專利名稱：一種消除單核細(xì)胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛭弧菌，特別涉及一種消除單核細(xì)胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
單核細(xì)胞增生李斯特菌(""^7'。 mo"oc"oge"^)，簡稱單增李斯特菌LM，是一種人畜共患病的病原菌。它廣泛存在于自然界中，在絕大多數(shù)食品中如蔬菜、奶及奶制品、生肉、熟肉制品和水產(chǎn)品中都存在。食用污染了單增李斯特菌的食品后，可導(dǎo)致李斯特菌病。李斯特菌病能導(dǎo)致較高的死亡率，是僅次于沙門氏菌感染的致命性食源性疾病。據(jù)美國CDC(Center for Disease Control andPrevention)統(tǒng)計，2003年美國李斯特菌病的平均發(fā)病率為3.3/100萬人。目前國內(nèi)己有單增李斯特菌引起孕婦發(fā)病，導(dǎo)致胎兒死亡的報道。該菌能在2 42'C環(huán)境下生存，能在冰箱內(nèi)較長時間生長并且繁殖，危險性極大，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。WHO (World Health Organization)將其列為20世紀(jì)90年代食品中四大致病菌之一 。
對于食品中攜帶單增李斯特菌的消除，目前的處理方式也僅局限在普通的滅菌方式，如巴氏殺菌，化學(xué)方法滅菌等。普通的殺菌方式往往會造成細(xì)菌的殘留，同時傳統(tǒng)滅菌方式處理過的食品往往會破壞其本來具有的色香味，破壞了食品的營養(yǎng)成分。新型的噬菌體滅菌也局限性較大。而蛭弧菌作為一類具有裂解致病菌的特殊細(xì)菌，不僅可應(yīng)用到畜禽從養(yǎng)殖到食用前的全過程，而且不會導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)抗性，也無噬菌體療法中宿主過于專一的缺點。在用蛭弧菌處理后的食品通過較短時間的巴氏殺菌既能達(dá)到商業(yè)無菌狀態(tài)，在保證食品安全的同時也有效降低了耗能。因此蛭弧菌作為一類致病菌的生物消除劑具有相當(dāng)大的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種消除單核細(xì)胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供所述蛭弧菌菌株的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn) 一種消除單核細(xì)胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株，名稱為蛭弧菌(5A//ov/6Wo sp.) BDSM08，于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M 209171。
對所述蛭弧菌BDSM08進(jìn)行負(fù)染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察(見圖1):BDSM08呈單細(xì)胞，弧形，大小為1.8xl.0pm，端生鞭毛，長度為3.2 ^m;所述蛭弧菌(^^//0^'^/0 sp.)BDSM08以雙層平板法于28。C培養(yǎng)三天可形成直徑2-3mm的透明圓形噬菌斑，其最適生長pH值為7.2，最適生長溫度28'C，最適鹽度0%;
所述蛭弧菌BDSM08由蛭弧菌BDSOl進(jìn)行紫外誘變而得；
所述蛭弧菌BDSOl自泥樣中分離得到，于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M209169;對其進(jìn)行負(fù)染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察蛭弧菌BDS01呈單細(xì)胞，弧形，大小為0.9><0.25拜，端生鞭毛，長度為4拜；將其以雙層平板法于28'C培養(yǎng)四天可形成直徑l-2mm的透明圓形噬菌斑；
所述紫外誘變依據(jù)申請?zhí)?2008100220488.3",名稱為"紫外誘導(dǎo)突變在增強(qiáng)蛭弧菌裂解性能中的應(yīng)用"的國家發(fā)明專利申請中的方法進(jìn)行；
蛭弧菌BDSM08的16S-ITS rDNA序列如下(如序列表SEQ ID No.l所示)ATTTTTTTAAGCTACAAAGGGCTTACGGTGGATGCCTTGGCAGTCA一種微生物制劑，含有所述的蛭弧菌BDSM08;
所述微生物制劑的制備方法，包含以下步驟:將蛭弧菌的濃度用DNB (dilutenutrient broth)培養(yǎng)基、生理鹽水或0.2 mol/LpH值為7.2 7.6的磷酸鹽緩沖液調(diào)整為至少102pfU/mL,得到所述的微生物制劑；
所述的微生物制劑應(yīng)用于消除單核細(xì)胞增生李斯特菌；所述微生物制劑應(yīng)用于消除食品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌；所述微生物制劑應(yīng)用于消除食品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌，是以噴灑、擦涂、浸漬或者加入的方法處理攜帶有單核細(xì)胞增生李斯特菌的食用前的食品；部分產(chǎn)品需配合簡單的巴氏殺菌，就能達(dá)到很好的消除效果；
所述微生物制劑應(yīng)用于消除食用前果蔬或水產(chǎn)品攜帶的單核細(xì)胞增生李斯特菌，所述微生物制劑中的蛭弧菌最佳濃度范圍為104 1012pfU/mL。
所述微生物制劑應(yīng)用于消除蛋類、肉類和鮮牛奶及奶制品所攜帶的單核細(xì)胞增生李斯特菌，所述微生物制劑中的蛭弧菌最佳濃度范圍均為102 10"pfU/mL。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果
1、 本發(fā)明蛭弧菌在消除食用前果蔬或水產(chǎn)品致病性弧菌的應(yīng)用效果顯著。
以巻心菜、羅非魚和對蝦(又稱明蝦、大蝦)為例，如圖2、圖3所示，對單增李斯特菌均有較高的消除率。
2、 在食用前用蛭弧菌消除果蔬及水產(chǎn)品中單增李斯特菌安全性好蛭弧菌消除果蔬及水產(chǎn)品中單增李斯特菌的方法是生物的方法，蛭弧菌可
侵染、裂解宿主細(xì)菌的特性使之適合作為抑止或清除生物體及其環(huán)境中致病菌的生物凈化因子，且其在裂解完宿主細(xì)菌后，會因饑餓而自動消亡，因此對人和動物無毒副作用。不僅可提高消費(fèi)者生食果蔬和水產(chǎn)品的安全系數(shù)，保護(hù)消費(fèi)者的健康，也為果蔬及水產(chǎn)品的綠色加工生產(chǎn)提供保障。
3、 本應(yīng)用方法特別適用于禽蛋及肉類加工過程中，為加工提供優(yōu)質(zhì)原材料和加工上的便利，確保禽蛋類加工產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)，有效地解決了食品安全問題。
4、 用于禽蛋及肉類保藏中致病菌的消除時，以新鮮的雞蛋、豬肉為例，檢測結(jié)果如圖4和圖5所示，對單增李斯特菌的清除率均可達(dá)99%以上?？捎行У匮娱L在常溫或者低溫下的保藏時間，防止或延緩禽蛋及肉腐敗變質(zhì)，同時避免使用化學(xué)防腐劑，方便、安全且效果好，直接提高了產(chǎn)品品質(zhì)。
5、 本發(fā)明用于鮮牛奶及奶制品的前期滅菌，奶制品以奶酪為例，檢測結(jié)果如圖6和圖7所示，不僅能夠有效的縮短巴氏殺菌的時間，同時可以殺滅奶酪成熟過程感染的致病菌。


圖1是蛭弧菌BDSM08于電鏡下觀察的形態(tài)圖。
圖2是微生物制劑消除食用前果蔬攜帶單增李斯特菌效果圖。
圖3是微生物制劑消除食用前水產(chǎn)品攜單增李斯特菌效果圖。
圖4是微生物制劑對蛋類攜帶的單增李斯特菌的消除效果圖。
圖5是微生物制劑對肉類攜帶的單增李斯特菌的消除效果圖。
圖6是微生物制劑對攜帶單增李斯特菌的鮮牛奶巴氏殺菌效果圖。
圖7是微生物制劑對攜帶單增李斯特菌的奶制品的消除效果圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1
(1) 通過紫外誘變方法得到蛭弧菌BDSM08
出發(fā)菌株為蛭弧菌BDSOl，蛭弧菌BDS01自泥樣中分離得到，于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO: M 209169;對其進(jìn)行負(fù)染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察蛭弧菌BDS01呈單細(xì)胞，弧形，大小為0.9x0.25nm,端生鞭毛，長度為4pm;將其以雙層平板法于28'C培養(yǎng)四天可形成直徑l-2mm的透明圓形噬菌斑。
將蛭弧菌BDSOl依據(jù)申請?zhí)?2008100220488.3",名稱為"紫外誘導(dǎo)突變在增強(qiáng)蛭弧菌裂解性能中的應(yīng)用"的國家發(fā)明專利申請中的方法，在紫外燈功率15W，輔助紅外光源的功率為20W，照射距離為15cm，誘變時間4min的條件下，五次累加誘變后，篩選得到誘變株BDSM08。
對蛭弧菌BDSM08進(jìn)行負(fù)染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察(見圖1):BDSM08呈單細(xì)胞，弧形，大小為1.8x1.0,，端生鞭毛，長度為3.2^ 11;所述蛭弧菌(^^/ov沾n》sp.)BDSM08以雙層平板法于28。C培養(yǎng)三天可形成直徑2-3mm的透明圓形噬菌斑，其最適生長pH值為7.2，最適生長溫度28'C,最適鹽度0%。
將蛭弧菌BDSM08于2009年8月7日在位于中國武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO: M 209171。
BDSM08與BDS01裂解單增李斯特菌(購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心，編號GIM 1.298)的對比實驗中，由實驗結(jié)果檢驗發(fā)現(xiàn)，BDSM08可以裂解單增李斯特菌，出現(xiàn)噬菌斑的時間為48h，斑較亮，邊緣清晰，透明斑直徑平均值為2.5mm。 BDS01經(jīng)過觀察未出現(xiàn)噬菌斑，不能裂解單增李斯特菌，由此可以看出經(jīng)過誘變的BDSM08菌株與出發(fā)菌BDS01相比具有更強(qiáng)的裂解能力，從而為提高食品質(zhì)量提供有效的安全措施，為食物中毒、魚類病害防治和食品安全保障提供新的手段。
(2) 消除單核細(xì)胞增生李斯特菌的微生物制劑的制備蛭弧菌菌液通過申請?zhí)?200710031166.X"的國家發(fā)明專利申請公開的高
密度蛭弧菌游泳體的發(fā)酵方法進(jìn)行制備在裝有100mLLB (Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基的錐形瓶中接種嗜水氣單胞菌"erowo""s/9^ra;^7a，購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心，編號GIM 1.172) ， 250rpm、 3(TC搖床培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)液分別于4。C、5000rpm離心15min，棄上清。將沉淀加入到裝有l(wèi)OOmLDNB(dilutenutrientbroth)液體培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精 提物O.lg，溶于1000mL蒸餾水中，pH值為7.2 7.6)的錐形瓶中，再加入從 雙層平板上挑取的蛭弧菌BDSM08的噬菌斑，恒溫?fù)u床250rpm、30。C培養(yǎng)24h。 培養(yǎng)液分別于4。C、 6000rpm離心20min，取上清液，再將上清液分別于4。C、 16000rpm離心20min，保留沉淀，加入DNB液體培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯0.8g，酪 蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物O.lg，溶于lOOOmL蒸餾水中，pH值為7.2 7.6)重新懸浮蛭弧菌沉淀物，蛭弧菌BDSM08菌液的濃度為10"pfii/mL。
用水稀釋BDSM08菌液，得到不同的微生物制劑，其中
微生物制劑A含有的蛭弧菌數(shù)為1012pfu/mL;
微生物制劑B含有的蛭弧菌數(shù)為101QpfU/mL;
微生物制劑C含有的蛭弧菌數(shù)為108pfli/mL;
微生物制劑D含有的蛭弧菌數(shù)為106pfU/mL;
微生物制劑E含有的蛭弧菌數(shù)為104pfii/mL;
微生物制劑F含有的蛭弧菌數(shù)為102pfo/mL。 (3)將微生物制劑用于消除食用前果蔬攜帶的單增李斯特菌
① 、單增李斯特菌菌液的制備
單增李斯特菌(購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心，編號GIM 1.298) 用營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，160 rpm 、 28'C培養(yǎng)18h，接著，將培養(yǎng)液經(jīng)4'C、 6000rpm離心20min，棄上清液，沉淀菌體用無菌水重新懸浮，使其濃度為 109cfli/mL。
② 將微生物制劑用于消除食用前果蔬攜帶的單增李斯特菌 試驗所用材料為巻心菜。設(shè)置對照組和試驗組。各設(shè)三個平行樣，每個平
行樣均有巻心菜500克(即樣品)。將巻心菜浸漬于步驟(3)①制備的單增 李斯特菌菌液中，用無菌水調(diào)節(jié)終濃度，使其濃度達(dá)到1.0xl04cfU/mL， 30秒 后取出瀝干。再分別將巻心菜(每500g巻心菜為一個樣品)浸漬于濃度為A、 B、 C、 D和E的微生物制劑中，每種試劑均有三個平行樣。樣品在不同蛭弧 菌液浸漬后，30秒后取出瀝干，在室溫下放置，分別于2小時和4小時檢測 單增李斯特菌的含量。
單增李斯特菌的具體檢測方法是稱取巻心菜50g，置于已滅過菌的研缽 中，加無菌水10ml，勻漿之后，把液體平均分裝到兩支50ml的離心管中，研 缽再加40ml無菌水沖洗，在把沖洗液平均分裝到兩支50ml的、已盛有勻漿液 的離心管中，2000 rpm離心20min除去雜質(zhì)，然后把兩支離心管的上清液轉(zhuǎn)移到一無菌燒杯中，并按10倍稀釋法進(jìn)行系列稀釋，最后采用MPN (most probable number)方法對細(xì)菌進(jìn)行計數(shù)(單位為cfli/kg)。其中單增李斯特菌 的檢測采用ALOA單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基，通過觀察是否出現(xiàn)帶有不透明暈 環(huán)的藍(lán)綠色菌落來檢測單增李斯特菌。
檢測結(jié)果如圖2所示，所有數(shù)據(jù)均為三個平行樣的平均值。由圖中可以得 到，蛭弧菌濃度越高，微生物制劑消除李斯特菌的能力越強(qiáng)，消除率越高；作 用時間越久，消除效果越好。因此，在消除果蔬攜帶的單增李斯特菌中， BDSM08蛭弧菌液的最佳使用濃度在104 1012pfU/mL。
實施例2
(1)將微生物制劑用于消除食用前水產(chǎn)品攜帶的單增李斯特菌 試驗容器為25L的水族箱，分為試驗組和對照組，每組設(shè)3個平行。試驗 用水為濾膜過濾的養(yǎng)殖淡水，每個水族箱注入16L過濾水。水族箱在實驗前經(jīng) 二氯異腈尿酸鈉消毒，水溫為26"C。在每個水族箱中加入實施例1步驟(3) ①制備單增李斯特菌液，用無菌水調(diào)節(jié)使其終濃度為1.0xl04cfu/mL。然后每 個水族箱放羅非魚和對蝦各10只。試驗所用羅非魚約重140 190g，對蝦約 重15 30g，體長約為8-10cm。對照組為只加實施例1步驟(3)①制備的單 增李斯特菌，用無菌水調(diào)節(jié)終濃度，使其濃度達(dá)到1.0xl04Cfo/mL，且不加蛭 弧菌液，試驗組加入蛭弧菌BDSM08菌液形成的微生物制劑A、 B、 C、 D和 E。樣品在不同蛭弧菌液浸漬后，30秒后取出瀝干，在室溫下放置，分別于2 小時和4小時檢測單增李斯特菌的含量。
單增李斯特菌的具體檢測方法是用經(jīng)無菌生理鹽水濕潤的滅菌拭子(棉花 簽)在水產(chǎn)品表面上均勻的涂抹4次后，置含無菌生理鹽水的無菌離心管中振 蕩、混勻，然后采用MPN方法對細(xì)菌進(jìn)行計數(shù)(單位為dWkg)。其中單增 李斯特菌的檢測采用ALOA單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基，通過觀察是否出現(xiàn)帶有 不透明暈環(huán)的藍(lán)綠色菌落來檢測單增李斯特菌。
檢測結(jié)果如圖3所示，所有數(shù)據(jù)均為三個平行樣的平均值。圖3表明，蛭 弧菌BDSM08對單增李斯特菌的消除率可達(dá)到99%以上。由圖中可以看到時間 越長消除率越高，蛭弧菌液濃度越高，消除效果越好。因此，在消除水產(chǎn)品攜 帶的單增李斯特菌中，BDSM08蛭弧菌液的最佳使用濃度在104 1012pfo/mL。
實施例3將微生物制劑用于消除蛋類攜帶的單增李斯特菌，具體過程如下-試驗所用材料為雞蛋，試驗均設(shè)對照和試驗組。各設(shè)三個平行樣，每個平
行樣有雞蛋10個，每個雞蛋約重50g。分別把雞蛋浸漬于實施例1步驟(3) ①制備的濃度為10^fU/mL的單增李斯特菌菌液中，用無菌水調(diào)節(jié)終濃度，使 其濃度達(dá)到1.0xl04cfU/mL， 30秒后取出瀝干。然后將每10個雞蛋分成一個小 組，浸漬于實施例1制備的微生物制劑A、 B、 C、 D、 E和F中。雞蛋浸漬30 秒后取出瀝干，室溫下放置，分別在放置時間為2小時和4小時這兩個時刻， 檢測單增李斯特菌的含量。單增李斯特菌的具體檢測方法是取經(jīng)無菌生理鹽水 濕潤的滅菌拭子(棉花簽)在蛋表面上均勻的涂抹4次后，置含無菌生理鹽水 的無菌離心管中振蕩、混勻，然后采用MPN方法對細(xì)菌進(jìn)行計數(shù)(單位為 cfii/kg)。檢測所用特異性培養(yǎng)基同實施例1。
檢測結(jié)果如圖4所示，所有數(shù)據(jù)均為三個平行樣的平均值。圖4表明，由 BDSM08蛭弧菌液形成的微生物制劑對單增李斯特菌的消除率均可達(dá)到99% 以上。因此，在消除蛋類攜帶的單增李斯特菌中，BDSM08蛭弧菌液的最佳使 用濃度在102 1012pfo/mL。
實施例4
將微生物制劑應(yīng)用于消除肉類攜帶的單增李斯特菌，具體過程如下 分割出每塊重量相近的實驗樣品豬塊，每塊重約0.25kg。試驗設(shè)對照組和 試驗組，每組設(shè)三個平行樣。將它們浸漬于實施例1步驟(3)①的濃度為 109Cfii7mL的單增李斯特菌菌液中，用無菌水調(diào)節(jié)終濃度，使其濃度達(dá)到 1.0xl04cfii/mL， 30秒后取出瀝干。將試驗組浸漬于濃度為A、 B、 C、 D、 E 和F的微生物制劑中，每種試劑均有三個平行樣。樣品在不同蛭弧菌液浸漬后， 30秒后取出瀝干，在室溫下放置，分別于2小時和4小時檢測單增李斯特菌 的含量。單增李斯特菌的具體檢測方法是取經(jīng)無菌生理鹽水濕潤的滅菌拭子 (棉花簽)在豬肉表面上均勻的涂抹4次后，置含無菌生理鹽水的無菌離心管 中振蕩、混勻，采用MPN檢測法(單位為cfli/kg)。檢測所用特異性培養(yǎng)基 同實施例1。
檢測結(jié)果如圖5所示，所有數(shù)據(jù)均為三個平行樣的平均值。從圖5可以看 出，蛭弧菌濃度越高，微生物制劑消除李斯特菌的能力越強(qiáng)，消除率越高。作 用時間越久，消除效果越好。比較單增李斯特菌的初始濃度與終濃度，可知單 增李斯特菌的殘留率均不到1%。因此，在消除肉類攜帶的單增李斯特菌中，BDSM08蛭弧菌液的最佳使用濃度在102 1012pfU/mL。
關(guān)于對肉品質(zhì)的評價，除了上述從肉的衛(wèi)生安全方面做出檢測外，還包括 從持水力、pH、嫩度、肉色以及硬度及濕度幾個方面來考査。
持水力按照目前通用的48小時滴水法，將肉制品懸掛在0 4-C懸掛貯存 48小時后計算失重率，使用微生物f劑的試驗組的豬肉在懸掛48h持水率均 較高，失重率平均為2.2%，而對照i的失重率則為11%。由此明顯看出對照 組豬肉品質(zhì)的下降。
從肉色來評價，使用微生物制劑的豬肉呈現(xiàn)鮮紅色，稍有光澤，而未使用 蛭弧菌的豬肉肉色灰白，光澤暗淡，且不斷有水外滲。主觀評價可以看出感染 致病菌的豬肉(對照組)肉色明顯的劣于試驗組。
從pH值測定來看，感染致病菌的豬肉(對照組)的pH值都接近5，這是 肌肉的持水力下降的標(biāo)志，此時的pH值對豬肉的風(fēng)味產(chǎn)生較大影響，而使用 蛭弧菌的試驗組pH值維持在6.5左右，這說明肉的品質(zhì)保持的比對照組的要 好。
嫩度主要是通過嫩度儀來評估的，評估的結(jié)果兩者之間沒有很明顯的區(qū) 別，實驗組嫩度略微的優(yōu)于對照組。
主觀評價硬度主要是通過切面是否容易變形來確定的，而評價濕度主要是 通過切面液體滲出的多少來確定的，4h時對照組的豬肉切面很容易變形，而 且還有水滲出，可以鑒定等級為滲出。試驗組的豬肉切面不容易變形，也沒有 水滲出，可以鑒定等級為潮濕。
從以上肉品質(zhì)的綜合鑒定來看，試驗組的豬肉品質(zhì)明顯的優(yōu)于對照組。這 說明蛭弧菌在消除禽蛋肉類攜帶的常見致病菌方面效果顯著，可以推廣應(yīng)用于 禽蛋肉類的保藏和加工工業(yè)。
實施例5
將微生物制劑應(yīng)用于消除鮮牛奶及奶制品中攜帶的單增李斯特菌，具體過 程如下-
本實驗在新鮮的IOL鮮牛奶中加入實施例1步驟(3)①的濃度為109cfU/mL 的單增李斯特菌液O.lmL，使菌液終濃度為1.0xl04cfU/mL。然后將帶有李斯特 菌的牛奶分為12份，其中3份為對照系列，另9份為實驗系列。實驗系列中 每3份為1組加入蛭弧菌BDSM08菌液形成的微生物制劑D、 E和F。將對照系列和試驗系列的牛奶靜置2小時，同時采用65'C巴氏殺菌對鮮牛奶進(jìn)行滅 菌。每10分鐘用無菌移液管吸取10mL牛奶樣品采用MPN方法對細(xì)菌進(jìn)行計 數(shù)(單位為cfU/mL)。所有數(shù)據(jù)均為三個平行樣的平均值。檢測所用特異性培 養(yǎng)基同實施例l。
巴氏殺菌效果見圖6所示。圖中以無菌為細(xì)菌O殘留量，固為對照系列牛 奶隨巴氏殺菌時間延長的滅菌率，口為實驗系列中添加微生物制F組的牛奶隨巴 氏殺菌時間延長的滅菌率。所有數(shù)據(jù)均為三個平行樣的平均值。實驗結(jié)果表明， 對照系列100。/。無菌的巴氏殺菌時間為30min;而實驗系列中最低蛭弧菌終濃度 組(102 pfo/mL，由于其它試驗小組的效果更好，故在此不再贅述)在20min 時已達(dá)無菌，大大縮短了巴氏殺菌的時間，減少了產(chǎn)品的耗能也更好的保證了 產(chǎn)品的風(fēng)味。
對于奶制品以奶酪為例。本實驗將成熟干燥后的奶酪浸入實施例1步驟(3) ①濃度為10^fii/mL的單增李斯特菌液，用無菌水調(diào)節(jié)終濃度至1.0xlO、fii/mL。 試驗設(shè)對照組和試驗組，每組設(shè)三個平行樣，每個平行樣均有一塊成型后等質(zhì) 量的奶酪，30秒后取出瀝干。試驗組中，在浸泡完單增李斯特菌菌液后的奶 酪分別直接浸入實施例1制備的微生物制劑A和F中，30秒后取出瀝干，室 溫下放置，每10分鐘用無菌刀切取5克左右奶酪置于含無菌生理鹽水的無菌 離心管中振蕩、混勻，然后采用MPN方法對細(xì)菌進(jìn)行計數(shù)(單位為cfU/kg)。 檢測所用特異性培養(yǎng)基同實施例1。
檢測結(jié)果如圖7所示，所有數(shù)據(jù)均為三個平行樣的平均值。從圖7可以看 出，蛭弧菌BDSM08對單增李斯特菌的消除率可達(dá)到100%。實驗結(jié)果以添加 不同濃度蛭弧菌液的不同時間得到的結(jié)果作圖，由圖中可以看到時間越長消除 率越高，在作用時間30分鐘時達(dá)到消除率100%，蛭弧菌液濃度越高，消除效 果越好。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實 施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCE LISTING
〈iio>華南理工大學(xué)
〈120> —種消除單核細(xì)胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用 〈130〉 7 〈160〉 1
〈170〉 Patentln version 3.2 <210> 1 〈211〉 1838 〈212〉 DNA
〈213〉 蛭弧菌(Bdellovibrio sp.) 〈220〉
〈221〉 misc—feature 〈222〉 (778亍..(778) 〈223〉 w二a或t <400> 1
caggcctaac acatgcaagt cgaacggggt agcaata cct agtggcgcac gggtgagtaa 60 cgcgtggata atctgcctta gagtggggga taacteigtcg aaagattagc taataccgca 120 taagaccaca agagctgcgg ctcaaggggt caaaggtttt tcgctctaag atgagtccgc 180 gt犯gattag ctagttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gacgatcttt aactggtctg 240 agaggatgat cagtcacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300 tagggaatat tgcacaatgg aggaaactct gatgcagcga cgccgcgtga gtgeitgaagg 360 ccttcgggtc gtaaagctct gtcgcagggg aataacacaa tgaatgtacc ctgtaagaaa 420 ggatcggcta acttcgtgcc agcagccgcg gtaagacgag ggatcctagc gttgttcgga 480 atcattgggc gtaaagcggg tgtaggtggc tttgtaagtc aggtgtgaaa gcctagggct 540 caaiccctaga agtgcatttg atactgcg犯gcttgagtgc tagagaggtt actag幼ttg 600 "ttggtgtagt ggtgaaatac gtagatatca acaggaatac cggtggcgaa ggcgggtaac 660 tggctsgac3 ctgac3ctca gscccg犯ag cgtggggatc犯acaggatt sgatsccctg 720 gtagtccacg ccgtaaacga tggatacttg ttgttggagg tattgacccc ttcagtgwcg 780 aagctaacgc gttaagtatc ccgcctgggg agtacggtcg caagattaaa actcaaagaa 840
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tctttgacaa ttgaatagat tgatttagtt gatttttagc gaggttagtt ccattttttt 1800
aagctacaaa gggcttacgg tggatgcctt ggcagtca 1838
權(quán)利要求
1、一種消除單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的蛭弧菌菌株，其特征在于所述蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDSM08，于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM 209171。
2、 一種消除單核細(xì)胞增生李斯特菌的微生物制劑，其特征在于所 述微生物制劑含有權(quán)利要求1所述的蛭弧菌BDSM08。
3、 權(quán)利要求2所述的微生物制劑的制備方法，其特征在于包含以 下步驟將蛭弧菌用DNB培養(yǎng)基、生理鹽水或0.2mol/LpH值為7.2 7.6 的磷酸鹽緩沖液調(diào)整菌液濃度至少為102pfb/mL，得到所述的微生物制劑；
4、 權(quán)利要求2所述的微生物制劑的應(yīng)用，其特征在于所述的微生 物制劑用于消除單核細(xì)胞增生李斯特菌。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述所述微生物制劑的應(yīng)用，其特征在于所述 微生物制劑應(yīng)用于消除食品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述微生物制劑的應(yīng)用，其特征在于所述微生 物制劑以噴灑、擦涂、浸漬或者加入方式作用于食品。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述微生物制劑的應(yīng)用，其特征在于所述微生物制劑應(yīng)用于消除果蔬或水產(chǎn)品表面攜帶的單核細(xì)胞增生李斯特菌，所述微生物制劑中蛭弧菌的濃度為104 1012pfii/mL。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述微生物制劑的應(yīng)用，其特征在于所述微生 物制劑應(yīng)用于消除蛋類、肉類、鮮奶或奶制品攜帶的單核細(xì)胞增生李斯特 菌，所述微生物制劑中蛭弧菌的濃度為102 1012pfii/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種消除單核細(xì)胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明通過分離純化、紫外誘變得到蛭弧菌BDSM08。BDSM08于電子顯微鏡下形態(tài)觀察呈單細(xì)胞，弧形，大小為1.8×1.0μm，端生鞭毛，長度為3.2μm。所述蛭弧菌BDSM08以雙層平板法于28℃培養(yǎng)三天可形成直徑2-3mm的透明圓形噬菌斑，其最適生長pH值為7.2，最適生長溫度28℃，最適鹽度0％。應(yīng)用BDSM08制備的微生物制劑對環(huán)境中常見的單增李斯特菌具有很強(qiáng)的殺滅作用。本發(fā)明首次將蛭弧菌BDSM08用于防治食品李斯特菌病，對食品上的單增李斯特菌消除效果良好，且具有無毒、對食品無副作用等特點，應(yīng)用前景良好。
文檔編號C12N1/20GK101649299SQ20091004227
公開日2010年2月17日 申請日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者彭宗輝, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學(xué)