一種單核細胞增生性李斯特菌免疫pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型涉及一種單核細胞增生性李斯特菌的免疫PCR基因檢測試劑盒，它包括盒體(1)、襯墊(2)，所述襯墊(2)上設(shè)有數(shù)個容器孔，所述容器孔內(nèi)設(shè)有10×PCR?Buffer(3)、dNTP(4)、TaqDNA聚合酶(5)、ddH2O雙蒸水(6)、正向引物(7)、反向引物(8)、陽性對照溶液(9)、陰性對照溶液(10)和自封袋(11)，所述自封袋(11)內(nèi)設(shè)有包被了抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體的免疫PCR管。本實用新型的檢測試劑盒結(jié)合了免疫和分子技術(shù)原理，能快速、準確、靈敏地從食品中直接檢測到病原菌。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實用新型屬于生物技術(shù)和免疫學領(lǐng)域，具體涉及一種檢測單核細胞增生性李斯 特菌的免疫PCR檢測試劑盒。 -種單核細胞增生性李斯特菌免疫PCR檢測試劑盒

【背景技術(shù)】
[0002] 單核細胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes)是一種短小的革蘭氏陽性無 芽胞兼性厭氧桿菌，是李斯特菌屬中致病力最強的細菌，也是唯一對人致病的、典型的胞內(nèi) 寄生菌，可以導(dǎo)致嚴重的人畜共患傳染病，如腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)和單核細胞增多等癥狀。 1988年，世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization，WHO)發(fā)表"食源性李斯特菌病勸告 書"，指導(dǎo)全世界各國如何預(yù)防李斯特菌污染和中毒。自此，LM成為新的重要的食源性疾病 病原菌，WHO將其與E.coli0157、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌并列為20世紀90年代四 大食源性致病菌。該菌主要污染牛奶及乳制品、乳酪制品、肉制品香腸、加工禽類、生肉、魚、 蝦、煙熏魚、生蔬菜。目前單核細胞增生李斯特菌的檢測主要依賴于國標所規(guī)定的生化鑒 定，其缺點是操作繁瑣、檢測周期較長，無法適應(yīng)大量的樣品篩查。
[0003] 免疫學檢測是近年來出現(xiàn)的最快速、準確、穩(wěn)定的快速檢測手段，但是檢測產(chǎn)品全 部依賴進口，我國目前尚無擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)，且可運用于檢測實踐的快速檢測產(chǎn)品， 該專利以單核細胞增生李斯特菌為檢測靶標，所要求保護的技術(shù)涉及單核細胞增生性李斯 特菌快速檢測產(chǎn)品。 實用新型內(nèi)容
[0004] 本實用新型的目的在于提供一種快速，準確地可快捷檢測單核細胞增生性李斯特 菌的檢測試劑盒。本實用新型將致病菌免疫富集方法和基因水平檢測方法有效結(jié)合，先用 特異性抗體將樣品中的病原菌特異性免疫富集，然后PCR擴增，這不僅很大程度提高了檢 測靈敏度，而且也提高了檢測的特異性，大大提高了病原菌檢測的效率。
[0005] 具體而言，本實用新型提供了一種單核細胞增生性李斯特菌免疫PCR檢測試劑 盒，它包括盒體（1)，所述盒體（1)內(nèi)設(shè)有襯墊（2)，所述襯墊上設(shè)有數(shù)個容器孔，所述容器 孔內(nèi)分別設(shè)有1〇\?〇?8肛€61'(3)、(1階1 3(4)、了&9〇嫩聚合酶（5)、(1(1!120雙蒸水（6)、正向引 物（7)、反向引物（8)、陽性對照溶液（9)、陰性對照溶液（10)和自封袋（11)，所述自封袋 (11)內(nèi)設(shè)有包被了抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體的免疫PCR管。
[0006] 在一優(yōu)選例中，所述的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體由小鼠雜交瘤細胞 系 6D4H7C8B6,CGMCCNo. 8002 或 1B4E7A6C9,CGMCCNo. 8765 產(chǎn)生。
[0007] 本實用新型的有益效果如下：
[0008] 本實用新型的單核細胞增生性李斯特菌免疫PCR檢測試劑盒集病原菌濃縮、特異 性抗體識別以及PCR擴增為一體，具有檢測結(jié)果準確性高、特異性強、靈敏度高以及檢測快 速、使用方便等優(yōu)點，彌補了現(xiàn)有食源性致病菌檢測技術(shù)費時耗力、靈敏度低的不足。
[0009] 本實用新型的單核細胞增生性李斯特菌免疫PCR檢測試劑盒適用于菌株快速鑒 定、食品中毒源檢測等諸多領(lǐng)域，尤其適用于樣品中微量病原體的快速檢測。可供質(zhì)監(jiān)部 門、進出口檢疫部門等用于檢測食樣中的單核細胞增生性李斯特菌。
[0010] 本實用新型各個方面的細節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過下文以及權(quán)利 要求的描述，本實用新型的特點、目的和優(yōu)勢將更為明顯。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1是本實用新型的檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0012] 圖2是本實用新型的檢測試劑盒的使用流程和原理圖。
[0013]附圖標記釋義：1.盒體；2.襯墊；3. 10XPCRBuffer;4.dNTP;5.TaqDNA聚合酶； 6.ddH20雙蒸水；7.正向引物；8.反向引物；9.陽性對照溶液；10.陰性對照溶液；11.自封 袋。

【具體實施方式】
[0014] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本實用新型。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本 實用新型而不用于限制本實用新型的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通 常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇抑改希∟ewYork:ColdSpringHarbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0015] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本實用新型中。文 中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0016] 實施例1.本實用新型的檢測試劑盒的制備
[0017](一）本實用新型的用于檢測單核細胞增生性李斯特菌的免疫PCR管的具體包被 方法如下：
[0018] 1.用包被緩沖液稀釋抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體6D4H7C8B6,CGMCC No. 8002或1B4E7A6C9,CGMCCNo. 8765至1:300倍，抗體濃度為10μg/mL，將稀釋好的單克 隆抗體每管50uL加入免疫PCR管中，4°C過夜包被；
[0019] 2.包被緩沖液（CarbonateCoatingbuffer(lX))的配方為：無水碳酸鈉 Na2C03l. 59g，碳酸氫鈉NaHC032. 93g，疊氮化鈉NaN30. 2g，溶于1000ml蒸餾水中，調(diào)pH至 9. 6,4°C保存。
[0020] (二）制備本實用新型的單核細胞增生性李斯特菌免疫PCR檢測試劑盒（如圖1)， 它包括：
[0021] 盒體（1)、襯墊（2)，襯墊（2)上設(shè)有數(shù)個容器孔，容器孔內(nèi)分別設(shè)有EP管裝載的 10XPCRBuffer(3) -管、dNTP(4) -管、TaqDNA聚合酶（5) -管、ddH20 雙蒸水（6) -管、正 向引物（7) -管、反向引物（8) -管，試劑瓶裝載的陽性對照溶液（9) 一瓶、陰性對照溶液 (10) -瓶和鋁箔自封袋（11) 一只，鋁箔自封袋（11)內(nèi)設(shè)有包被了抗單核細胞增生性李斯 特菌單克隆抗體的免疫PCR管。鋁箔自封袋（11)設(shè)于襯墊（2)上，襯墊（2)設(shè)于盒體（1) 內(nèi)。
[0022] 其中，10XPCRBuffer裝量為 300uL;dNTP的濃度為 2. 5mmol/L，裝量為 150uL; TaqDNA聚合酶濃度為5U/L，裝量為60uL;引物的濃度為10um〇l/L，裝量為150uL。
[0023] 陽性對照為滅活的單核細胞增生性李斯特菌菌液，陰性對照為滅菌的李氏增菌肉 湯。
[0024] 本實用新型的檢測試劑盒的使用流程和原理圖參見圖2。
[0025] 在本實用新型提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被 單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本實用新型的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以對本實用新型作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求 書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種單核細胞增生性李斯特菌免疫PCR檢測試劑盒，包括盒體（1)，所述盒體（1) 內(nèi)設(shè)有襯墊（2)，所述襯墊（2)上設(shè)有數(shù)個容器孔，其特征在于，所述容器孔內(nèi)分別設(shè)有 10父？0?81^€61'(3)、(1階1 3(4)、了&9〇嫩聚合酶（5)、(1(1!120雙蒸水（6)、正向引物（7)、反向引 物（8)、陽性對照溶液（9)、陰性對照溶液（10)和自封袋（11)，所述自封袋（11)內(nèi)設(shè)有包被 了抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體的免疫PCR管。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的抗單核細胞增生性李斯特菌 單克隆抗體由小鼠雜交瘤細胞系6D4H7C8B6，CGMCCNo.8002或1B4E7A6C9，CGMCCNo.8765 產(chǎn)生。
【文檔編號】C12R1/01GK203866319SQ201420272712
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】劉箐, 宋春美, 吳嫚 申請人:上海理工大學