專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及細(xì)胞工程領(lǐng)域中的一種乳汁成分改進(jìn)的轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法。
背景技術(shù)：
“一杯奶強(qiáng)健一個(gè)民族”，隨著生活水平的提高，人們對奶制品的需求量越來越大。目前，中國已進(jìn)入了奶制品需求的快速增長期，近年來奶制品的人均消費(fèi)增長率每年都超過10％。至2015年，中國奶產(chǎn)品消費(fèi)總量將達(dá)到2500萬噸，年均增長6.8％，增長速度高于世界同期的1-2％。但中國奶產(chǎn)品的生產(chǎn)還處在一個(gè)比較落后的水平。隨著對奶制品需求的增加，奶制品的品質(zhì)越來越受到人們的關(guān)注。
攝入牛奶可導(dǎo)致人體過敏是不爭的事實(shí)。牛奶過敏癥是指人體對牛奶(主要是牛奶中的某些蛋白質(zhì)如α-S1酪蛋白和β-乳球蛋白)產(chǎn)生過敏反應(yīng)，也叫做牛奶蛋白不耐受。牛奶中的某些蛋白質(zhì)如α-S1酪蛋白和β-乳球蛋白是目前公認(rèn)的過敏源。正常情況下，如果這兩種蛋白質(zhì)能被人體消化吸收則不會引起人體的過敏反應(yīng)(即過敏源能被人體消化系統(tǒng)破壞)。但是，如果人體的消化能力不足，則這兩種蛋白質(zhì)可能以未被消化的形式進(jìn)入人體，從而引起過敏反應(yīng)。
新生嬰幼兒和老年人是容易發(fā)病人群。老年人因?yàn)橄芰ο陆?，對大分子長鏈蛋白質(zhì)難于消化，而新生嬰幼兒則是因?yàn)樗麄兊南到y(tǒng)和免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全。一般對新生嬰幼兒而言，0-6個(gè)月是最敏感的時(shí)期。
對付嬰幼兒牛奶過敏癥有兩種辦法切斷過敏源和藥物治療。
藥物治療雖能在短時(shí)間內(nèi)控制過敏的臨床癥狀，但是停藥后，若寶寶繼續(xù)食用牛奶，則過敏的癥狀又會再次出現(xiàn)。而且，藥物治療潛在的副作用不容忽視，尤其是針對皮疹(濕疹、奶癬)癥狀，經(jīng)常會使用激素藥膏。而長期反復(fù)使用激素類藥物會對寶寶產(chǎn)生較大的不良影響。
正常牛乳中含有約2.2-4.4％的蛋白質(zhì)，是牛乳中最重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一。牛乳中的蛋白質(zhì)主要包括酪蛋白、乳清蛋白及少量的脂肪球膜蛋白等。β-乳球蛋白屬于乳清蛋白的一種，在牛乳中的含量大約為2-4g/L。β-乳球蛋白是反芻動物中最主要的乳清蛋白，也存在于某些非反芻動物中，比如豬、馬、貓、狗、袋鼠、海豚和鯨魚。但人類、嚙齒類和兔類的乳汁中不含有該蛋白。在正常生理?xiàng)l件下，β-乳球蛋白以同源二聚體的形式存在，分子量為36,400道爾頓。在pH2-3或pH大于9的條件下，可以解聚為單體，在pH3.5-5.5，4℃的條件下，可以形成八聚體，即4個(gè)二聚體，以422對稱存在。
編碼β-乳球蛋白的基因全長4729bp，包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，其原始轉(zhuǎn)錄物編碼178個(gè)氨基酸殘基，包括長度16個(gè)氨基酸殘基的信號肽，其成熟肽含有162個(gè)氨基酸殘基，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)約占15％，β-折疊結(jié)構(gòu)約占50％。
基因敲除技術(shù)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)是同源重組(homologous recombination)，基因的同源重組是較普遍的生物學(xué)現(xiàn)象，從噬菌體、細(xì)菌到真核生物都有存在。同源重組發(fā)生的幾率一般在10-5-10-7之間，而非同源重組的發(fā)生幾率卻可以達(dá)到10-2-10-4之間。同源重組除可在DNA分子間進(jìn)行，還可在RNA分子間或RNA與DNA分子間進(jìn)行。
基因敲除技術(shù)是70年代在釀酒酵母(S.cerevisiae)中建立起來的。1985年，Smithies等人首次利用同源重組將一段外源質(zhì)粒PΔβ117插入到人染色體的β-globin位點(diǎn)，這是在哺乳動物細(xì)胞中打靶成功的第一例(Smithies，Ronald G等，Insertion of DNAsequences into the human chromosomal β-globin locus by homologousrecombination.Nature，1985，317230-234)。1987年，Thomas和Capecchi等兩個(gè)研究小組同時(shí)報(bào)道在ES(Embryo Stem)細(xì)胞進(jìn)行了基因的定位敲除(Thomas K R和Capecchi等，Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouseembryo-derived stem cells.Cell，1987，51503-512)。此后，用小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行基因敲除的研究蓬勃發(fā)展，現(xiàn)已成為研究基因結(jié)構(gòu)功能和建立人遺傳性疾病模型的一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。迄今已建立的突變小鼠有近千種，并以每年數(shù)百種的速度增長。
由于人、鼠在生理學(xué)上具有較大差異，小鼠模型也有其局限性。用大動物進(jìn)行基因敲除操作可省去煩瑣的分離動物胚胎干細(xì)胞的步驟，并避免了小鼠產(chǎn)生嵌合體的麻煩，可大大提高生產(chǎn)效率。此外，家畜如豬、牛、羊等在解剖和生理學(xué)上更接近人類，用它們做疾病動物模型更接近人。例如敲除膀胱纖維化跨膜誘導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(Cfrt)基因的小鼠模型未能明顯表現(xiàn)出類似人體條件下的肺部疾病特征，這主要是人和鼠的肺部生理學(xué)上存在較大差異造成的。但敲除Cfrt基因的綿羊可能會產(chǎn)生類似人體膀胱纖維化的精確模型，因?yàn)槿撕途d羊的肺部生理很相似。
大動物的基因打靶研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于小鼠，主要是因?yàn)槠渌鼊游餆o法建立ES細(xì)胞系，而體細(xì)胞克隆技術(shù)是自1997年克隆羊“Dolly”誕生之后才開展起來的。2000年6月，世界上第一只通過核移植生產(chǎn)的體細(xì)胞基因打靶綿羊誕生。PPL公司的McCreath等人在Nature上報(bào)道了選擇COL1A1基因?qū)ρ蛱撼衫w維細(xì)胞進(jìn)行基因打靶，得到三只存活羔羊(McCreath等，Production of gene targeted sheep by nucleartransfection from cultured somatic cells.Nature，2000，4051066-1069)。這一結(jié)果標(biāo)志著定點(diǎn)改變基因結(jié)構(gòu)、修復(fù)缺陷基因、敲除有害基因等遺傳工程方法的開始。利用該方法制備的轉(zhuǎn)基因羊外源基因的表達(dá)量可達(dá)60g/L乳汁，開辟了轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的新紀(jì)元。2002年2月，賴良學(xué)等人在Science報(bào)道了用克隆的方法生產(chǎn)了敲除α-1.3-半乳糖苷酶基因的克隆豬，豬細(xì)胞表面的末端α-1.3半乳糖苷(Gal)抗原決定簇的存在是用豬進(jìn)行異種移植時(shí)發(fā)生亞急性排斥反應(yīng)的根源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乳汁成分得到改進(jìn)的轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法。
本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法，是將線性化的攜帶有插入突變的β-乳球蛋白基因的靶載體通過同源重組與體細(xì)胞結(jié)合，形成β-乳球蛋白基因沉默的介導(dǎo)細(xì)胞，將介導(dǎo)細(xì)胞核導(dǎo)入牛的去核卵母細(xì)胞中得到重構(gòu)胚，再將重構(gòu)胚移入代孕母牛子宮中，得到的子代即為轉(zhuǎn)基因牛。
所述攜帶有突變的β-乳球蛋白基因的靶載體可具有序列表中序列1的核苷酸序列；所述移入代孕母牛子宮中的重構(gòu)胚是囊胚期胚。
所述體細(xì)胞可為牛胎兒成纖維細(xì)胞；所述牛胎兒成纖維細(xì)胞可為牛胎兒的耳成纖維細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞、顆粒細(xì)胞或成年成纖維細(xì)胞等，優(yōu)選為牛胎兒的耳成纖維細(xì)胞。
將線性化的攜帶有突變的β-乳球蛋白基因的靶載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞方法可為電轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣共沉淀法等常規(guī)的生物學(xué)轉(zhuǎn)染方法，優(yōu)選為電轉(zhuǎn)染法。
所述電轉(zhuǎn)染的條件為DNA濃度為18-22μg/mL，電場強(qiáng)度為1.2kV/cm，脈沖時(shí)間為7ms。
為提高轉(zhuǎn)基因效率，所述去核卵母細(xì)胞不含有第一極體。
所述將整合有線性化的攜帶有突變的β-乳球蛋白基因的靶載體的介導(dǎo)細(xì)胞核導(dǎo)入牛的去核卵母細(xì)胞的方法為顯微注射法。
本發(fā)明利用同源重組和體細(xì)胞克隆的方法將線性化的攜帶有插入突變的β-乳球蛋白基因的靶載體的體細(xì)胞核導(dǎo)入牛的去核卵母細(xì)胞中，使之與細(xì)胞染色體內(nèi)同源的靶序列進(jìn)行重組，最終得到β-乳球蛋白基因沉默的子代。用本發(fā)明所提供的方法獲得的轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)的乳汁，其乳汁成分中不含有β-乳球蛋白，更加近似于人奶，既有營養(yǎng)，又不會引起對牛奶的過敏反應(yīng)，使牛奶具有了更廣泛的食用人群。本發(fā)明具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場前景。


圖1為體細(xì)胞克隆β-乳球蛋白基因敲除轉(zhuǎn)基因牛的生產(chǎn)流程2為β-乳球蛋白基因敲除載體構(gòu)建示意3為轉(zhuǎn)基因克隆牛的PCR檢測結(jié)果圖4為轉(zhuǎn)基因克隆牛的PCR檢測結(jié)果圖5為轉(zhuǎn)基因克隆牛的Southern鑒定結(jié)果圖6為轉(zhuǎn)基因克隆牛的Southern鑒定結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中如無特別說明均為常規(guī)方法，所用試劑及藥品如無特別說明均購自Sigma公司。
實(shí)施例1、體細(xì)胞克隆β-乳球蛋白基因敲除的轉(zhuǎn)基因牛的生產(chǎn)及分子生物學(xué)檢測體細(xì)胞克隆β-乳球蛋白基因敲除轉(zhuǎn)基因牛的生產(chǎn)流程如圖1所示，具體過程包括以下步驟1、β-乳球蛋白基因敲除靶載體的構(gòu)建β-乳球蛋白基因敲除載體構(gòu)建過程如圖2所示，具體方法如下以牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組DNA為模板，在引物pLeft upper5’-cagcggccgctagactgtgtgaatgcccactgac-3’(帶下劃線部分堿基為限制性內(nèi)切酶NotI識別位點(diǎn))和引物pLeft lower5’-ctctcgagcttcatggtctgggtgacaatgag-3’(帶下劃線部分堿基為限制性內(nèi)切酶XhoI識別位點(diǎn))的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增2488bp的DNA片段，PCR反應(yīng)條件為94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃150s，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收2488bp的特異性PCR產(chǎn)物，將其用限制性內(nèi)切酶Not I和Xho I酶切后與經(jīng)相同酶酶切的載體pLox連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑選白色單菌落提質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pLox-BLG-Left，在該質(zhì)粒中包含了β-乳球蛋白基因的啟動區(qū)和第一外顯子。
以牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組DNA為模板，在引物pRight upper5’-tcattgtcacccagaccatgaag-3’和引物pRight lower5’-tgccaccgagcggctgtcctgg-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增6326bp的DNA片段，PCR反應(yīng)條件為94℃5min；94℃30s，66℃30s，72℃7min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收6326bp的特異性PCR產(chǎn)物，將其與載體pMD18-T(具有G418抗性標(biāo)記基因，TaKaRa公司)連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑選白色單菌落提質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pMD18-Right，在該質(zhì)粒中包含了β-乳球蛋白基因的部分第一外顯子和編碼區(qū)。
將pMD18-Right用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sal I酶切后與經(jīng)相同酶酶切的重組載體pLox-BLG-Left連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑選白色單菌落提質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切和測序鑒定，得到β-乳球蛋白基因敲除靶載體，命名為pLox-BLG-KO，對其進(jìn)行核苷酸序列測定，該載體具有序列表中序列1的核苷酸序列，與正常的β-乳球蛋白基因的核苷酸序列相比，載體上β-乳球蛋白基因的開放閱讀框獲得了插入突變。將質(zhì)粒載體pLox-BLG-KO經(jīng)限制性內(nèi)切酶Not I酶切線性化后，進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用QIAEX II試劑盒(QIAGEN公司)回收并純化16874bp的線性片段，將其溶解于經(jīng)滅菌的超純水中，-20℃保存。該序列中自5’端第6-2487位DNA序列為包含BLG基因的啟動區(qū)序列和第一外顯子的同源左臂序列，自5’端第2562-4335位DNA序列為插入的新霉素基因，自5’端第4382-10702位DNA序列為包含BLG基因部分第一外顯子及其編碼序列的同源右臂序列，自5’端第11254-12450位DNA序列為tk基因的編碼區(qū)。
2、牛胎兒耳成纖維細(xì)胞系的建立選用5月齡的荷斯坦奶牛胎兒(購自北京市奶牛中心)，取下胎兒耳朵，用PBS和70％酒精清洗數(shù)遍后，剪碎成體積約為1mm3的小塊，再用DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)清洗2遍后分批植塊于裝有3mL DMEM培養(yǎng)基(含10％FBS)的容積為75cm3的培養(yǎng)瓶中，待組織塊貼壁牢固后再補(bǔ)加DMEM(含10％FBS)至10mL，將其置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-7d，每2d換液1次，待細(xì)胞生長匯合后，用0.25％胰蛋白酶(Invitrogen公司)消化再傳代2-3次，液氮保存(凍存液成分為60％DMEM，30％FBS和10％DMSO)，得到牛胎兒耳成纖維細(xì)胞系。
3、牛胎兒耳成纖維細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染和篩選收集處于對數(shù)生長期的牛胎兒耳成纖維細(xì)胞，用電擊液HeBS(含140mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，0.75mmol/L Na2HPO4，6mmol/L葡萄糖和25mmol/L Hepes)重懸細(xì)胞至濃度為5×106個(gè)/mL，在DNA濃度為20μg/mL、電場強(qiáng)度為1.2kV/cm、脈沖時(shí)間為7ms的條件下進(jìn)行電擊，將載體pLox-BLG-KO的線性化片段轉(zhuǎn)染牛胎兒耳成纖維細(xì)胞，48h后加入800μg/mL G418和2uM/L Gancvilor(Sigma)作為篩選壓力進(jìn)行篩選，每2-3d換液1次，14d后用0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化收集克隆點(diǎn)細(xì)胞并繼續(xù)用300μg/mLG418和2uM/L Gancvilor篩選4-5代，待生長匯合并血清饑餓2-4d后用于體細(xì)胞核移植。
4、卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)將成年黃牛的卵巢(取自周邊地區(qū)屠宰場)用37℃的PBS液清洗三遍后，用直徑為0.7mm的針頭抽取直徑為2-8mm的卵泡，回收形態(tài)均勻、結(jié)構(gòu)致密的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體(COCs)，將其用成熟液(在M199的基礎(chǔ)上添加10％FBS，0.01U/mL bFSH，0.01U/mL bLH和1μg/mL雌二醇)洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體按50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，置于38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)18-20h后，將成熟的卵母細(xì)胞放入含0.1％透明質(zhì)酸酶的管內(nèi)振蕩2-3min后，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞完全脫離，選擇形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體。
5、核移植和克隆胚胎的體外培養(yǎng)將步驟4獲得的帶有第一極體的卵母細(xì)胞移入操作液(在M199的基礎(chǔ)上添加了10％FBS和7.5μg/mL細(xì)胞松馳素B)中，在200倍顯微鏡下用一玻璃針于極體上方將透明帶切一小口，再用內(nèi)徑為20μm的玻璃管將第一極體及其下方的卵母細(xì)胞內(nèi)的染色體一并吸除，再用含20％FBS的M199液體培養(yǎng)基洗三遍后，置于38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中備用。將步驟3獲得的血清饑餓2-4d的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化2-4min，選擇直徑為10-12μm的胎兒耳成纖維細(xì)胞核，用20μm直徑玻璃管將其移入去核的卵母細(xì)胞透明帶內(nèi)，然后將其放入含0.3M甘露醇(Mannitol)，0.15mmol/L Ca2+和0.15mmol/L Mg2+的溶液中，3-5min后放入融合槽內(nèi)，轉(zhuǎn)動卵細(xì)胞使供體細(xì)胞核與卵母細(xì)胞接觸面與電場垂直，同時(shí)在直流脈沖的場強(qiáng)為2.5kV/cm、脈沖時(shí)間為10μs、脈沖次數(shù)為2次、脈沖間隔為1s的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速將重構(gòu)胚移入含10％FBS的M199液體培養(yǎng)基中，放置0.5h后觀察融合率，挑選融合胚進(jìn)行下一步的激活處理。將重構(gòu)胚放入5μmol/L離子霉素(Ionomycin，Sigma)液中，4min后移至1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入含5％FBS的CR1aa液中，在38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在2d和7d后觀察胚胎的發(fā)育狀況。
6、胚胎移植與妊娠檢測將形態(tài)優(yōu)良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體牛的子宮角內(nèi)。在移植后的第30d對受體母牛進(jìn)行B超檢測以確定受胎情況，并分別在移植后的第60d和第90d進(jìn)行直腸檢測以確定妊娠率。共移植受體牛15頭，移植后第60d的直腸檢測表明，其中8頭懷孕。最終有2頭轉(zhuǎn)基因克隆牛出生，產(chǎn)犢率為13.3％。
7、轉(zhuǎn)基因克隆牛的分子生物學(xué)鑒定1)PCR鑒定采集步驟6獲得的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因克隆牛耳部的組織樣品，按常規(guī)方法提取基因組DNA，并以其為模板，分別在引物對1(引物T1upper5’-GTCTGAAGGCAGCTCGCTGTG-3’和引物T1 lower5’-GGGAAACCAGGGCACGCAAAG-3’)和引物對2(引物T2 upper5’-TATTGGCAGGCAGATTCTTTACCAC-3’和引物T2 lower5’-tgttaagcgggtcgctgca-3’)的引導(dǎo)下，對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因克隆牛的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，以普通荷斯坦奶牛的基因組DNA作為陰性對照，以β-乳球蛋白基因的敲除載體pLox-BLG-KO作為陽性對照。引物對1的PCR反應(yīng)條件為先94℃5min；然后94℃30sec，61℃30sec，72℃180sec，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃7min。反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖3(泳道1為1kb Marker，泳道2為陽性質(zhì)粒pLox-BLG-KO，泳道3為滅菌蒸餾水，泳道4為普通荷斯坦奶牛，泳道5和泳道6為β-乳球蛋白基因敲除克隆牛)所示，表明轉(zhuǎn)基因克隆牛可擴(kuò)增出1143bp的野生型條帶和3087bp的插入型條帶，而普通荷斯坦奶牛僅能擴(kuò)出1143bp的野生型條帶。引物對2的PCR反應(yīng)條件為先94℃5min；然后94℃30sec，61℃60sec，72℃30sec，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃7min。反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖4(泳道1為1kb Marker，泳道2為陽性質(zhì)粒pLox-BLG-KO，泳道3為滅菌蒸餾水，泳道4為普通荷斯坦奶牛，泳道5和泳道6為β-乳球蛋白基因敲除克隆牛)所示，表明轉(zhuǎn)基因克隆牛與正常荷斯坦奶牛都不能擴(kuò)增出1182bp的tk基因條帶，而只能在載體上擴(kuò)增得到。
2)Southern鑒定取約10μg轉(zhuǎn)基因克隆牛耳部組織的基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶Eco72I酶切消化，30V低壓電泳，轉(zhuǎn)膜后，進(jìn)行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標(biāo)記的、經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoI和XbaI酶切消化的pLox-BLG-KO載體回收產(chǎn)物，以普通荷斯坦奶牛的基因組DNA作為陰性對照，以敲除載體pLox-BLG-KO作為陽性對照，雜交陽性信號為3.2kb片段，結(jié)果如圖5所示(泳道1，2為兩頭β-乳球蛋白基因敲除克隆牛，泳道3為普通荷斯坦奶牛，泳道4為1拷貝陽性質(zhì)粒，泳道5為5拷貝陽性質(zhì)粒，泳道6為10拷貝陽性質(zhì)粒)又約10μg轉(zhuǎn)基因克隆牛耳部組織的基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶MscI酶切消化，30V低壓電泳，轉(zhuǎn)膜后，進(jìn)行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標(biāo)記的、經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalI和HindIII酶切消化的pLox-BLG-KO載體回收產(chǎn)物，以普通荷斯坦奶牛的基因組DNA作為陰性對照，以敲除載體pLox-BLG-KO作為陽性對照，雜交陽性信號為5.6kb片段，如圖6所示(泳道1，2為兩頭β-乳球蛋白基因敲除克隆牛，泳道3為普通荷斯坦奶牛，泳道4為1拷貝陽性質(zhì)粒，泳道5為5拷貝陽性質(zhì)粒，泳道6為10拷貝陽性質(zhì)粒)。上述結(jié)果表明在這兩頭β-乳球蛋白敲除個(gè)體的基因組的BLG基因座位上發(fā)生了預(yù)期的同源重組。Southern Blot鑒定結(jié)果和PCR檢測結(jié)果完全一致。
進(jìn)一步的跟蹤實(shí)驗(yàn)表明，用本發(fā)明的方法得到的轉(zhuǎn)基因牛長成后，其分泌的乳汁中不含有β-乳球蛋白，但其它的成分與普通牛奶沒有差別。
序列表<160>1<210>1<211>16874<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ggccgctaga ctgtgtgaat gcccactgac cctgcccagc cccacagttt cattctgaga60gaagtgattt cttgcttctg cacttacagg cccaagacct gacctgcttc tgaagagcag120gggttttggc aggaggggga gatgctgaga gccgatgggg gtccaggtct cctcccaggt180cccactctct ggggcagcgc ttggaaaaga ttgtccagcc tccctcccat agtggtcagt240gccagctgcc ccaggccaga ggtgctttat ttccgtctct ctctctggat ggtattctct300ggaagctgaa ggttcctgga agttatgaat agctttgcca tgaagggcat ggtttgtggt360catggttcac aggaacttgg gagaccctgc agctcggacg tcctgaggtt ggtggcaccc420tgatttccta agctcgctgg ggaacggggt gctacttctc cctggctgac ctccctctgc480tctgcatcac ccagttctga gagcagagtg gtgctggggg cacagcctct cgcatctgac540acttgtgttc aaaccaccca tgctggtgtt cggggggcca cctatgggga aggctcctca600ctgcaggggt gcccctgtcc cctgagagat cagaagtccc agtctggatg tcgaatggcc660gagctccctc cagaggctcc agggagggat ccttgccccc tccgccgccg cctccagctc720ctggtgccgc acccttgggc ccgatctcgt agacgcctca gtccagtctc tgcctccgtg780ttcactggca ttctccccat gtcccctctg tgtccccgtt ttctctcaca aggacaccgg840acataagatt agcccccgtt ccagcatcac ctgaacagct cacatctgta aagacctaga900ttccaaacaa gattccatcc tgaagttcct ggtggacgtg agttctggag cgacgccctt960caaccccatc acagcttgcg gttcatcgca aaacacggaa cctgggattt atcgtaaaac 1020ccaggttctt cgtgaaacac tgagcttcga ggcttgttgc aagaattaaa ggtgctaata 1080cagatcaggg caaggaccga agctggccaa gcctcctctt tccatcacag gaaagggagg 1140tctgggggcg gccgggggtc tgctcccgtg ggtgggctct ttctggtaca gtcaccaaca 1200gtctctccgg gaaggaaacc agaggccaga gagcaagcca gagctagtct aggagatccc 1260
tgagcctcca cccaagatgc cgaccaggcc agcgggcccc ctggaaagac cctacagtct1320agggggggaa caggagccga cccgccaggc ccccgctatc aggagacacc ccaaccttgc1380tcctgttccc ctaccccagt acgcccaccc gacccctgag atgagtggtt tacttgctta1440gaatgtcaat tgaaggcttt tgtaccccct ttgccagtgg cacagggcac ccacagcccg1500ctgggtactg atgcccatgt ggactcagcc aggaggactg tcctgcgccc tccctgctcg1560ggccccctcc atactcagcg acacacccag caccagcatt cccaccactc ctgaggtctg1620aaggcagctc gctgtggtct gagcggtgcg gagggaagtg ccctgggaga tttaaaatgt1680gagaggtggg aggtgggagg ttgggtcctg taggccttcc catcccacgt gcctgcacgg1740agccctagtg ctactcagtc atgcccccgc agcaggggtc aggtcacttt cccatcctgg1800gggttattat gactgttgtc attgttgttg ccatttttgc taccctaact gggcagcggg1860tgcttgcaga gccctcgata ctgaccaggt tcccccctcg gagctcgacc tgaaccccat1920gtcaccctcg ccccagcctg cagagggtgg ggtgactgca gagatccctt tacccaaggc1980cacagtcaca tggtttggag gagatggtgc ccaaggcaga agccaccctc caggacacac2040ctgcccccag tgctggctct gacctgtcct tgtctaagag gctgacccca gaagtgttcc2100tggcgctggc agccagcctg gacccagagc ctggacaccc cctgcgcccc cacttctggg2160gcgtaccagg aaccgtccag gcccagaggg ggccttcctg cttggcctcg aatggaagaa2220ggcctcctat tgtcctcgta gaggaagcaa ccccagggcc caaggatagg ccagggggga2280ttcggggaac cgcgtggctg ggggcccggc ccgggctggc tggctggccc tcctcctgta2340taaggccccg agcccgctgt ctcagccctc cactccctgc agagctcaga agcgtgaccc2400cagctgcagc catgaagtgc ctcctgcttg ccctggccct cacttgtggc gcccaggccc2460tcattgtcac ccagaccatg aagctcgaga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt2520tatagtcgag ggcccctgca ggtcaattct accgggtagg ggcagtcttt tcccaaggca2580gtctggagca tgcgctttag cagccccgct gggcacttgg cgctacacaa gtggcctctg2640gcctcgcaca cattccacat ccaccggtag gcgccaaccg gctccgttct ttggtggccc2700cttcgcgcca ccttctactc ctcccctagt caggaagttc ccccccgccc cgcagctcgc2760gtcgtgcagg acgtgacaaa tggaagtagc acgtctcact agtctcgtgc agatggacag2820caccgctgag caatggaagc gggtaggcct ttggggcagc ggccaatagc agctttgctc2880cttcgctttc tgggctcaga ggctgggaag gggtgggtcc gggggcgggc tcaggggcgg2940gctcaggggc ggggcgggcg cccgaaggtc ctccggaggc ccggcattct gcacgcttca3000aaagcgcacg tctgccgcgc tgttctcctc ttcctcatct ccgggccttt cgacctgatg3060attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc3120tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg3180caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag3240gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc3300gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat3360
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1.一種轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法，是將線性化的攜帶有突變的β-乳球蛋白基因的靶載體通過同源重組與體細(xì)胞結(jié)合，形成β-乳球蛋白基因沉默的介導(dǎo)細(xì)胞，將介導(dǎo)細(xì)胞核導(dǎo)入牛的去核卵母細(xì)胞中得到重構(gòu)胚，再將重構(gòu)胚移入代孕牛子宮中，得到的子代即為轉(zhuǎn)基因牛。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法，其特征在于所述攜帶有突變的β-乳球蛋白基因的靶載體具有序列表中序列1的核苷酸序列；所述移入代孕牛子宮中的重構(gòu)胚是囊胚期胚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法，其特征在于所述體細(xì)胞為牛胎兒成纖維細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法，其特征在于所述牛胎兒成纖維細(xì)胞為耳成纖維細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞或卵丘細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法，其特征在于所述牛胎兒成纖維細(xì)胞為耳成纖維細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有突變的β-乳球蛋白基因的靶載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞方法為電轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或磷酸鈣沉淀法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有突變的β-乳球蛋白基因的靶載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞方法為電轉(zhuǎn)染法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法，其特征在于所述電轉(zhuǎn)染的條件為DNA濃度18-22μg/mL，電場強(qiáng)度1.2kV/cm，脈沖時(shí)間7ms。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法，其特征在于所述去核卵母細(xì)胞帶有第一極體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法，其特征在于所述將整合有線性化的攜帶有突變的β-乳球蛋白基因的靶載體的介導(dǎo)細(xì)胞核導(dǎo)入牛的去核卵母細(xì)胞的方法為顯微注射法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法。該轉(zhuǎn)基因牛的獲得方法，是將線性化的攜帶有突變的β－乳球蛋白基因的靶載體通過同源重組與體細(xì)胞結(jié)合，形成β－乳球蛋白基因沉默的介導(dǎo)細(xì)胞，將介導(dǎo)細(xì)胞核導(dǎo)入牛的去核卵母細(xì)胞中得到重構(gòu)胚，再將重構(gòu)胚移入代孕牛子宮中，得到的子代即為轉(zhuǎn)基因牛。用本發(fā)明所提供的方法獲得的轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)的乳汁，其乳汁成分中不含有β－乳球蛋白，更加近似于人奶，既有營養(yǎng)，又不會引起對牛奶的過敏反應(yīng)，使牛奶具有了更廣泛的食用人群。本發(fā)明具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場前景。
文檔編號C12N15/87GK1865448SQ20051007097
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月19日
發(fā)明者徐慰倬, 李寧, 戴蘊(yùn)平 申請人:李寧