專利名稱：受高鹽誘導的鹽藻基因片段和鈉／磷共轉運通道基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域，具體地說，屬于受高鹽脅迫誘導的新的鹽藻差減cDNA文庫、基因片段的分離和一個受高鹽脅迫和無機磷饑餓誘導表達的新的鹽藻(Dunaliella viridis)的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
背景技術：
植物對滲透脅迫的反應是一個多基因控制的復雜過程。不同植物對滲透脅迫的反應也不盡相同，具有豐富的多樣性。但是，對滲透脅迫的細胞水平的反應則似乎在整個生物界都是保守的(Yancey等.Living with water stressevolution of osmolyte systems.Science 1982，2171214-1222)。已有相當多的例子表明，從高等植物中獲得的一些基因，往往是間接利用了從動物、低等植物、甚至是酵母、細菌中發(fā)現(xiàn)的該類同源基因才分離出來的。實際上，這些同源基因也經(jīng)常被直接應用于轉基因作物遺傳改良中。
同樣的道理，從一些生存于極端環(huán)境如高鹽堿環(huán)境中的低等生物中，應該能較方便地分離得到與抗?jié)B透脅迫相關的基因，這些基因很可能被直接或間接用于轉化各種重要農(nóng)作物。鹽藻(Dunaliella viridis)就是一個具有這樣特性的真核單細胞綠藻(Cowan.A.K等.Dunaliella salinaA model system for studying theresponase of plant cells to stress.J Exp Bot 1992；431535-1547)。它的抗環(huán)境脅迫的能力異乎尋常，是迄今所知的最耐鹽的真核生物，可以在從接近淡水(NaCl＜50mM)直到飽和鹽水(NaCl＞5M)的環(huán)境中生長。同時還具有極強的滲透調(diào)節(jié)能力，其細胞一次可以耐受3-4倍滲透壓的變化(Sadka A等.A 150kilodalton cell surface protein is induced by salt in the halotolerantgreen alga Dunaliella salina.Plant physiol 1991；95822-831)。因此，鹽藻因其極強的耐受滲透脅迫和其它極端環(huán)境的能力被作為研究耐逆機制及其發(fā)掘抗逆基因的模式生物而倍受關注(Hans J.Bohnert等.A genomics approachtowards salt stress tolerance，Plant Physiol.Biochem.2001，39，295-311)。
抑制差減雜交(Suppression subtractive hybri dization，SSH)技術(Diatchenko L.等，Suppression subtractive hybridizationa method forgenerating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes andlibraries.Proc.Natl Acad Sci USA，1996，93(12)6025-6030)是近年興起并廣泛應用于細胞生殖、發(fā)育、分化、癌變、衰老及程序化死亡等生命過程有關基因的差異表達以及相關基因的分子克隆的最有效的方法之一。
為了更好地從分子水平上對鹽藻進行耐鹽機制的研究、發(fā)掘可用于植物基因工程改良作物的抗逆基因資源，本領域迫切需要開發(fā)高鹽脅迫誘導表達的基因及其編碼蛋白。現(xiàn)有技術中沒有鹽藻高鹽脅迫誘導表達的基因及其分離鑒定的報道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人進行了廣泛的研究，利用當前的分子生物學技術如抑制差減雜交技術、基因芯片及生物信息學等構建了極端耐鹽的模式生物鹽藻(Dunaliellaviridis)受高鹽脅迫誘導的差減cDNA文庫，并從中克隆到10個新的受鹽脅迫誘導的基因片段和1個Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白基因cDNA(DvSPT1)和基因組DNA(GDvSPT1)，并對DvSPT1基因進行功能分析。
根據(jù)上述的研究工作，本發(fā)明所要解決的技術問題之一是提供鹽藻受高鹽脅迫誘導的差減cDNA文庫用于篩選鹽藻受高鹽脅迫誘導的基因。
本發(fā)明所要解決的技術問題之二是提供鹽藻受高鹽脅迫誘導的差減cDNA文庫的構建方法。
本發(fā)明所要解決的技術問題之三是提供鹽藻受高鹽脅迫誘導的cDNA片段。
本發(fā)明所要解決的技術問題之四是提供鹽藻的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白基因的cDNA序列及其全長基因序列。
另外，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供鹽藻的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白的氨基酸序列。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案如下采用本領域常用的抑制差減雜交法構建鹽藻高鹽脅迫誘導的差減cDNA文庫。優(yōu)選地鹽藻在低鹽條件下培養(yǎng)，用抑制差減雜交法構建差減cDNA文庫。優(yōu)選地，鹽藻在低鹽條件下培養(yǎng)，然后經(jīng)4倍滲透壓的高鹽脅迫誘導，鹽藻從0.5M NaCl到2.0M NaCl誘導24小時，用抑制差減雜交法構建差減cDNA文庫。
鹽藻高鹽脅迫誘導的差減cDNA文庫的構建方法包括如下步驟(a)鹽藻從低鹽到高鹽脅迫誘導；(b)提取鹽藻誘導前后的mRNA；(c)將(b)所獲得的mRNA反轉錄合成cDNA，誘導后的cDNA為測試cDNA(Tester cDNA)，誘導前的cDNA為參照cDNA(Driver cDNA)；(d)將Tester cDNA和Driver cDNA均用RsaI酶切產(chǎn)生較短的平末端片段；將Tester產(chǎn)物分成兩等份，分別與不同的接頭(Adaptor 1和Adaptor 2R)連接，而Driver cDNA不與接頭連接；(e)兩份Tester(Tester cDNA-Adaptor 1和Tester cDNA-Adaptor2R)分別與Driver cDNA混合，進行第一次差減雜交；(f)將(e)的兩份雜交產(chǎn)物未經(jīng)變性即進行混合，并加入過量Driver cDNA混合，進行第二次差減雜交；(g)接頭末端填平；(h)抑制性PCR擴增差異表達的序列；(i)用巢式引物(Nested Primer)進行第二輪PCR擴增，使差異表達的片段得到富集；(j)將(i)的擴增產(chǎn)物插入克隆載體，轉化感受態(tài)細胞，構建鹽藻高鹽脅迫誘導的差減cDNA文庫。
其中，提取鹽藻誘導前后的mRNA、反轉錄合成cDNA的方法在本領域是公知的，而且有商品化的產(chǎn)品可以使本領域的普通技術人員方便地實施之。通常將靶序列所在的樣本稱為檢測樣本(Tester)，而把用于參照的樣本稱為參照樣本(Driver)。在本發(fā)明中，鹽藻誘導后的mRNA即為測試樣本(Tester)而誘導前的mRNA即為參照樣本(Driver)。RsaI為四堿基位點(GTAC)識別酶，可以將由mRNA而來的雙鏈cDNA酶切為幾個片段并產(chǎn)生平末端，增加了差異表達基因檢出的幾率、防止長鏈cDNA片段所形成的復雜結構對有效差減雜交的干擾。接頭(Adaptor 1和Adaptor 2R)是由一長鏈(約40余個核苷酸)和一短鏈(約10余個核苷酸)組成的一端是平末端的雙鏈DNA片段，而且雙鏈兩個5’端均無磷酸基團，保證了接頭以唯一的方向與cDNA片段連接即接頭長鏈的3’端與cDNA的雙鏈5’端連接。接頭長鏈外側序列與第一次PCR引物序列相同，內(nèi)側序列與第二次PCR引物序列相同。在接頭上含有T7啟動子序列并含有內(nèi)切酶識別位點(如Not I、Srf I、Sma I、Xba I)，為以后該片段插入克隆載體提供酶切位點。接頭(Adaptor 1和Adaptor 2R)的序列對本領域的普通技術人員來說是公知的，或者采用商品化的產(chǎn)品。
在本發(fā)明構建鹽藻差減cDNA文庫的步驟(h)中選用與接頭(Adaptor 1和Adaptor 2R)外側端核苷酸序列相同的引物進行抑制差減PCR擴增。在步驟(i)中選用一對與接頭內(nèi)側端核苷酸序列相同的引物進行第二輪PCR擴增。這樣經(jīng)過兩輪PCR、基于PCR抑制效應的存在以及選用兩對引物可以特異擴增代表了鹽藻經(jīng)高鹽脅迫誘導的差異表達的cDNA片段。基于上述描述，接頭(Adaptor1和Adaptor 2R)的序列對本領域的普通技術人員來說是公知的，或者采用商品化的產(chǎn)品，因而步驟(h)和(i)所選用的引物對本領域的普通技術人員來說是公知的，或者采用商品化的產(chǎn)品。PCR擴增選用本領域常用的條件。
接頭上含有酶切位點，因而利用本領域公知的方法可以方便地實現(xiàn)將上述PCR產(chǎn)物插入克隆載體。用本領域常用的方法將插入了PCR產(chǎn)物的克隆載體轉化感受態(tài)細胞。
其中步驟(a)高鹽脅迫誘導鹽藻的方法是鹽藻在低鹽條件下培養(yǎng)，然后經(jīng)4倍滲透壓的高鹽脅迫誘導。在本發(fā)明的一個實施例中，鹽藻在含有0.5M NaCl的DM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有2.0M NaCl的DM培養(yǎng)基中誘導24小時。
利用接頭引物(步驟(h)和步驟(i)的引物)對上述差減cDNA文庫的部分克隆進行PCR鑒定。以差減cDNA第二輪PCR產(chǎn)物為探針，用d-32p dCTP標記，通過Micro-Array技術對所得到上述差減cDNA文庫的克隆做進一步鑒定，其中有11個cDNA克隆其表達明顯地受高鹽脅迫誘導而增強表達，并對這些克隆進行了測序和BLASTX分析。
因而，本發(fā)明提供了鹽藻受高鹽脅迫誘導的cDNA片段，SEQ ID NO1～11。其中SEQ ID NO8編碼了一個已知的葉綠素a/b結合蛋白(chlorophyll a/bbinding protein)，其余包括SEQ ID NO1～7及SEQ ID NO9～11在基因庫(Genbank)中無同源序列發(fā)現(xiàn)，均為可能的新基因。
本發(fā)明的另一方面，利用鹽藻高鹽脅迫誘導的差異cDNA片段(SEQ IDNO1)為探針篩選鹽藻cDNA文庫，得到1個特異陽性克隆，測序鑒定結果表明，cDNA全長是2649bp，含有綠藻基因特異的加尾信號TGTAA(Andrens HW等，Primary structure of the plasma membrane H-ATPase from the halotolerantalga Dunaliella bioculata.1995，Plant Mol Biol，28657-666)及poly(A)結構，命名為DvSPT1，SEQ ID NO12，系編碼鹽藻(Dunaliella viridis)的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白的全長cDNA。其中79～2097編碼鹽藻的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白。
在本發(fā)明的說明中，鹽藻cDNA文庫是指用本領域常用的方法提取鹽藻mRNA，然后反轉錄成cDNA，然后插入克隆載體并轉化感受態(tài)細胞而得到的代表鹽藻基因表達的cDNA文庫。而鹽藻差減cDNA文庫指本發(fā)明用抑制差減雜交法構建的鹽藻受高鹽脅迫誘導前后的差異表達cDNA文庫。
本發(fā)明另一方面還提供鹽藻(Dunaliella viridis)的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白，命名為DvSPT1，其氨基酸序列為SEQ ID NO13。
本發(fā)明還提供了鹽藻Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白的全長基因，命名為GDvSPT1，SEQ ID NO14。
本發(fā)明還提供了編碼鹽藻的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白的基因序列，SEQID NO15。由于密碼子具有簡并性，因而本發(fā)明的范圍不限于SEQ ID NO15的序列，應延及其編碼Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白的任一核苷酸改變。
利用本發(fā)明提供的鹽藻受高鹽脅迫誘導的差減cDNA文庫可以篩選鹽藻在受高鹽脅迫誘導時特異表達基因，如本發(fā)明的一個實施例篩選獲得了編碼鹽藻的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白的基因，SEQ ID NO12。因而利用本發(fā)明的成果能更好地從分子水平上對鹽藻進行耐鹽機制的研究和發(fā)掘可用于植物基因工程改良作物的抗逆基因資源。利用本發(fā)明的構建鹽藻受高鹽脅迫誘導的差減cDNA文庫的方法及構建的差減文庫可以快速、高效、高度靈敏地同時分離幾十甚至幾百個差異表達的基因。
本發(fā)明人提供的利用上述差減cDNA文庫分離獲得的受鹽脅迫誘導表達的基因片段SEQ ID No.1～11，除SEQ ID No.8以外，均為新基因片段，這為進一步分離鹽藻響應鹽脅迫相關基因的分離及耐鹽分子機制的研究奠定了基礎。
另外，本發(fā)明提供的Na+/H2POx-共轉運膜通道蛋白的基因DvSPT1基因cDNA及基因組序列GDvSPT1是首次從鹽藻中分離的新基因，其編碼了一個Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白，這個基因受高鹽脅迫和無機磷饑餓誘導特異表達，在鹽藻響應逆境脅迫過程中起到重要的作用。由于該基因編碼的通道蛋白DvSPT1為一個受無機磷饑餓誘導而快速增強表達而提高細胞無機磷的吸收和運輸，有望將該基因用于利用植物基因工程提高作物的土壤磷利用效率和分離得到一個受逆境特異誘導的啟動子原件。


圖1顯示了鹽藻Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白DvSPT1 cDNA序列及其編碼的氨基酸序列分析。
圖2顯示了鹽藻DvSPT1的氨基酸序列及同源蛋白的同源性比較分析，圖2A顯示的是N端同源性比較，圖2B顯示的是C端同源性比較。
圖3顯示了鹽藻Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白全長基因(GDvSPT1)5’-啟動子區(qū)(圖3)。
圖4顯示了鹽藻DvSPT1基因在高鹽脅迫(圖4A)和無機磷饑餓(圖4B)條件下的Northern表達分析。
下面結合具體實施方式
，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件和Sambrook等《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)或Melody S.Clark編《植物分子生物學—實驗手冊》(PlantMolecular BiologyA Laboratory Manual)(Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)或迪芬巴赫(Dieffenbach，C.W)等《PCR技術實驗指南》(PCR PrimerALaboratory Manual)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，2003，第二版)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。在描述了本發(fā)明和詳細描述了這些具體的實施方式之后，本領域的普通技術人員會充分知曉如何設計其它可靠的方法，從而通過應用本發(fā)明的成果獲得同樣的信息，因此無論描述得如何詳細具體，都不應理解為限制本發(fā)明的總體范圍。本發(fā)明的范圍僅為權利要求所記載的法律結構所確定。
具體實施例方式
實施例1鹽藻受高鹽脅迫誘導的差異cDNA文庫的構建及初步鑒定取在含有0.5mol/L NaCl的DM培養(yǎng)基(Sun Y等，Expression of foreigngene in Dunaliella by electroporation，Molecular Biotechnology，30(3)(2005)185-92)中穩(wěn)定培養(yǎng)的鹽藻細胞和再將上述培養(yǎng)狀態(tài)的鹽藻轉移到2mol/L NaCl濃度的培養(yǎng)基DM中繼續(xù)滲透振蕩培養(yǎng)24小時后的鹽藻細胞提取mRNA(OligotexTMmRNA Kit，QIAGEN)。按試劑盒(PCR-selectedTMcDNAsubtraction kit，clontech)要求，每一個樣品需要2μg的mRNA，由于純化的mRNA樣品中有少量rRNA的殘留，各取了2.4μg在兩種狀態(tài)下獲得的mRNA樣品，進行相應的cDNA合成。為了很方便的檢測合成效率，在反應中加入1μl以1/10稀釋的10mCi/ml，3000Ci/mmol的[α32-P]dCTP。第一鏈cDNA合成完成后，取出置于冰上終止第一鏈cDNA合成反應，立即進行第二鏈的合成。然后純化回收合成好的cDNA，并用蓋革計數(shù)器(Geiger counter)監(jiān)測沉淀的放射性以初步確認合成效率，再電泳檢測合成cDNA片段的大小和效率。結果表明合成的cDNA主要集中分布在500bp到4000bp的范圍內(nèi)，質(zhì)量好。
然后，選用四堿基識別位點(GTAC)并產(chǎn)生平頭末端的RsaI酶對合成好的cDNA進行酶切，酶切產(chǎn)物電泳檢測主要集中在200bp-1000bp的范圍。
將酶切樣品取部分作為Tester cDNA，并且每一份樣品分作兩份，分別連接上有一段同源序列的接頭(Adaptor 1和Adaptor 2R)。其余的經(jīng)過酶切的誘導前的cDNA樣品則作為Driver cDNA。連接反應完成后，取少量樣品進行連接效率檢測，樣品內(nèi)源激動蛋白的連接效率基本上＞25％，說明連接反應是成功的。
將以上兩端分別連有Adaptor 1和Adaptor 2R的cDNA作為Tester cDNA(2.0M)，與對應的Driver cDNA(0.5M)進行兩輪差減雜交反應，富集得到由0.5M到2.0M NaCl滲透振蕩時特異表達或受誘導的基因片段。將兩輪差減雜交下來的cDNA群體經(jīng)過末端補平后，即進行PCR擴增。在進行第一次PCR擴增之前，首先需要把cDNA的末端填平，以產(chǎn)生PCR Primer 1的結合位點。由于Adaptor1和Adaptor 2R的5’端有一個長22個堿基的相同片段，因此第一次PCR擴增時僅需使用一個引物，這就解決了引物聚合的問題。另外，對于這些兩端連有不同Adaptor的差異表達分子而言，這個相同的片段就造成了一種抑制PCR效果，由于短分子更易形成環(huán)狀結構，因此這種抑制效果對于非常短的cDNA(200bp以下)而言尤其明顯。這樣就大大的提高了長分子的含量，從而平衡差減過程中由短片段更易雜交、擴增和克隆而造成的潛在優(yōu)勢。第一次擴增后，只有兩端含有不同Adaptor的ds cDNA片段能以指數(shù)形式擴增。然后再用與接頭內(nèi)側序列互補的另一對巢式引物進行第二次PCR擴增，以進一步降低背景、富集差異表達的cDNA片段。
將經(jīng)過第二次擴增的PCR產(chǎn)物直接與pMD18-T Vector(TaKaRa)進行連接，轉化大腸桿菌DH5α熱激感受態(tài)細胞，構建了1個代表了鹽藻受0.5M～2.0M高鹽滲透誘導過程中特異表達基因片段的差減cDNA文庫(SSH cDNA文庫)。利用接頭引物(Nested PCR primer 1，Nested PCR primer 2R)對SSH文庫的部分克隆進行PCR鑒定，其插入片段的平均大小為300bp左右。
以差減cDNA第二輪PCR產(chǎn)物為探針，用α-32p dCTP標記，通過Micro-Array技術對所得到的SSH cDNA文庫384個克隆做進一步鑒定，每張膜上的矩陣分布為8*2，即每一個克隆在一個矩陣里有兩個重復。根據(jù)雜交信號的強弱，其中有11個cDNA克隆其表達明顯地受高鹽脅迫誘導而增強表達，并對這些克隆進行了測序和BLASTX分析(表1)。SEQ ID NO1～11參見序列表SEQ ID NO1～11。其中SEQ ID NO8編碼了一個已知的葉綠素a/b結合蛋白(chlorophyll a/bbinding protein)，其余包括SEQ ID NO1～7及SEQ ID NO9～11在基因庫(Genbank)中無同源序列發(fā)現(xiàn)，均為可能的新基因。
實施例2鹽藻Na+/H2PO4-共轉運膜通道基因的分離及序列分析(a)鹽藻Na+/H2PO4-共轉運膜通道基因全長cDNA的克隆及序列分析通過利用SSH差異片段CP1A60(SEQ ID NO1)為探針篩選鹽藻cDNA文庫，得到1個特異陽性克隆，測序鑒定結果表明，cDNA全長是2649bp(SEQID NO12)，含有綠藻基因特異的加尾信號TGTAA(Andrens HW等，Primarystructure of the plasma membrane H-ATPase from the halotolerant algaDunaliella bioculata.1995，Plant Mol Biol，28657-666)及poly(A)結構，命名為DvSPT1。Vector NTI8.0軟件的分析結果顯示，最長讀碼框編碼了一個含672個氨基酸的蛋白(圖3)(SEQ ID NO13)，蛋白分子量大小為73.3kDa，蛋白分子量大小為73.4kDa，等電點為5.29的酸性蛋白，命名為DvSPT1。
表1 SSH陽性克隆及可能編碼蛋白

序列分析顯示，CP1A60處在全長cDNA的3’端非翻譯區(qū)的2064-2304bp處，可見，所獲得的SSH cDNA片段并不在基因編碼區(qū)而在多變的非編碼區(qū)。
利用BLASTP程序?qū)vSPT1預測得到的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與其它物種來源的無機磷通道中的鈉/磷共轉運膜通道蛋白同源性較高(圖2)，如周氏扁藻的TcPHO，衣藻的B2型磷通道蛋白(BAB96548)，酵母的高親合性鈉依賴型磷通道蛋白PHO89(NP-009855)，鏈孢霉的高親合性鈉依賴型磷通道蛋白PHO4，白血病病毒受體高親合性鈉依賴型磷通道蛋白Na-Pi III(AAA52572)等。其中，DvSPT1編碼的蛋白同周氏扁藻TcPHO同源性最高，同源性可以達到31.2％，其次是衣藻的B2型磷通道蛋白，同源區(qū)段主要集中在N端和C端的跨膜區(qū)域(圖2)。進一步對所編碼的蛋白進行跨膜區(qū)的預測(http//www.ch.embnet.org/)顯示，DvSPT1蛋白為包含11個跨膜區(qū)的膜蛋白(圖1，圖2)，與以往描述的其它物種來源的無機磷通道蛋白有10-12個跨膜區(qū)的特征十分相似。但需要指出的是，DvSPT1的11個跨膜區(qū)呈不對稱分布，7個跨膜區(qū)分布在N-端，4個跨膜區(qū)分布在C-端，這與其它物種中發(fā)現(xiàn)的跨膜區(qū)通常呈對稱分布不同。
此外，DvSPT1這個蛋白中含有二段7個氨基酸殘基的保守重復序列-GANDVAN-(圖1，圖2)，與所有已報道的磷轉運通道蛋白中幾乎包含兩段-GANDVAN-保守序列的特征非常一致。DvSPT1的兩段-GANDVAN-保守序列處在N端的第一和第二跨膜區(qū)之間(57-63Aa)和C端的第八跨膜區(qū)(405-411Aa)處。
(b)鹽藻Na+/H2PO4-共轉運膜通道基因全長基因組序列的克隆及序列分析用CP1A60(SEQ ID NO1)為探針，從鹽藻的基因組文庫(Yang Zhiyong等，Construction of a genomic DNA library of Dunaliella viridis.ActaPhytophysiologica sinica 26(2000)75-78)經(jīng)過兩輪篩選得到1個特異的噬菌體克隆(λGDvSPT1-1)。提取噬菌體DNA，SacI酶切電泳，利用DvSPT1全長cDNA為探針進行Southern分析，雜交后只有一個單一的雜交帶(～8kb)，說明這個雜交片段已完全覆蓋了DvSPT1的cDNA全長序列。
將與DvSPT1全長cDNA雜交的λGDvSPT1-1#單一片段亞克隆并進行了測序，結果顯示，得到的基因序列全長為7925bp，包括位于第一翻譯起始密碼子上游的1321bp的5’啟動子序列(圖3)，同時也包括終止密碼子下游的1921bp的3’端終止序列。將DvSPT1cDNA序列與得到的基因全長序列通過GCG網(wǎng)站的BESTFIT程序進行分析，這個片段確實完全覆蓋了DvSPT1的編碼區(qū)域，因此將這個基因命名為GDvSPT1(SEQ ID NO14)。該基因包括20個外顯子(平均大小132bp)和19個內(nèi)含子(平均大小185bp)，所有內(nèi)含子的5’端都是GT，3’端都是AG(表2)(Shapiro，M.B.等，RNA splice junctionsdifferent classes of eukaryotes sequence statistics and functionalimplications in gene expression.Nucleic Acids Res.15(1987)7155-7174)。
網(wǎng)上(http//genes.mit.edu/McPromoter.html)預測(圖3A)顯示，GDvSPT1基因啟動子核心區(qū)域包括了一段50個堿基的序列，這段序列的起始點在-40bp處，在+10bp處終止，其中包括了可能的TATA box序列(TATAA)和轉錄的起始位點 如果將轉錄起始位點 定義為該基因序列的“+1”，其編碼區(qū)的第一個可能的起始密碼子ATG就位于在+462～+464bp處。值得注意的是，一個受Pho4p結合的核心序列(CACGT)(Uthappa T.Mukatira等，Negative regulation of phosphate Starvation-induced genes.PlantPhysiology.127(2001)1854-1862)位于-711～-715bp的位置，而Pho4p在酵母中研究的比較清楚，這提示從鹽藻克隆的這個基因很可能也是受PHO調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。而且，CACGT這個順式元件也是植物界一個與逆境相關的極其保守的調(diào)控元件(Heinemeyer T.等，Databases on transcriptionalregulationTRANSFAC，TRRD，and COMPEL.Nucleic Acids Res.26(1998)364-367)，表明所分離的這個基因跟適應外界逆境具有極為密切的關系。
實施例3鹽藻Na+/H2PO4-共轉運膜通道基因在高鹽脅迫和無機磷饑餓條件下的誘導表達(a)鹽藻Na+/H2PO4-共轉運膜通道基因在高鹽脅迫條件下的誘導表達為了研究DvSPT1這個基因在鹽藻細胞體內(nèi)轉錄水平及與鹽濃度之間的相關性，首先將鹽藻細胞在含1.0M NaCl的DM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在2×106cell/ml的時候收集細胞，然后將其轉移至含有2.0M NaCl的新鮮DM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在含有2.0M NaCl的新鮮DM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)0分鐘、30分鐘、1小時、3小時、6小時、9小時、12小時和24小時，然后提取鹽藻細胞總RNA，采用α-32P-dCTP標記的DvSPT1(2121bp-2633bp)的3‘端特異片段(PCR擴增引物DvT1RTS5’-ccctgttccactcactgc-3’(SEQ ID NO16)，DvT1RTA5’-gaacaggggtggtgcttaca-3’(SEQ ID NO17)，)為探針進行Northern分析(圖4A)。結果表明，鹽藻細胞經(jīng)歷1.0M NaCl→2.0M NaCl高滲振蕩后，DvSPT1基因受到誘導而表達增強。從雜交信號可以看出，這兩個基因的表達模式基本一致，在高滲振蕩1小時后2小時之前就開始受到誘導，而且到3小時快速積累到最高的轉錄水平。隨著誘導時間的延長，轉錄水平又逐漸降低，到24小時基本降低到正常培養(yǎng)條件下的表達水平。
(b)鹽藻Na+/H2PO4-共轉運膜通道基因在無機磷饑餓條件下的誘導表達為了進一步研究DvSPT1這個基因的表達水平是否受到無機磷饑餓的誘導，將生長在含有2.0M NaCl的DM培養(yǎng)基(0.2mM KH2PO4)中的鹽藻細胞，在其生長達到2×106cell/ml的時候收集，然后用新鮮的無磷培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，再重懸于無磷的等滲培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，分別取繼續(xù)培養(yǎng)0小時、1小時、3小時、6小時、18小時和36小時的鹽藻細胞提取總RNA，同上述相關實驗一樣，用α-32P-dCTP標記的DvSPT1的3‘端特異片段為探針進行Northern分析(圖4B)。結果顯示，DvSPT1的轉錄水平在無機磷饑餓處理1小時的時候開始受到明顯的誘導，在6小時轉錄水平達到最高，到18小時往后表達水平逐漸回落到一較為恒定的表達水平。Meira Weiss等(Meira Weiss，Gal Haimovich，Uri Pick，Phosphate and sulfate uptake in thehalotolerant alga Dunaliella are driven by Na+-symport mechanis m.J.Plant Physiology 158(2001)1519-1525)誘導動力學研究結果顯示鹽藻在無機磷饑餓3～6小時才可以檢測到無機磷的誘導吸收，這種誘導吸收主要是依賴于吸收速率的增加而不是Km值的變化，因此他們推測無機磷的誘導吸收是由于管家基因的誘導合成起作用而不是新的轉運系統(tǒng)的誘導產(chǎn)生。研究結果顯示DvSPT1在無機磷饑餓誘導6小時轉錄水平達到最高，這與Meria W.等所得到的動力學結果正好相符合，可以推斷，無機磷的誘導吸收是發(fā)生在無機磷轉運通道誘導轉錄完成之后或轉錄產(chǎn)物積累到一定的量的時候才開始的，這時候重新合成的轉錄產(chǎn)物經(jīng)過翻譯和后加工產(chǎn)生了足夠的無機磷轉運蛋白來增加細胞對環(huán)境中有限的無機磷的吸收來滿足正常的生長需要。
表2鹽藻Na+/H2PO4-共轉運膜通道基因(GDvSPT1)內(nèi)含子和外顯子組成

序列表<110>上海大學<120>受高鹽脅迫誘導的鹽藻基因片段和一個鹽藻Na+/H2PO4-共轉運通道基因的分離及鑒定<160>17<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>241<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>1gtacgagaac gtgtctgagc agaccatgcc ttaattctga agtcttgaca atcttttccc 60tgttccactc actgcactct tgctcttcag ttaccaattc atcctttttg aagtcttgct120tttgttctga gattgaacac taagcatgac ccgttctgtt gtgttcacat agccatatca180tttagtcagg tgttgtggct ggttcatatc ctgaccaaat ttagatctat tgctggtatt240g241<210>2<211>349<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<220>
<221>misc_feature<222>(174)..(175)<223>n is a，c，g，or t<220>
<221>misc_feature<222>(213)..(213)<223>n is a，c，g，or t<220>
<221>misc_feature
<222>(227)..(227)<223>n is a，c，g，or t<400>2cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 60ccattccaca ccacatacga gccggaagca taaagtgtaa aagctggggt gcctaatgag120tgagcttact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc ttccagtcgg ggannctgtc180gtgccagctg cattaatgat ccgccaacgc gcngggagag gccgttngcc tattgggcgc240tcttccggct tcctcgctca ctgactcgct gcggctcggt cgtttcggct gcggcgagcg300gtatcagctc actcaaaggc ggtattacgg gttattccac gaaatcagg349<210>3<211>257<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>3acaaacagga tgcattattc tcagatgcaa gtcacagatg cgagtcacaa aataccacca 60ggaaacaaga cgagctgcac atcaaacggg cagcaaagaa tagtattgag ttcagtgcac120agcacacatc cccaagccaa tggaaggtgt gtatgatctc aagccacagt tcggaaatcc180aaggggagtc cgcatgtgca tacagcattt atgaattgag tgaagcatac caatgaaatt240ccaattcagt tgtatgt 257<210>4<211>375<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>4acaggattgg gctagcttgg tcaggagcgt aactctgttt tgtgctgaga gttctgcttt 60aggcagcagg cacgcttgca tgagcagccc agttggatcc atttccaagc atgactcggt120tagcgcagtg ccaggcctaa taacagcact gttgctttcc aggtgcgcgg ttagagaaga180
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caattatatg taaaaa496<210>7<211>287<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>7acatgctgag gcagatcaac agcctgttca agttcacctt cttccccaga aacttctccg 60agttcgcggg cgcttctaac cagaccgttc cctagattag attatttcct aggtagtttg120caggtgtagt tgtagctggg acctagagct ctgtgtctga gctggcattg ctgggtaggc180agagagtagt gccagtagta gaagctgtcg ggagagagac aggcactcaa ggcggggatc240ctgaaagtgg atccttgtag atatttacga ccttggtgtt atgtggt 287<210>8<211>290<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>8acccaggcga ggccttcgac ccccctgggc ctggctgatg accctgacac cttcgctgag 60ctgaaggtca aggagatcaa gaacggccgt ctggctatgt tetcttgcct aggcttcttc120gtccaggcca ttgtgaccgg caagggcccc attgagaacc tgatggacca cctggccaac180cccgctgaga acaacgcctt cgccttcgcc accaagttca cccccaacgc ataaatgccg240gactctccct cccgatagta gttttcaatg taatgtaggt ctccagctgt 290<210>9<211>517<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<220>
<221>misc_feature<222>(491)..(491)
<223>n is a，c，g，or t<220>
<221>misc_feature<222>(510)..(510)<223>n is a，c，g，or t<400>9aactgcatgc ctgcatgtcg acgattagcg tggtcgcggc cgaggtaagg tgtttgagcc 60gcttgttgtg cttggaggca tcggccttgg cctcgctgcc tatgccctca agctcaagta120aggggtatgc tcgattcatg gctgtgttga acctctgaga gtttgcacct gagagtgact180tcaagcccaa ttggctggtt tgatttgagt gtagaaatgg tgatcacgtg atccatccag240ctttttccct tttcctttct tgtgctttgg acttaagttg cttcgagaaa ctttggcctt300tttatggcga gcttattcat tgtgcgctct gtgagcagct gaccacttca gtgaagctgg360acgcctgtgc tttattacgt tcatctactt gttggactgc taggtgtttt cagcacgtta420tgctgttaat tgattttggg attttatatg aacaggctga gaagtctgga tctgcatgcg480tgcacttgag nggactgagt taatgtgaan ggttgtt 517<210>10<211>242<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>10actaagcgca ccaccacgtg ctcctgttag cttggcccca tcagtcccca gcctctacta 60gatgacgtat gtgacacctg aagtgtgtgg gtttgtggtg tggccctgca cttgctgttg120cccaacgcgg cacaggcagt gagggtatgt aggtttactt cttgactgca gcagcagtgt180tctgcagttc gtgaagtggt gaggcagtgg atgtgtgttg caaacgcacc atcgctgcgt240gt 242<210>11<211>321
<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>11acaagctctc tcgttggcca ctcgataaca ccaacccagt gcagaaacaa taataaaatt 60ggcaatggaa atgctgtgca ttagagcaca tggagtggcc tttattcatc acagggctct120ggaaacaagc ttgctcacat cttactgttc aggatgcacc ttgttagcct ccttagtggc180ttccacgtcc gactttccac tgtcgctttc acctgctaga agcttctcat acgcagcctt240gccacgcatt gacctactct ccatggcaaa ccgcagaacc tgcccgggcg gccgctcgaa300atctctagag gatccccggg t 321<210>12<211>2649<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<220>
<221>CDS<222>(79)..(2097)<400>12cttgtacatc ggtgcacgca ccgagcccct ccccaccgcc acttcgtctg cgaaagcagg 60aggggtaggc acgcagcc atg acg gac gtg gac agc ttc agc ggc aac atg 111Met Thr Asp Val Asp Ser Phe Ser Gly Asn Met1 5 10ccc aac ctc tcg ggc ttt gag tcc gca gcg ggc tgg caa ggc gag aac 159Pro Asn Leu Ser Gly Phe Glu Ser Ala Ala Gly Trp Gln Gly Glu Asn15 20 25ttc acc tac cac gat ggc aag tgg tct gcc tac gtg tgg ctg ctg gtc 207Phe Thr Tyr His Asp Gly Lys Trp Ser Ala Tyr Val Trp Leu Leu Val30 35 40atc ggc tcc ttc acc tca ttc atg gct gca tgg ggc atc ggt gcc aac 255Ile Gly Ser Phe Thr Ser Phe Met Ala Ala Trp Gly Ile Gly Ala Asn45 50 55
gat gtg gcc aac tcc ttc gcc aca agt gtg ggc tcc aag gct ttg acc303Asp Val Ala Asn Ser Phe Ala Thr Ser Val Gly Ser Lys Ala Leu Thr60 65 70 75atg ttc caa gcc tgc gtg att gcg ggc atc ttt gaa ttt gtc ggc gct351Met Phe Gln Ala Cys Val Ile Ala Gly Ile Phe Glu Phe Val Gly Ala80 85 90gtg tcc ctg ggt ggt act gtt gtg aag acc gtg aag ggc tcc atc act399Val Ser Leu Gly Gly Thr Val Val Lys Thr Val Lys Gly Ser Ile Thr95 100 105gac ccc tca atg ttc aag cac cag ccc cag att ttt gcg tac ggc atg447Asp Pro Ser Met Phe Lys His Gln Pro Gln Ile Phe Ala Tyr Gly Met110 115 120ctt ggt gcc tct act tct gta gcc att gtg ctc ttc ctg gcc aca tac495Leu Gly Ala Ser Thr Ser Val Ala Ile Val Leu Phe Leu Ala Thr Tyr125 130 135ttg aag cag gct gtg tcc acc aca cac act gca att ggg tct gtg ctt543Leu Lys Gln Ala Val Ser Thr Thr His Thr Ala Ile Gly Ser Val Leu140 145 150 155ggc ttc ggc ttg gtg tat gga ggc gct gat ggt gtg acc tgg aac gag591Gly Phe Gly Leu Val Tyr Gly Gly Ala Asp Gly Val Thr Trp Asn Glu160 165 170gtg tcc gat gag ttc ccc ttc cgc aag ggg ttc aca cct gtc gtc atc639Val Ser Asp Glu Phe Pro Phe Arg Lys Gly Phe Thr Pro Val Val Ile175 180 185tcc tgg ttc gtc tcc ccc gtc ttc act gcc att ctg tcc tcc gga ttc687Ser Trp Phe Val Ser Pro Val Phe Thr Ala Ile Leu Ser Ser Gly Phe190 195 200ttc atc atc acc agg att gtc tgc ctg cag cgc cag caa tcc tac aag735Phe Ile Ile Thr Arg Ile Val Cys Leu Gln Arg Gln Gln Ser Tyr Lys205 210 215att gcc ttc ttc atg atc cct gtg ctg atg atg atc acc atc ttc att783Ile Ala Phe Phe Met Ile Pro Val Leu Met Met Ile Thr Ile Phe Ile220 225 230 235gtc ctg ctg gcc atc ttc ctg aag agt gtg gac tct gga cac gac cgt831Val Leu Leu Ala Ile Phe Leu Lys Ser Val Asp Ser Gly His Asp Arg
240 245 250gag ggt gag ctg aac tgg tcc aca gac aag aag gcc tgg gtg gca att879Glu Gly Glu Leu Asn Trp Ser Thr Asp Lys Lys Ala Trp Val Ala Ile255 260 265gtt gtc ggt gct ggt gcc ggt ctg ctg acc atc ccc tac acc atc tgg927Val Val Gly Ala Gly Ala Gly Leu Leu Thr Ile Pro Tyr Thr Ile Trp270 275 280ctg agg aag tcc atg ctc cag gag gac cag gaa gtg cac gag gag aat975Leu Arg Lys Ser Met Leu Gln Glu Asp Gln Glu Val His Glu Glu Asn285 290 295atg gct cgt gat gct gag acc gcc cac gtc gca gct ggt ggc aca ctg 1023Met Ala Arg Asp Ala Glu Thr Ala His Val Ala Ala Gly Gly Thr Leu300 305 310 315aag gag aag aac cct gag gat gat gtg cat gag ctg acc aag gct gag 1071Lys Glu Lys Asn Pro Glu Asp Asp Val His Glu Leu Thr Lys Ala Glu320 325 330aag ttt atg gag tgg ttc aac ggc acc tgg ttc ggc cag aga cag ttt 1119Lys Phe Met Glu Trp Phe Asn Gly Thr Trp Phe Gly Gln Arg Gln Phe335 340 345gtg aag aac ttt gtt gca gct atg aca tac gat gtg cac gcc cat gtg 1167Val Lys Asn Phe Val Ala Ala Met Thr Tyr Asp Val His Ala His Val350 355 360gcc acc atg gac aac ccc aag gtt gcc cag atg cat gca gat gct gag 1215Ala Thr Met Asp Asn Pro Lys Val Ala Gln Met His Ala Asp Ala Glu365 370 375gtc ttc gac ccc cgc act gag gat gtg ttt aag cgc atg cag atc atc 1263Val Phe Asp Pro Arg Thr Glu Asp Val Phe Lys Arg Met Gln Ile Ile380 385 390 395act gcc tct gct gtg gcc ttc gtg cac ggt gcc aat gat gtc gcc aac 1311Thr Ala Ser Ala Val Ala Phe Val His Gly Ala Asn Asp Val Ala Asn400 405 410ggt gtg ggc cct ctt gcc ggt atc tgg gac acc tac aac acc tac cag 1359Gly Val Gly Pro Leu Ala Gly Ile Trp Asp Thr Tyr Asn Thr Tyr Gln415 420 425
tct ggc agt ggc aag gcg tct cag ccc cgc tgg att ctg gtc atc ggt1407Ser Gly Ser Gly Lys Ala Ser Gln Pro Arg Trp Ile Leu Val Ile Gly430 435 440gct gct ggc att gtg ttc ggc ctg gcc atg tac ggc tac cgt atc att1455Ala Ala Gly Ile Val Phe Gly Leu Ala Met Tyr Gly Tyr Arg Ile Ile445 450 455gcg acc ctg ggt gtg gac ttg gtg gtc atg acc ccc aac cgt ggt tac1503Ala Thr Leu Gly Val Asp Leu Val Val Met Thr Pro Asn Arg Gly Tyr460 465 470 475tct gtg gag ctg gca gca gct gct atc att gcc ctg gcc tcc acg tac1551Ser Val Glu Leu Ala Ala Ala Ala Ile Ile Ala Leu Ala Ser Thr Tyr480 485 490ggt ctg ccc gtc tcc act acg caa gtt gtg act ggc ggt aag ata ggg1599Gly Leu Pro Val Ser Thr Thr Gln Val Val Thr Gly Gly Lys Ile Gly495 500 505gtg ggc atg tgc gag agc tgg aag atg aca ggc gtg aac tgg ctc ctg1647Val Gly Met Cys Glu Ser Trp Lys Met Thr Gly Val Asn Trp Leu Leu510 515 520ttt atc cgc acc ttc tgg ggc tgg gtt ggt gct ctg gtg act ggc gcc1695Phe Ile Arg Thr Phe Trp Gly Trp Val Gly Ala Leu Val Thr Gly Ala525 530 535atc ctc tca gct ctg ctc ttc tcc atc ggt gtg tac ggc ccc agc cgc1743Ile Leu Ser Ala Leu Leu Phe Ser Ile Gly Val Tyr Gly Pro Ser Arg540 545 550 555act gac ctg gac tac gtg acc cac tac cag agg gcg atg aag atc gac1791Thr Asp Leu Asp Tyr Val Thr His Tyr Gln Arg Ala Met Lys Ile Asp560 565 570atc gac cag tcc atg caa gct ctc ctt gac cg atgt gct gct gct cct1839Ile Asp Gln Ser Met Gln Ala Leu Leu Asp Arg Cys Ala Ala Ala Pro575 580 585gca cct acc aat ggt ggt gga ggc tgt ggc acc gga gac ttg aac tgc1887Ala Pro Thr Asn Gly Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Asp Leu Asn Cys590 595 600tct tgc cag cag agg atc ccc tac acc atg ggt gac ctg caa ggc ctg1935Ser Cys Gln Gln Arg Ile Pro Tyr Thr Met Gly Asp Leu Gln Gly Leu
605 610 615aag acg cag gtt gat ggg ctg ttc aac ttc gag gaa aat ggc cag atc1983Lys Thr Gln Val Asp Gly Leu Phe Asn Phe Glu Glu Asn Gly Gln Ile620 625 630 635aac gag tac aac atg atg tac atg ctg agg cag atc aac agc ctg ttc2031Asn Glu Tyr Asn Met Met Tyr Met Leu Arg Gln Ile Asn Ser Leu Phe640 645 650aag tac acc ttc ttc gat ggc gac ttc tct cag tac gag aac gtg tct2079Lys Tyr Thr Phe Phe Asp Gly Asp Phe Ser Gln Tyr Glu Asn Val Ser655 660 665gag cag acc atg cct taa ttctgaagtc ttgacaatct tttccctgtt 2127Glu Gln Thr Met Pro670ccactcactg cactcttgct cttcagttac caattcatcc tttttgaagt cttgcttttg 2187ttctgagatt gaacactaag catgacccgt tctgttgtgt tcacatagcc atatcattta 2247gtcaggtgtt gtggctggtt catatcctga ccaaatttag atctattgct ggtattgtgt 2307actggtggaa gcttgggttc ccagcatggt cgtctccctc aagtacgcag gctgtattgc 2367attacctctt gttgaccgaa gacagtatct cttctaccaa tgcttgttgc ctgaacctca 2427agcgtgactg tttcgttgct tcactcttgt gtgttggctc atatttcatt ttcaccttct 2487tcagcccact gaactgattg aataatgcaa ctgcaagaat aaacacacgt ctatgtatct 2547gcactgtttg tgcaattgat ccttcttgtt gatcattttg gaatcctccg ctgattgtgt 2607aaattttgta agcaccaccc ctgttcaaaa aaaaaaaaaa aa 2649<210>13<211>672<212>PRT<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>13Met Thr Asp Val Asp Ser Phe Ser Gly Asn Met Pro Asn Leu Ser Gly1 5 10 15
Phe Glu Ser Ala Ala Gly Trp Gln Gly Glu Asn Phe Thr Tyr His Asp20 25 30Gly Lys Trp Ser Ala Tyr Val Trp Leu Leu Val Ile Gly Ser Phe Thr35 40 45Ser Phe Met Ala Ala Trp Gly Ile Gly Ala Asn Asp Val Ala Asn Ser50 55 60Phe Ala Thr Ser Val Gly Ser Lys Ala Leu Thr Met Phe Gln Ala Cys65 70 75 80Val Ile Ala Gly Ile Phe Glu Phe Val Gly Ala Val Ser Leu Gly Gly85 90 95Thr Val Val Lys Thr Val Lys Gly Ser Ile Thr Asp Pro Ser Met Phe100 105 110Lys His Gln Pro Gln Ile Phe Ala Tyr Gly Met Leu Gly Ala Ser Thr115 120 125Ser Val Ala Ile Val Leu Phe Leu Ala Thr Tyr Leu Lys Gln Ala Val130 135 140Ser Thr Thr His Thr Ala Ile Gly Ser Val Leu Gly Phe Gly Leu Val145 150 155 160Tyr Gly Gly Ala Asp Gly Val Thr Trp Asn Glu Val Ser Asp Glu Phe165 170 175Pro Phe Arg Lys Gly Phe Thr Pro Val Val Ile Ser Trp Phe Val Ser180 185 190
Pro Val Phe Thr Ala Ile Leu Ser Ser Gly Phe Phe Ile Ile Thr Arg195 200 205Ile Val Cys Leu Gln Arg Gln Gln Ser Tyr Lys Ile Ala Phe Phe Met210 215 220Ile Pro Val Leu Met Met Ile Thr Ile Phe Ile Val Leu Leu Ala Ile225 230 235 240Phe Leu Lys Ser Val Asp Ser Gly His Asp Arg Glu Gly Glu Leu Asn245 250 255Trp Ser Thr Asp Lys Lys Ala Trp Val Ala Ile Val Val Gly Ala Gly260 265 270Ala Gly Leu Leu Thr Ile Pro Tyr Thr Ile Trp Leu Arg Lys Ser Met275 280 285Leu Gln Glu Asp Gln Glu Val His Glu Glu Asn Met Ala Arg Asp Ala290 295 300Glu Thr Ala His Val Ala Ala Gly Gly Thr Leu Lys Glu Lys Asn Pro305 310 315 320Glu Asp Asp Val His Glu Leu Thr Lys Ala Glu Lys Phe Met Glu Trp325 330 335Phe Asn Gly Thr Trp Phe Gly Gln Arg Gln Phe Val Lys Asn Phe Val340 345 350Ala Ala Met Thr Tyr Asp Val His Ala His Val Ala Thr Met Asp Asn355 360 365Pro Lys Val Ala Gln Met His Ala Asp Ala Glu Val Phe Asp Pro Arg370 375 380
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<221>misc_feature<223>引物<400>16ccctgttcca ctcactgc18<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>17gaacaggggt ggtgcttaca 20
權利要求
1.鹽藻差減cDNA文庫，其特征在于它是用抑制差減雜交法構建的鹽藻受高鹽脅迫誘導的差減cDNA文庫。
2.根據(jù)權利要求1所述的鹽藻差減cDNA文庫，其特征在于它是鹽藻在含有0.5M NaCl的DM培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)生長期，然后轉移到含有2.0M NaCl的DM培養(yǎng)基中誘導24小時，用抑制差減雜交法構建的差減cDNA文庫。
3.根據(jù)權利要求2所述的鹽藻差減cDNA文庫，其特征在于包括SEQ ID NO1～11的cDNA片段。
4.根據(jù)權利要求2或3任一所述的鹽藻差減cDNA文庫的構建方法，包括如下步驟(a)鹽藻從低鹽到高鹽脅迫誘導；(b)提取鹽藻誘導前后的mRNA；(c)將(b)所獲得的mRNA反轉錄合成cDNA，誘導后的cDNA為測試cDNA(Tester cDNA)，誘導前的cDNA為參照cDNA(Driver cDNA)；(d)將Tester cDNA和Driver cDNA均用RsaI酶切產(chǎn)生較短的平末端片段；將Tester產(chǎn)物分成兩等份，分別與不同的接頭(Adaptor 1和Adaptor 2R，)連接，而Driver cDNA不與接頭連接；(e)兩份Tester(Tester cDNA-Adaptor1和Tester cDNA-Adaptor2R)分別與Driver cDNA混合，進行第一次差減雜交；(f)將(e)的兩份雜交產(chǎn)物未經(jīng)變性即進行混合，并加入過量Driver cDNA混合，進行第二次差減雜交；(g)接頭末端填平；(h)抑制性PCR擴增差異表達的序列；(i)用巢式引物(Nested Primer)進行第二輪PCR擴增，使差異表達的片段得到富集；和(j)將(i)的擴增產(chǎn)物插入克隆載體，轉化感受態(tài)細胞，構建獲得鹽藻高鹽脅迫誘導的差減cDNA文庫，其特征在于，鹽藻在含有0.5M NaCl的DM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有2.0MNaCl的DM培養(yǎng)基中誘導24小時，誘導前后的鹽藻分別提取mRNA，用抑制差減雜交法構建cDNA文庫。
5.SEQ ID NO1～11任一的鹽藻cDNA片段。
6.含有權利要求5的鹽藻cDNA片段的載體。
7.包括權利要求6的鹽藻cDNA片段的載體的轉化體。
8.鹽藻的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白的全長cDNA，SEQ ID NO12。
9.含有權利要求8的鹽藻Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白的全長cDNA的載體。
10.包括權利要求9的載體的轉化體。
11.鹽藻的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白的全長基因，SEQ ID NO14。
12.鹽藻的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO13。
13.編碼如權利要求12所述的鹽藻的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白的核苷酸序列，SEQ ID NO15。
14.如權利要求13所述的編碼鹽藻的Na+/H2PO4-共轉運膜通道蛋白的核苷酸序列的片段。
15.根據(jù)權利要求8、11、13或14任一的核苷酸序列在植物基因工程育種的應用。
全文摘要
本發(fā)明受高鹽脅迫誘導的鹽藻基因片段和一個鹽藻Na
文檔編號C12N15/63GK1840664SQ200510030910
公開日2006年10月4日 申請日期2005年10月31日 優(yōu)先權日2005年10月31日
發(fā)明者許政暟, 李啟云, 高孝舒, 孫煜, 張慶琪, 宋任濤 申請人:上海大學