng)子能在絕大多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)。
圖.2慢病毒介導(dǎo)的EGFP在羊膜細(xì)胞中高效整合并穩(wěn)定表達(dá)。
A慢病毒(Lenti-EGFP)或者脂質(zhì)體(DOTAP)轉(zhuǎn)染的羊膜細(xì)胞7天后的轉(zhuǎn)染效率；B慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞持續(xù)5周EGFP的表達(dá)情況；C基因組PCR和RT-PCR的結(jié)果證明，Lenti-EGFP整合到基因組并在mRNA水平上高表達(dá)；D羊膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞周期檢測的結(jié)果，左圖為慢病毒轉(zhuǎn)染前的羊膜細(xì)胞周期，右圖為慢病毒轉(zhuǎn)染后的羊膜細(xì)胞周期。
圖3.慢病毒介導(dǎo)的siGFP的系統(tǒng)抑制羊膜細(xì)胞EGFP的表達(dá)。
ALenti-EGFP轉(zhuǎn)染的羊膜細(xì)胞的熒光影象；B羊膜細(xì)胞EGFP表達(dá)效率；CLenti-EGFP和Len-siGFP共轉(zhuǎn)染羊膜細(xì)胞的熒光影象；DRT-PCR檢測EGFP的mRNA水平。
圖4.羊膜細(xì)胞EGFP的表達(dá)可以通過慢病毒介導(dǎo)的Cre-LoxP系統(tǒng)有效調(diào)控。ALenti-EGFP的羊膜細(xì)胞的熒光影象；BLenti-EGFP和Lenti-Cre共轉(zhuǎn)染的熒光影象；CLenti-EGFP的羊膜細(xì)胞(PWPT)、Lenti-EGFP和Lenti-Cre共轉(zhuǎn)染的羊膜細(xì)胞(PWPT/CRE)EGFP的表達(dá)效率；D通過羊膜細(xì)胞基因組PCR發(fā)現(xiàn)這種抑制作用是通過剔除整合入基因組中的EGFP實(shí)現(xiàn)的。
圖5.慢病毒介導(dǎo)的強(qiáng)力霉素表達(dá)系統(tǒng)對羊膜細(xì)胞的調(diào)控。ALenti-EGFP表達(dá)的細(xì)胞的熒光圖象；BLenti-EGFP和PLVtTR-KRAB共轉(zhuǎn)染羊膜細(xì)胞的熒光圖象C強(qiáng)力霉素處理后，Lenti-EGFP和PLVtTR-KRAB共轉(zhuǎn)染羊膜細(xì)胞的熒光圖象。
圖6慢病毒轉(zhuǎn)染的羊膜細(xì)胞生物安全性檢測。在羊膜細(xì)胞及羊膜細(xì)胞上清液培養(yǎng)的Hela細(xì)胞的基因組中，通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)用正常表達(dá)EGFP的羊膜細(xì)胞上清液培養(yǎng)的Hela細(xì)胞沒有EGFP的表達(dá)(A)，同時(shí)在兩個(gè)細(xì)胞中均沒有發(fā)現(xiàn)病毒結(jié)構(gòu)基因GAG的表達(dá)(B)。
圖7.腦組織TTC染色后缺血體積比較。把二個(gè)組的大鼠腦子切成1mm厚的切片，TTC染色，然后利用Auto CAD軟件計(jì)算每張切片缺血部分面積/總面積，最終算出缺血體積/總體積。對照組皮層大部分缺血，轉(zhuǎn)GDNF的羊膜細(xì)胞組，皮層缺血癥狀幾乎全部恢復(fù)。
圖8.轉(zhuǎn)GDNF羊膜細(xì)胞在注射入腦內(nèi)兩周后GDNF免疫組化。在注射轉(zhuǎn)GDNF羊膜細(xì)胞的針道里(圖8A)有大量GDNF陽性的轉(zhuǎn)GDNF的羊膜細(xì)胞(5×)放大后如圖8B(100×)蘇木素復(fù)染后如圖8C(200×)；對側(cè)部位沒有明顯的陽性細(xì)胞圖8D，8E(100×)。
圖9.轉(zhuǎn)GDNF羊膜細(xì)胞注射到腦內(nèi)后針道周圍的腦細(xì)胞免疫組化。針道周圍的腦組織細(xì)胞(圖A 5×，圖B 100×，圖C 200×)；與對側(cè)部位(圖D，E 100×)相比GDNF的表達(dá)明顯增高。蘇木素復(fù)染后如圖C，E。
圖10.轉(zhuǎn)GDNF羊膜細(xì)胞注射到體內(nèi)三周后后MAP-2免疫組化呈陽性；圖A為針道(5×)，蘇木素復(fù)染后如圖C(100×)；圖B為針道對側(cè)腦組織(5×)，蘇木素復(fù)染后如圖D(100×)。
圖11.大鼠MCAO術(shù)前兩天及術(shù)后治療期間(16天內(nèi))神經(jīng)行為學(xué)評分。與對照組相比，hAEC-GDNF組效果明顯其癥狀在第八天即出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)。
圖12.平衡木實(shí)驗(yàn)檢測二組大鼠術(shù)后運(yùn)動(dòng)平衡性的恢復(fù)能力。術(shù)后第4天開始治療組hAEC-GDNF組的得分明顯高于對照組.
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步地說明，但本發(fā)明并不受限于下述實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NeW YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
材料以下實(shí)驗(yàn)所用主要藥品來源包裝細(xì)胞293T及檢測細(xì)胞HeLa細(xì)胞系來自ATCC(Rockville，Maryland)，慢病毒載體系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PWPT，PLVTHM，)、包裝載體(pCMVδR8.2、pMDLg/pRRE)、包被載體(pMD.G)來自Invitrogen； PLV-tTR-KRAB、lenti-cre、PLVTHMsiGFP、PWPI-GDNF按Invitrogen慢病毒載體說明書構(gòu)建；siGFP序列(MluI)cgcgtccccgaacggca tcaaggtgaacttcaagagag，(ClaI)ttcaccttgatgccgttctttttggaaat和其它引物由上海生工生物工程公司合成。細(xì)胞培養(yǎng)試劑來自于GIBCO；polybrene來自于Sigma；基因組DNA抽提試劑盒、mRNA抽提試劑盒、PCR系統(tǒng)、RT-PCR系統(tǒng)均來自promega；GDNF抗體來自于santacruz，CA，MAP-2抗體來自于sigma。
實(shí)施例1人羊膜細(xì)胞的培養(yǎng)人羊膜從健康的剖腹產(chǎn)孕婦的胎盤上剝離下來后，刮掉下面的海綿層和成纖維細(xì)胞層，把膜用剪刀剪成碎片，加入0.25％胰酶/EDTA，消化半小時(shí)后，加入血清終止，離心后將得到的細(xì)胞接種于6孔板，加入RPMI 1640培養(yǎng)基(10％胎牛血清，streptomycin100μg/ml，penicillin 100U/ml和glutamine 0.3mg/ml)在37°C含5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
實(shí)施例2流式細(xì)胞儀(FACS)和PCR分析病毒感染羊膜細(xì)胞的效率hAEC以2×105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，48小時(shí)后加入慢病毒PWPT(MOI＝100)，同時(shí)加入10μg/ml polybrene，轉(zhuǎn)染處理24小時(shí)，然后PBS清洗3次，換新RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)hAEC也加入EGFP-脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染處理24小時(shí)，然后PBS清洗3次，換新RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
PWPT轉(zhuǎn)染的人羊膜細(xì)胞培養(yǎng)1個(gè)星期后，通過流式細(xì)胞儀(FACS)檢測EGFP的表達(dá)效率，并抽提細(xì)胞基因組DNA和mRNA檢測在基因組和mRNA水平上的變化?；蚪MDNA和mRNA的抽提以及PCR、RT-PCR根據(jù)promega公司的說明書操作，擴(kuò)增條件為94℃5分鐘；28個(gè)循環(huán)94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分鐘；最后72℃10分鐘。EGFP引物上游5’-cgagctggacggcgacgtaaac-3’下游5’-gcgcttctcgtggggtctttg-3’，內(nèi)參β-actin上游aacgagcggtccgatgccctgag，下游tgcgccttcaccgtccagt，擴(kuò)增后片斷的長度為EGFP597bp，β-actin590bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl在1.5％瓊脂糖(0.5μg/ml溴化己啶)，電泳檢測。
結(jié)果通過流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染羊膜細(xì)胞作為對照，發(fā)現(xiàn)慢病毒效率遠(yuǎn)高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，慢病毒能感染90％左右的細(xì)胞，而脂質(zhì)體的感染效率低于5％(圖2A)，連續(xù)傳代培養(yǎng)5個(gè)星期，EGFP的表達(dá)效率保持穩(wěn)定(圖2B)；檢測基因在細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)EGFP在基因組水平上存在，mRNA水平上有穩(wěn)定的表達(dá)(圖2C)，說明慢病毒介導(dǎo)的基因是通過整合入基因組的方式在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的。同時(shí)細(xì)胞周期檢測的結(jié)果，感染前后G0-G1期細(xì)胞比率保持穩(wěn)定(圖2D)。這些結(jié)果說明慢病毒不影響羊膜細(xì)胞的狀態(tài)，是一種穩(wěn)定可靠的轉(zhuǎn)基因方法。
實(shí)施例3慢病毒介導(dǎo)的RNAi抑制羊膜細(xì)胞EGFP的表達(dá)RNAi被認(rèn)為是在轉(zhuǎn)錄后水平上最有效的基因沉默方法。通過在羊膜細(xì)胞中利用慢病毒轉(zhuǎn)入EGFP和siGFP的方法，發(fā)現(xiàn)慢病毒介導(dǎo)RNAi的表達(dá)能在mRNA水平上抑制細(xì)胞中特定基因。siGFP序列通過慢病毒PLVTHMsiGFP在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后形成雙鏈RNA，介導(dǎo)了細(xì)胞中EGFP mRNA的切除。
hAEC以2×105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，48小時(shí)后加入慢病毒PLVTHM(MOI＝100)，同時(shí)加入8μg/ml polybrene，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，再加入pLVTHMsiGFP，處理24小時(shí)，然后PBS清洗3次，換新RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)1個(gè)星期后通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀(FACS)檢測EGFP的表達(dá)，并用半定量PCR檢測EGFP表達(dá)與調(diào)控的關(guān)系。mRNA的抽提以及RT-PCR根據(jù)promega公司的說明書操作，擴(kuò)增條件為94℃5分鐘；28個(gè)循環(huán)94℃1分鐘，58℃1分鐘，72％1分鐘；最后72℃10分鐘。EGFP引物上游5’-cgagctggacggcgacgtaaac-3’下游5’-gcgcttctcgttggggtctttg-3’，內(nèi)參β-actin上游aacgagcggttccgatgccctgag，下游tgcgccttcaccgttccagtt，擴(kuò)增后片斷的長度為EGFP597bp，β-actin590bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl在1.5％瓊脂糖(0.5μg/ml溴化己啶)，電泳檢測。
結(jié)果PLVTHM轉(zhuǎn)染的羊膜細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)EGFP，PLVTHM和PLVTHMsiGFP共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中EGFP的表達(dá)明顯受到抑制(圖3A，C)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制后EGFP的表達(dá)低于15％(圖3B)，RT-PCR結(jié)果表明這種抑制作用發(fā)生在羊膜細(xì)胞的mRNA水平(圖3D)。
實(shí)施例4慢病毒介導(dǎo)的CRE-LoxP系統(tǒng)有效的套取轉(zhuǎn)入的外源基因Cre是整合酶家族中位點(diǎn)特異性的重組酶，能催化loxP之間片斷的重組(Sternberg，N.(1981)J.Mol.Biol.150，467-486)，利用慢病毒介導(dǎo)的CRE-LoxP系統(tǒng)在羊膜細(xì)胞中特異性的剔除外源基因。慢病毒3’端具有LoxP位點(diǎn)，反轉(zhuǎn)錄后整合到基因組后兩端都具有了LoxP位點(diǎn)，CRE酶可以將這兩端間的片斷剔除。
hAEC以2×105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，48小時(shí)后加入慢病毒PWPT(MOI＝200)，同時(shí)加入8μg/ml polybrene，轉(zhuǎn)染24小時(shí)，然后加入Lenti-CRE，處理24小時(shí)，然后PBS清洗3次，換新RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)1個(gè)星期后通過流式細(xì)胞儀(FACS)檢測EGFP的表達(dá)效率，并用半定量RT-PCR檢測EGFP表達(dá)與調(diào)控的關(guān)系，mRNA的抽提以及RT-PCR根據(jù)promega公司的說明書操作，擴(kuò)增條件為94℃5分鐘；28個(gè)循環(huán)94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分鐘；最后72℃10分鐘。EGFP引物上游5’-cgagctggacggcgacgtaaac-3’下游5’-gcgcttctcgttggggctttg-3’，內(nèi)參β-actin上游aacgagcggtccgatgccctgag，下游tgtcgccttcaccgtccagtt，擴(kuò)增后片斷的長度為EGFP597bp，取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl在1.5％瓊脂糖(0.5μg/ml溴化己啶)，電泳檢測。
結(jié)果PWPT感染的羊膜細(xì)胞EGFP能正常表達(dá)，PWPT和Lenti-CRE共轉(zhuǎn)染的羊膜細(xì)胞中EGFP的表達(dá)能被有效的抑制，流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果標(biāo)明抑制后EGFP的表達(dá)效率低于10％(圖4A)，基因組DNA中EGFP的PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢病毒介導(dǎo)的CRE-LoxP系統(tǒng)能剔除整合入基因組中的EGFP(圖4B)。
實(shí)施例5慢病毒介導(dǎo)的強(qiáng)力霉素調(diào)控的基因表達(dá)tTR-KRAB蛋白能特異性的結(jié)合到基因組中的tetO位點(diǎn)，使附近的啟動(dòng)子(可達(dá)3kb)被抑制，同時(shí)也能被強(qiáng)力霉素結(jié)合而失去結(jié)合到tetO位點(diǎn)的特性，根據(jù)這一特點(diǎn)，可以利用慢病毒把特異性位點(diǎn)tetO與治療基因以其整合到染色體，再通過慢病毒表達(dá)的tTR-KRAB蛋白和強(qiáng)力霉素的作用，使治療基因在細(xì)胞內(nèi)被調(diào)控表達(dá)。
hAEC以2×105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，48小時(shí)后加入慢病毒PLVTHM(MOI＝200)，同時(shí)加入10μg/ml polybrene，轉(zhuǎn)染24小時(shí)，再加入PLV-tTR-KRAB，處理24小時(shí)，然后PBS清洗3次，換新RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。再經(jīng)過24小時(shí)培養(yǎng)后，加入強(qiáng)力霉素(終濃度5μg/ml)。通過熒光顯微鏡觀察熒光檢測細(xì)胞EGFP的表達(dá)效率。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLVTHM感染的羊膜細(xì)胞能有效的表達(dá)EGFP(圖5A)，PLVTHM與PLV-tTR-KRAB共轉(zhuǎn)染后，EGFP的表達(dá)明顯受到抑制(圖5B)，加入強(qiáng)力霉素(DOX)后，細(xì)胞中EGFP恢復(fù)表達(dá)(圖5C)。這一調(diào)控系統(tǒng)在羊膜細(xì)胞內(nèi)可以有效的調(diào)控EGFP的表達(dá)。
實(shí)施例6生物安全性檢測PWPT感染羊膜細(xì)胞3天后，用PBS沖洗干凈，繼續(xù)培養(yǎng)3天，收集上清液，用0.45μm的膜過濾后，作為培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)3天。分別抽提hAEC和HeLa的基因組DNA，用病毒結(jié)構(gòu)蛋白GAG及EGFP和β-actin引物擴(kuò)增，引物序列分別為gag上游5’gagatctgatcatactgtcctac3’下游5’ggaactactagtacccttcaggaa3’；EGFP上游5’cgagctggacggcgacgtaaac3’下游5’gcgcttctcgtggggtctttg3’；β-actin上游5’aacga gcggtccgatgccctgag 3’下游5’tgcgccttcaccgtccagtt3’。
反應(yīng)條件94℃5分鐘；28cycles94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分鐘；72℃10分鐘。擴(kuò)增片斷長度EGFP597bp.；Gag912bp；β-actin590bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl在1.5％瓊脂糖(0.5μg/ml溴化己啶)，電泳檢測。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)在羊膜細(xì)胞中整合入EGFP的情況下，Hela細(xì)胞的基因組中沒有檢測到EGFP的插入(圖6A)同時(shí)檢測了病毒結(jié)構(gòu)蛋白GAG，在羊膜細(xì)胞以及Hela細(xì)胞基因組中均沒有發(fā)現(xiàn)(圖6B)。
實(shí)施例7大鼠短暫腦缺血模型(MCAO)的建立250g雌性SD大鼠用10％水合氯醛麻醉(0.3ml/100g)。具體方法如下大鼠仰臥位取頸部正中切口，暴露頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈。距頸總動(dòng)脈分叉部10mm處將頸外動(dòng)脈用3-0絲線結(jié)扎；用三個(gè)動(dòng)脈夾分別夾閉頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈。用1ml注射器在頸外動(dòng)脈上刺一小孔(在頸外動(dòng)脈結(jié)扎處至頸總動(dòng)脈分叉部之間)，用30mm長、4-0尼龍線(尖端燒成圓形，以免刺破血管內(nèi)壁)經(jīng)此小孔插入，松開頸內(nèi)動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾，將插線經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉處插入頸內(nèi)動(dòng)脈直至堵塞住大腦中動(dòng)脈(從頸總動(dòng)脈分叉處插入線長約18-20mm)。40分鐘后，拔出插線。近心端結(jié)扎頸外動(dòng)脈，松開頸總動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾，肉眼可見血管內(nèi)血流恢復(fù)。分層縫合手術(shù)切口，注意動(dòng)物保暖。(Zea longa E etal Stroke，1989，2084-91)。MCAO模型制作完成24h后，將手術(shù)大鼠進(jìn)行提尾試驗(yàn)以確定動(dòng)物模型的成功與否。具體操作如下將大鼠鼠尾提起離地面約20cm，模型成功大鼠表現(xiàn)為手術(shù)對側(cè)前肢向胸壁靠攏，身體彎向手術(shù)對側(cè)的腦梗塞癥狀。從而認(rèn)定模型建立成功。[MarkgrafCG，et al.BrainRes，1992，20；575(2)238-46]實(shí)施例8細(xì)胞的移植hAEC以2×105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，48小時(shí)后加入慢病毒PWPT-GDNF(MOI＝100)，同時(shí)加入10μg/ml polybrene，轉(zhuǎn)染處理24小時(shí)，然后PBS清洗3次，換新RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；細(xì)胞移植前，0.05％胰酶消化成單細(xì)胞，PBS清洗，然后將細(xì)胞沉淀用PBS重懸為1-2×108。
細(xì)胞移植將MCAO大鼠固定于立體定向架上，取俯臥位，取頂部正中切口，鈍性分離骨膜，暴露顱骨和前囟，定位后鉆孔。注射部位前囟后1mm，右側(cè)方3mm，深度4mm，這個(gè)區(qū)域?yàn)槿毖吘墔^(qū)。分組對照組注射PBS 5μl；hAEC-GDNF組注射慢病毒PWPI-GDNF感染的羊膜細(xì)胞4-8×1055μl。
實(shí)施例9梗死體積的測定大鼠MCAO手術(shù)后16d，二組分別隨機(jī)取6只動(dòng)物，用水合氯醛過量麻醉處死(500mg/kg，腹腔注射)，經(jīng)心臟灌注生理鹽水。在大腦耳間線前12mm(為額葉皮質(zhì)的感覺和運(yùn)動(dòng)區(qū))至5.0mm(為海馬中部)處切成腦片，片厚1mm，然后將腦片放入2％四氮唑紅(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC)磷酸鹽緩沖液中，37℃避光孵育30分鐘，取出置于10％多聚甲醛液中固定。采用AutoCAD處理攝影圖像，計(jì)算出腦片上梗死灶面積。梗死體積(mm3)＝所有腦片梗死面積的總和×1mm(腦片的厚度)。數(shù)據(jù)以梗死體積/腦組織體積的百分比值呈現(xiàn)。
結(jié)果二組老鼠在大腦缺血面積上存在明顯差異，主要表現(xiàn)在皮層上，對照組皮層大部分缺血，hAEC-GDNF皮層缺血癥狀幾乎全部恢復(fù)(圖7)。
實(shí)施例10免疫組織化學(xué)方法(DAB法)檢測針道及針道附近GDNF和神經(jīng)元標(biāo)記MAP-2的表達(dá)。取二組大鼠各3只，10％水合氯醛麻醉(0.3ml/100g)，經(jīng)心臟灌注生理鹽水和4％多聚甲醛，取出腦組織置于20％蔗糖中，待完全沉降后，取冠狀面針道附近冰凍切片，片厚50μm。在0.3％的H2O2中30分鐘以去處內(nèi)源性的過氧化物酶，GDNF(1∶200)或MAP-2(1∶200)，4過夜；抗兔生物素二抗，37℃1小時(shí)，ABC混合液37℃1小時(shí)，DAB顯色。蘇木精復(fù)染封片。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)hAEC-GDNF組的大鼠腦針道附近大量的陽性細(xì)胞，而對側(cè)的同位置幾乎沒有陽性細(xì)胞(圖8.)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)針道周圍的腦組織細(xì)胞也呈現(xiàn)GDNF陽性(圖9)，說明hAEC-GDNF在注射到腦內(nèi)后能夠?yàn)榇竽X提供足夠的GDNF或者誘導(dǎo)了針道周圍的細(xì)胞自身產(chǎn)生GDNF。細(xì)胞移植三周后，免疫組化檢測MAP-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hAEC-GDNF具有MAP-2陽性，說明羊膜細(xì)胞可能在體內(nèi)分化成為神經(jīng)元，對于腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)具有重要的作用(圖10)實(shí)施例11神經(jīng)行為學(xué)檢查二組隨機(jī)取6只大鼠神經(jīng)學(xué)檢查標(biāo)準(zhǔn)按照Longa等提出的進(jìn)行評分0分為正常；1分為栓塞動(dòng)脈對側(cè)上肢不能完全伸展，而同側(cè)上肢正常；2分為栓塞動(dòng)脈對側(cè)上肢屈曲，向?qū)?cè)推時(shí)抵抗力下降，沒有旋轉(zhuǎn)；3分為栓塞動(dòng)脈對側(cè)上肢屈曲，向?qū)?cè)推時(shí)抵抗力下降，行走時(shí)向?qū)?cè)有輕度旋轉(zhuǎn)；4分表現(xiàn)為行走時(shí)向?qū)?cè)有嚴(yán)重旋轉(zhuǎn)；5分為大鼠身體倒向梗死對側(cè)。[Longa EZ，et al Stroke.1989；20(1)84-91]結(jié)果從術(shù)后4天到16天，hAEC-GDNF組與對照組表現(xiàn)相比較，神經(jīng)行為學(xué)明顯好轉(zhuǎn)。在多個(gè)時(shí)間段都有顯著差異(P＜0.05)隨著術(shù)后時(shí)間的推移，hAEC-GDNF組大鼠的行為學(xué)評分分別在第8天和第12天降至1分左右；而對照組在第16天癥狀亦有所改善，但評分始終在2分以上，存在明顯的神經(jīng)行為學(xué)損傷(圖11)。
實(shí)施例12協(xié)調(diào)性檢測通過beam-walking方法，用一根長1750cm寬19mm的桿子，檢測老鼠通過桿子的能力評分標(biāo)準(zhǔn)為0老鼠跌落；1老鼠能停在桿上，但不能爬行；2老鼠在爬行中跌落；3老鼠能通過桿子，但后肢不能發(fā)揮作用4能通過桿子后肢有50％脫步現(xiàn)象；5能順利通過桿子，有很少脫步；6順利通過。
結(jié)果通過在平衡木上行走，可以檢測其運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)能力，發(fā)現(xiàn)在術(shù)后4天，hAEC-GDNF組與對照組相比已經(jīng)有明顯差異，隨著時(shí)間推移，癥狀逐漸改善。(圖12)。
實(shí)施例13.細(xì)胞注射液的制備(每支)采用實(shí)施例8制備的人羊膜細(xì)胞 109個(gè)細(xì)胞PBS 1ml數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SigmaPlot軟件分析FACS的結(jié)果，所得分析結(jié)果以means±SE表示，Student′st-test和one-way ANOVA分析數(shù)據(jù)間的明顯差異，顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)P＜0.05。
權(quán)利要求
1.一種可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞含有由慢病毒載體導(dǎo)入的外源性基因。
2.按權(quán)利要求1所述的可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞，其特征在于，所述的外源性基因選自神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)生長因子、β-葡萄糖醛酸甙酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、多巴胺合成酶、酪氨酸羥化酶、BH4合成酶、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、bcl-2、膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶或睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子。
3.按權(quán)利要求1所述的可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞，其特征在于，所述的外源性基因?yàn)槟z質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。
4.按權(quán)利要求1-3所述的可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞，其特征在于，含有基因調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)元件，該元件選自RNAi系統(tǒng)、Cre-LoxP系統(tǒng)、強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)系統(tǒng)。
5.一種可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞制劑，其特征在于，含有按權(quán)利要求1-4所述的可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞和和藥學(xué)上可接受的載體。
6.一種可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞的制備方法，包括下列步驟(1).人羊膜細(xì)胞培養(yǎng)人羊膜從剖腹產(chǎn)孕婦的胎盤上剝離下來后，刮掉下面的海綿層和成纖維細(xì)胞層，酶消化分離羊膜細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；(2).慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。
7.按權(quán)利要5所述的可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞制劑在制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用。
8.按權(quán)利要7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病為腦缺血性疾病、腦出血性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退變性疾病或中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。
9.按權(quán)利要7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病為腦缺血性疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類轉(zhuǎn)基因的人羊膜細(xì)胞，具體涉及可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞及其制備方法以及在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的應(yīng)用。本發(fā)明采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染的方法，將外源性基因轉(zhuǎn)入人羊膜細(xì)胞，得到可表達(dá)外源性基因的人羊膜細(xì)胞；該細(xì)胞移植入腦內(nèi)對腦缺血性疾病有明顯的治療作用。這為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的治療途徑。
文檔編號C12N15/86GK1884495SQ200510027128
公開日2006年12月27日 申請日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者郭禮和, 劉天津, 武家才, 王雪松, 蔣芝華, 黃勤 申請人:和泓生物技術(shù)(上海)有限公司