一種牛α-干擾素基因及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于干擾素領(lǐng)域，特別涉及一種牛α-干擾素基因及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 干擾素是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等功能的細(xì)胞因子，能通過多 種機(jī)制抑制病毒生長，促進(jìn)免疫細(xì)胞活性。α-干擾素（IFN-α)屬于I型干擾素，是由白細(xì) 胞分泌的一類具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。IFN-α與靶細(xì)胞的表面受體結(jié)合 后可以激活靶細(xì)胞內(nèi)潛在抗病毒基因的表達(dá)，產(chǎn)生具有酶活性的抗病毒蛋白（Anti-virual Protein，AVP)，使細(xì)胞具備抗病毒的能力，降低病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖速度，同時減少細(xì)胞感 染的損傷。隨著奶牛集約化養(yǎng)殖程度不斷提高，奶牛病毒性疾病的感染率也在逐年上升。 研究表明，牛α干擾素（BoIFN-α)可以抑制多種牛類病毒的增殖，包括牛傳染性鼻氣管炎 病毒（IBRV)、口蹄疫病毒（FMDV)、牛傳染性腹瀉病毒（BVDV)、牛呼吸道合胞體病毒（BRSV) 等。然而由于生產(chǎn)工藝和成本等問題，牛干擾素的研制還停留在實驗室階段，并未在臨床上 大量使用。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單和成本低廉兩個顯著特征，是應(yīng)用最廣泛的表 達(dá)系統(tǒng)之一，而國內(nèi)目前利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的BoIFN-α絕大多數(shù)完全以包涵體 的形式存在，需要經(jīng)過繁瑣的變性復(fù)性過程，才能獲得少量有活性的重組蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種牛α-干擾素基因及其制備方法和應(yīng)用， 在IPTG濃度為0. 64mmol/L，誘導(dǎo)溫度為15°C，誘導(dǎo)時間為9h的條件下，可溶性目的蛋白的 表達(dá)量最高，為36mg/L菌液，為牛α-干擾素的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[0004] 本發(fā)明的一種牛α -干擾素基因，其序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0005] 本發(fā)明的一種牛α-干擾素基因的重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒為rBoIFN-α-pCold II。
[0006] 本發(fā)明的一種牛a-干擾素基因的重組菌株，所述重組菌株為rBoIFN-a-pCold II/BL21〇
[0007] 本發(fā)明的一種牛a-干擾素基因的制備方法，包括：
[0008] 在BoIFN-a成熟蛋白編碼基因3'端添加終止密碼子TGA，分別在兩端設(shè)計Nde1/ HindIII酶切位點，即得。
[0009] 本發(fā)明的一種牛a-干擾素基因的應(yīng)用，具體步驟如下：
[0010] (1)將基因通過NdeI/HindIII雙酶切克隆至表達(dá)載體pColdII，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)后挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用Ndel/Hindlll雙酶切鑒定；
[0011] (2)挑取單個陽性重組菌落，置于含有氨芐的LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng) 菌液按1 :250比例接種于上述LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D6QQ= 0.4~0.6,加入IPTG 至終濃度為0. 01~0. 64mmol/L，5~35°C誘導(dǎo)1~21h后，收集菌體沉淀，加入裂解緩沖 液，充分懸浮混勻；置冰浴中超聲裂解，裂解產(chǎn)物離心，收集上清，沉淀用裂解緩沖液充分懸 浮，即得可溶性目的蛋白。
[0012] 所述氨節(jié)的濃度為0.lmg/mL。
[0013] 所述超聲裂解的具體條件為：超聲功率400w，工作5s、間隔5s，共計lOmin。
[0014] 有益效果
[0015] 本發(fā)明采用冷表達(dá)體系在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)出有活性的牛α-干擾素蛋白，具 有以下有益效果：
[0016] (1)本發(fā)明人工設(shè)計合成的牛α-干擾素基因選用大腸桿菌偏愛密碼子，有利于 密碼子在大腸桿菌中的識別和表達(dá)，從而可達(dá)到高效表達(dá)的目的；
[0017] (2)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)有利于重組蛋白的正確折疊，促進(jìn)了牛α-干擾素以可溶 性形式表達(dá)，該蛋白在非變性條件下經(jīng)一步純化即可獲得高純度產(chǎn)品，工序少，生產(chǎn)效率 尚；
[0018] (3)本發(fā)明獲得的可溶性表達(dá)的牛α-干擾素表達(dá)量高，能達(dá)到36mg/L，為后續(xù)規(guī) 模化生產(chǎn)打下了良好的基礎(chǔ)；
[0019] (4)上述牛α-干擾素蛋白實現(xiàn)良好的抗病毒活性，在MDBK細(xì)胞上的抗水泡性口 炎病毒（VSV)的活性可達(dá)1.0X106U/mg，具有良好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0020] 圖1為重組表達(dá)載體BoIFN-α-pColdII的雙酶切鑒定；其中，Μ為DNA標(biāo)準(zhǔn)；1 為Ndel和Hindlll雙酶切質(zhì)粒BoIFN-a-pColdII;2為未酶切對照質(zhì)粒BoIFN-a-pCold II;
[0021] 圖2為rBoIFN-α表達(dá)后的純化；其中，Μ為：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1為過柱前上清；2為 過柱后上清；3為洗脫液。
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0023] 實施例1
[0024] (1)BoIFN-α基因的優(yōu)化與合成
[0025] 為提高BoIFN-α在大腸桿菌中的表達(dá)水平，首先根據(jù)牛α干擾素成熟蛋白的基 因序列（登錄號：EU276064)，采用大腸桿菌偏愛的密碼子設(shè)計編碼BoIFN-a成熟蛋白基因 的核苷酸序列。BoIFN-α成熟蛋白編碼基因全長498bp，3'端添加終止密碼子TGA，分別在 兩端設(shè)計NdeI/HindIII酶切位點，根據(jù)設(shè)計合成BoIFN-a基因，序列如SEQIDN0:1所 不。
[0026] (2)BoIFN-α基因的克隆與鑒定
[0027] 將合成好的基因通過雙酶切（NdeI/HindIII)克隆至表達(dá)載體pColdII，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌BL21(DE3)后挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用Ndel/Hindlll雙酶切鑒定（圖 1)。酶切后，重組質(zhì)粒出現(xiàn)2條帶，其中1條帶大小約為500bp，與BoIFN-a基因的長度相 符，表明目的基因已經(jīng)克隆進(jìn)入重組表達(dá)載體中。陽性重組質(zhì)粒命名為rBoIFN-a-pCold II，陽性重組菌株命名為rBoIFN-α-pColdII/BL21。
[0028] (3)表達(dá)產(chǎn)物鑒定及誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化
[0029] ①轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定
[0030] 挑取單個陽性重組菌落，置于4mL含有0.lmg/mL氨芐的LB培養(yǎng)液中37°C振蕩 培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)菌液按1 :250比例接種于25ml上述培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D_ = 0. 4~0. 6 (培養(yǎng)約3h)，加入IPTG至終濃度為0. 03mmol/L，20°C誘導(dǎo)10h后8000r/min離 心5min，收集菌體沉淀，加入4mL裂解緩沖液，充分懸浮混勻。置冰浴超聲裂解（超聲功率 為400w，工作5s、間隔5s，共計lOmin)，裂解產(chǎn)物12000r/min離心15min，收集上清，沉淀用 4mL裂解緩沖液充分懸浮，取樣進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。結(jié)果誘導(dǎo)上清和沉淀均在約19ku 處出現(xiàn)目的蛋白條帶，說明目的蛋白在大腸桿菌中得到成功表達(dá)。
[0031] ②不同濃度IPTG對rBoIFN-α表達(dá)的影響
[0032] 設(shè)置8 個IPTG濃度（0、0· 01、0· 02、0· 04、0· 08、0· 16、0· 32 和 0· 64mmol/L)，以 15°C 誘導(dǎo)表達(dá)8h，按照①的方法對獲得菌液進(jìn)行處理，最后進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。結(jié)果表 明，隨著IPTG濃度的增加，上清與沉淀中的目的蛋白含量明顯增加，經(jīng)BandScan軟件分析 可知在IPTG濃度達(dá)到0.64mmol/L時，目的蛋白含量占上清蛋白總含量的比例最高，達(dá)到 38. 7%〇
[0033] ③不同誘導(dǎo)溫度對rBoIFN-α表達(dá)的影響
[0034] 設(shè)置4個溫度梯度（5、15、25和35°C)，以②中最佳IPTG濃度進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)8h。 經(jīng)BandScan軟件分析可知在15°C條件下，目的蛋白含量占上清蛋白總含量的比例最高，達(dá) 到 53. 2%〇
[0035] ④不同誘導(dǎo)時間對BoIFN-α表達(dá)的影響
[0036] 設(shè)置8個誘導(dǎo)時間，以②中最佳IPTG濃度和③中最佳誘導(dǎo)溫度進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果 上清中目的蛋白占總蛋白含量在l、3、6、9、12、15、18、21h分別為38. 3%、39. 5%、48. 9%、 49. 7%、43· 9%、41· 9%，43· 7%，40· 6%，目的蛋白在誘導(dǎo)9h時表達(dá)量最高。
[0037] (4)表達(dá)蛋白的純化及定量
[0038] 按照優(yōu)化條件和方法誘導(dǎo)表達(dá)250mL菌液，將離心菌體用8ml裂解緩沖液充分懸 浮后超聲破碎離心，取上清。按照Novagen公司的His-BindPurificationkit說明書對 獲得菌體上清液進(jìn)行親和層析純化，收集洗脫蛋白樣本進(jìn)行12%SDS-PAGE分析，過柱前目 標(biāo)蛋白條帶明顯，過柱后目標(biāo)位置沒有條帶出現(xiàn)，說明rBoIFN-α已經(jīng)與樹脂結(jié)合。洗脫后 的蛋白液在目標(biāo)位置出現(xiàn)明顯條帶，經(jīng)BandScan軟件分析，蛋白純度達(dá)到99. 2 % (圖2)。 根據(jù)測得的純化后的蛋白濃度計算，250ml菌液總量可純化獲得9mg左右的rBoIFN-α，即 最佳誘導(dǎo)條件下可溶性重組蛋白的表達(dá)量約為36mg/L菌液。
[0039] (5)重組rBoIFN-α抗病毒活性的測定
[0040] 采用微量細(xì)胞病變抑制法測定重組BoIFN-α的抗病毒活性，應(yīng)用MDBK/VSV測定 系統(tǒng)測定。在接種VSV18h后，未經(jīng)rBoIFN-α處理的MDBK細(xì)胞均出現(xiàn)CPE，而空白對照的 細(xì)胞均沒有出現(xiàn)CPE。試驗測得rBoIFN-α的抗病毒活性為1Xl〇6U/mg。
【主權(quán)項】
1. 一種牛α-干擾素基因，其特征在于：其序列如SEQIDN0:1所示。2. -種含如權(quán)利要求1所述的牛α-干擾素基因的重組質(zhì)粒。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種牛α-干擾素基因的重組質(zhì)粒，其特征在于：所述重組 質(zhì)粒為rBoIFN-a-pColdII。4. 一種含如權(quán)利要求1所述的牛a-干擾素基因的重組菌株。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種牛a-干擾素基因的重組菌株，其特征在于：所述重組 菌株為rBoIFN-a-pColdII/BL21。6. -種牛a-干擾素基因的制備方法，包括： 在BoIFN-a成熟蛋白編碼基因3'端添加終止密碼子TGA，分別在兩端設(shè)計NdeI/Hind III酶切位點，即得。7. -種含如權(quán)利要求1所述的牛a-干擾素基因的應(yīng)用，其特征在于：具體步驟如下： (1) 將基因通過NdeI/HindIII雙酶切克隆至表達(dá)載體pColdII，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)后挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用Ndel/Hindlll雙酶切鑒定； (2) 挑取單個陽性重組菌落，置于含有氨芐的LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)菌液 按1 :250比例接種于上述LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D6QQ= 0. 4~0. 6,加入IPTG至終 濃度為〇. 01~〇. 64mmol/L，5~35°C誘導(dǎo)1~21h后，收集菌體沉淀，加入裂解緩沖液，充 分懸浮混勻；置冰浴中超聲裂解，裂解產(chǎn)物離心，收集上清，沉淀用裂解緩沖液充分懸浮，即 得可溶性目的蛋白。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種牛a-干擾素基因的應(yīng)用，其特征在于：所述氨芐的濃 度為 0.lmg/mL。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種牛a-干擾素基因的應(yīng)用，其特征在于：所述超聲裂解 的具體條件為：超聲功率400w，工作5s、間隔5s，共計10min。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種牛α-干擾素基因及其制備方法和應(yīng)用，其序列如SEQ？ID？NO:1所示。制備方法包括：在BoIFN-α成熟蛋白編碼基因3’端添加終止密碼子TGA，分別在兩端設(shè)計Nde？I/Hind？III酶切位點，即得。應(yīng)用包括：將基因克隆到表達(dá)載體pCold？II中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得可溶性目的蛋白。本發(fā)明為牛α-干擾素的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N1/21, C12R1/19, C12N15/21, C07K14/56, C12P21/02, C12N15/70
【公開號】CN105349549
【申請?zhí)枴緾N201510750781
【發(fā)明人】張克春
【申請人】上海市奶牛研究所
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月6日