專利名稱：導入有黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶基因的轉(zhuǎn)化體、和使用該轉(zhuǎn)化體的黃素 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及導入有黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶(在本說明書中也 稱為“FAD-GDH”)基因的轉(zhuǎn)化體、和使用該轉(zhuǎn)化體的FAD-GDH的制備方法。
背景技術：
近年來，使用電化學的生物傳感器的簡易型自身血糖測定器得到廣泛使用。生物 傳感器為在絕緣性的基板上形成電極、酶反應層的傳感器。作為在此使用的酶，可以列舉葡 萄糖脫氫酶(GDH)、葡萄糖氧化酶(GO)等。使用GO的方法被指出存在以下問題容易受測 定樣品中的溶存氧的影響，溶存氧對測定結(jié)果有影響。另一方面，作為不受溶存氧的影響且在不存在NAD (P)條件下作用于葡萄糖的酶， 已知以吡咯喹啉醌(PQQ)為輔酶的GDH(PQQ-GDH)(例如參照專利文獻1 3)。但是，在 PQQ-GDH中，存在以下問題=(I)PQQ容易與酶解離，⑵對于葡萄糖的選擇性低，和(3)由于 一般存在于膜組分中，因此伴隨其提取、分離操作存在困難等。另外，近年來，有報告在醫(yī)院使用簡易血糖自身測定器的患者中發(fā)生低血糖等病 癥的例子。之后的調(diào)查、分析結(jié)果確定這樣的病例的原因為，PQQ-GDH與作為輸液成分而含 有的麥芽糖反應，顯示出比實際的血糖值要高的值(醫(yī)藥品 醫(yī)療用具等安全性情報206號 (Pharmaceuticals andMedical Devices Safety Information No. 206)，平成 16 年(2004 年)10月，厚生勞動省醫(yī)藥食品局)?；谶@樣的情況，迫切期望開發(fā)特異性地與葡萄糖作 用，特別是對麥芽糖的作用性低的血糖測定用酶。此外，除PQQ-GDH之外，作為不受溶存氧的影響且在不存在NAD (P)條件下作用于 葡萄糖的酶，還已知以黃素腺嘌呤二核苷酸為輔酶的葡萄糖脫氫酶(即，F(xiàn)AD-GDH)。至此， 由米曲霄(Aspergillus oryzae)(非專利文獻 1 4)禾口土曲霄(Aspergillus terreus) (專利文獻4)分別獲得FAD-GDH。但是，很難說這些FAD-GDH的生產(chǎn)量在供給于工業(yè)利用 上有足夠的生產(chǎn)量。專利文獻1 日本特開2000-350588號公報專利文獻2 日本特開2001-197888號公報專利文獻3 日本特開2001-346587號公報專利文獻4 國際公開第2004/058958號小冊子非專利文獻 1 :Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae.I.Induction of its synthesis by p-benzoquinone and hydroquinone, T. C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys.Acta,139,265-276(1967).非專利文獻 2 :Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II. Purification and physical and chemical properties, T.C.Bak, Biochim. Biophys.Acta,139，277-293(1967) ·
非專利文獻 3 :Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae.III. General enzymatic properties, T.C.Bak, Biochim. Biophys. Acta,146, 317-327(1967).非專利文獻 4 :Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histidyl residue as an active site, T. C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta,146，328-335(1967).

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人的研究小組以取得能夠更準確地測定葡萄糖量的新型FAD-GDH和其生 產(chǎn)菌為目的，關注于以黃素腺嘌呤二核苷酸為輔酶的FAD-GDH。并且，以微生物為對象進行 廣泛地篩選，結(jié)果取得FAD-GDH生產(chǎn)性優(yōu)異的米曲霉(Aspergillus oryzae) 0另外，成功 純化該菌株生產(chǎn)的FAD-GDH，也成功確定其各性狀。通過確定的各性狀，可知該FAD-GDH為 新型的酶。另外，可知該FAD-GDH對葡萄糖的選擇性優(yōu)異，而且不容易受在反應體系中存在 的溶存氧的影響，能夠更準確地測定樣品中葡萄糖量。進一步進行研究，結(jié)果成功確定上述 菌株保有的FAD-GDH的氨基酸序列和編碼其的基因序列。這些研究成果已經(jīng)提出國際申請 (國際申請編號 PCT/JP2007/060694)。本發(fā)明的課題在于，在以上的背景下，以高效率大量生產(chǎn)能夠更準確地測定葡萄 糖量的新型FAD-GDH。本發(fā)明人為了解決上述課題進行了深入研究。即，分析編碼源自米曲霉BB-56的 FAD-GDH的基因，查明堿基序列的特定部分對FAD-GDH酶的最適pH、pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、 底物特異性和微生物的FAD-GDH生產(chǎn)能力，換言之，對酶的功能方面和生產(chǎn)性的影響。基于 該觀點制備微生物的轉(zhuǎn)化體，結(jié)果成功取得FAD-GDH的生產(chǎn)性極高的轉(zhuǎn)化體，從而完成本 發(fā)明。本發(fā)明如下所述。[1] 一種轉(zhuǎn)化體，導入有編碼黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的DNA，所 述DNA選自以下的(a) (f)(a)編碼以序列編號20表示的氨基酸序列的DNA ；(b)由以序列編號19表示的堿基序列構(gòu)成的DNA ；(c)具有與以序列編號19表示的堿基序列同源的堿基序列，且編碼具有黃素腺嘌 呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ；(d)編碼以序列編號34表示的氨基酸序列的DNA ；(e)由以序列編號33表示的堿基序列構(gòu)成的DNA ；(f)具有與以序列編號33表示的堿基序列同源的堿基序列，且編碼具有黃素腺嘌 呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。[2]根據(jù)[1]所述的轉(zhuǎn)化體，是將屬于曲霉屬或酵母菌屬的宿主微生物進行轉(zhuǎn)化 而成的。[3]根據(jù)[1]所述的轉(zhuǎn)化體，是將米曲霉進行轉(zhuǎn)化而成的。[4]根據(jù)[1]所述的轉(zhuǎn)化體，是將釀酒酵母進行轉(zhuǎn)化而成的。[5] 一種黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的制備方法，包含以下步驟 (1)禾Π (2)而成
(1)將[1] [4]中任一項所述的轉(zhuǎn)化體在產(chǎn)生上述DNA編碼的蛋白質(zhì)的條件下 進行培養(yǎng)的步驟；(2)將產(chǎn)生的上述蛋白質(zhì)回收的步驟。[6] 一種葡萄糖測定方法，其特征在于，使用以[5]所述的制備方法制備的黃素腺 嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，測定樣品中的葡萄糖。[7] 一種葡萄糖測定用試劑，其特征在于，包含以[5]所述的制備方法制備的黃素 腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶。[8] 一種葡萄糖測定用試劑盒，包含[7]所述的葡萄糖測定用試劑。


圖 1 :pFG2 的構(gòu)成。圖2 :pFGP2的構(gòu)建流程。圖3 培養(yǎng)濾液中的FAD-GDH活性的比較。圖4 屬于米曲霉的各菌株的FAD-GDH生產(chǎn)能力的比較。ND為檢測限以下(未檢 測出)。圖5 編碼源自米曲霉BB-56和RIB40的FAD-GDH的DNA序列的序列比對圖。圖6 源自米曲霉BB-56和RIB40的FAD-GDH的氨基酸序列的序列比對圖。圖7 編碼源自屬于米曲霉的9菌株的FAD-GDH的DNA序列的序列比對圖。圖8 源自屬于米曲霉的9菌株的FAD-GDH的氨基酸序列的序列比對圖。 圖9 =FAD-GDH的最適pH比較。(A)源自米曲霉BB-56的FAD-GDH，⑶源自米曲 霉RIB40的重組FAD-⑶H。圖10 =FAD-GDH的pH穩(wěn)定性的比較。(A)源自米曲霉BB-56的FAD-GDH，⑶源自 米曲霉RIB40的重組FAD-GDH。圖11 =FAD-GDH的溫度穩(wěn)定性的比較。㈧源自米曲霉BB-56的FAD-GDH，(B)源 自米曲霉RIB40的重組FAD-GDH。圖12 =FAD-GDH的底物特異性的比較。表中的數(shù)值表示相對活性(％ )。圖13 轉(zhuǎn)化體(酵母)的FAD-GDH生產(chǎn)能力的比較。在用源自RIB40的FAD-GDH 的cDNA進行轉(zhuǎn)化的酵母的菌體外和菌體內(nèi)都未檢測出FAD-GDH活性。圖14 在用編碼源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的cDNA進行轉(zhuǎn)化的酵母的培養(yǎng)上 清液中所含的FAD-GDH在SP瓊脂糖中的溶出結(jié)果。圖15 在用編碼源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的cDNA進行轉(zhuǎn)化的酵母的培養(yǎng)上 清液中所含的FAD-GDH在SP瓊脂糖中的溶出結(jié)果。圖16 :SP瓊脂糖區(qū)分和源自野生型米曲霉RIB40的FAD-GDH在除去糖鏈后的電 泳圖的比較。泳道1 米曲霉BB-56純化FAD-GDH(無處理)，泳道2 米曲霉BB-56純化 FAD-GDH(內(nèi)切糖苷酶H處理)，泳道3 源自米曲霉BB-56的FAD-GDH(用轉(zhuǎn)化了的酵母表 達，無處理)，泳道4 源自米曲霉BB-56的FAD-GDH(用轉(zhuǎn)化了的酵母表達并進行內(nèi)切糖苷 酶H處理)，泳道5 源自米曲霉RIB40的FAD-GDH(用轉(zhuǎn)化了的酵母表達，無處理)，泳道6 源自米曲霉RIB40的FAD-GDH(用轉(zhuǎn)化了的酵母表達并進行內(nèi)切糖苷酶H處理)。
具體實施例方式(用語)本發(fā)明中的“編碼蛋白質(zhì)的DNA”是指，使其表達時能得到該蛋白質(zhì)的DNA，即，具 有對應于該蛋白質(zhì)的氨基酸序列的堿基序列的DNA。因此，也考慮到密碼子的簡并。本說明書中的用語“分離”可以與“純化”交換使用。涉及本發(fā)明的酶(FAD-GDH) 而使用時的“分離”是指，在本發(fā)明的酶是源自天然材料時，在該天然材料中實質(zhì)上不含有 該酶以外的成分(特別是實質(zhì)上不含有夾雜蛋白質(zhì))的狀態(tài)。具體的是，例如在本發(fā)明分離 的酶中，夾雜蛋白質(zhì)的含量以重量換算計，不到全部的約20%，優(yōu)選不到約10%，更優(yōu)選不 到約5%，進一步優(yōu)選不到約1%。另一方面，本發(fā)明的酶為利用基因工程方法進行制備時 的用語“分離”是指，實質(zhì)上不含有源自所使用的宿主細胞的其它成分或培養(yǎng)液等的狀態(tài)。 具體的是，例如在本發(fā)明分離的酶中，夾雜成分的含量以重量換算計，不到全部的約20%， 優(yōu)選不到約10%，更優(yōu)選不到約5%，進一步優(yōu)選不到約1%。此外，只要沒有明確表明與其 不同的意思，在本說明書中簡單記載為“黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶”的情況 意味著“分離狀態(tài)的黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶”。對于代替黃素腺嘌呤二核 苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶而使用的用語“FAD-GDH”和“酶”，也是同樣的。對于DNA，在使用時的“分離”是指，在最初天然存在的DNA的情況下，典型的是， 由在天然狀態(tài)中共存的其它核酸分離的狀態(tài)。其中，也可以含有在天然狀態(tài)中相鄰的核酸 序列(例如啟動子區(qū)域的序列、終止子序列等)等一部分其它的核酸成分。例如，在基因組 DNA的情況下的“分離”狀態(tài)中，優(yōu)選實質(zhì)上不含有在天然狀態(tài)中共存的其它的DNA成分。 另一方面，在cDNA分子等利用基因工程的方法制備的DNA的情況下的“分離”狀態(tài)中，優(yōu)選實質(zhì)上不含有細胞成分或培養(yǎng)液等。同樣地，在通過化學合成 制備的DNA的情況下的“分離”狀態(tài)中，優(yōu)選實質(zhì)上不含有dNTP等前體(原材料)或在合 成過程中使用的化學物質(zhì)等。此外，只要沒有明確表明與其不同的意思，在本說明書中僅記 載為“DNA”的情況意味著分離狀態(tài)的DNA。(導入有編碼FAD-GDH的DNA的轉(zhuǎn)化體)本發(fā)明的第一局面在于，提供導入有編碼新型FAD-GDH的DNA的轉(zhuǎn)化體。在本發(fā) 明的轉(zhuǎn)化體中，以如下DNA作為外源性分子而存在(a)編碼以序列編號20表示的氨基酸 序列的DNA、(b)由以序列編號19表示的堿基序列構(gòu)成的DNA、(c)具有與以序列編號19表 示的堿基序列同源的堿基序列，且編碼具有黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶活性 的蛋白質(zhì)的DNA、(d)編碼以序列編號34表示的氨基酸序列的DNA、(e)由以序列編號33表 示的堿基序列構(gòu)成的DNA、(f)具有與以序列編號33表示的堿基序列同源的堿基序列，且編 碼具有黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。以序列編號20表示的氨基酸序列是本發(fā)明人成功鑒定的、米曲霉BB-56具有的 FAD-GDH的氨基酸序列。編碼以序列編號20表示的氨基酸序列的DNA的具體例為，由以序 列編號19表示的堿基序列構(gòu)成的DNA。其中，一般的，對編碼某種蛋白質(zhì)的DNA的一部分 實施改變時，改變后的DNA編碼的蛋白質(zhì)存在具有與改變前的DNA編碼的蛋白質(zhì)相同的功 能的情況。即，存在DNA序列的改變對編碼的蛋白質(zhì)的功能實質(zhì)上沒有影響，編碼的蛋白質(zhì) 功能在改變前后得以維持的情況。因此，在本發(fā)明的一個實施方式中，導入了具有與以序列 編號19表示的堿基序列同源的堿基序列，且編碼具有FAD-GDH活性的蛋白質(zhì)的DNA ((c))。其中，“同源的堿基序列”是指，與以序列編號19表示的核酸在一部分上不同，但通過該不同 其編碼的蛋白質(zhì)的功能(在此是FAD-GDH活性)實質(zhì)上不受影響的堿基序列。同源DNA的具體例為，對與以序列編號19表示的堿基序列互補的堿基序列，在嚴 格條件下進行雜交的DNA。其中，“嚴格條件”是指，所謂的形成特異性雜交、不形成非特 異性雜交的條件。這樣的嚴格條件是本領域技術人員公知的，例如，可以參照Molecular Cloning(Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或 Current protocols inmolecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al. , 1987)進行 設定。作為嚴格條件，例如可以列舉使用雜交液(50%甲酰胺、10XSSC(0. 15MNaCl，15mM檸 檬酸鈉，pH7. 0)、5 XDenhardt溶液、1 % SDS、10%硫酸葡聚糖、10 μ g/ml的變性鮭精子DNA、 50mM磷酸緩沖液(pH7. 5))，在約42°C 約50°C下進行溫育，之后使用0. 1XSSC、0. 1% SDS 在約65°C 約70°C下洗滌的條件。作為更優(yōu)選的嚴格條件，例如可以列舉作為雜交液，使 用 50% 甲酰胺、5XSSC(0. 15M NaCl, 15mM 檸檬酸鈉，ρΗ7· 0)、1 XDenhardt 溶液、SDS、 10%硫酸葡聚糖、10 μ g/ml的變性鮭精子DNA、50mM磷酸緩沖液(pH7. 5)的條件。作為同源DNA的其它具體例，可以列舉將以序列編號19表示的堿基序列作為 基準，由含有一個或多個堿基的取代、缺失、插入、附加或倒位的堿基序列構(gòu)成，編碼具有 FAD-GDH活性的蛋白質(zhì)的DNA。堿基的取代、缺失等可以在多個部位發(fā)生。其中，“多個”是 指，根據(jù)在該DNA編碼的蛋白質(zhì)的立體構(gòu)造上的氨基酸殘基的位置、種類不同而異，例如為 2 40堿基，優(yōu)選為2 20堿基，更優(yōu)選為2 10堿基。以上這樣的同源DNA例如可以 通過以下得到利用限制酶處理、通過核酸外切酶、DNA連接酶等的處理、指定位置突變導 人法(Molecular Cloning,Third Edition,Chapter 13,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)、隨機突變導入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York)所致的變異導入等，改變具有以序列編號19 表示的堿基序列的DNA，以使其包含堿基的取代、缺失、插入、附加和/或倒位。另外，通過紫 外線照射等其它方法也能得到同源DNA。作為同源DNA其它的例子，可以列舉由以SNP (單核苷酸多態(tài)性)為代表的多態(tài)性 引起的、認為與如上所述堿基不同的DNA。導入本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的DNA通過以本說明書或附加的序列表所示的序列信息為 參考，使用標準的基因工程方法、分子生物學方法、生物化學方法等可以以分離的狀態(tài)制 備。具體而言，可以由適當?shù)慕z狀菌類、酵母菌類的基因組DNA文庫或cDNA文庫，或絲狀 菌類、酵母菌類的菌體內(nèi)提取液，適當利用可以對本發(fā)明的基因特異性雜交的寡核苷酸探 針·引物進行制備。寡核苷酸探針·引物可以使用市售的自動化DNA合成裝置等容易地合 成。此外，為制備本發(fā)明的基因，對于所使用的文庫的制作方法，例如可以參照Molecular Cloning，Third Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York0例如，如果是具有以序列編號19表示的堿基序列的基因，則可以利用以該堿基序 列或其互補序列的全部或一部分為探針的雜交法進行分離。另外，可以利用使用以與該堿 基序列的一部分特異性雜交的方式設計的合成寡核苷酸引物的核酸擴增反應(例如PCR) 進行擴增和分離。并且，本發(fā)明人成功鑒定的FAD-GDH(具有序列編號20的氨基酸序列的酶。以下， 稱為“本酶”)具有以下的性狀(詳細參考之前提交的國際申請PCT/JP2007/060694)。首先，本酶催化以下的反應，即，在電子受體存在下將葡萄糖的羥基氧化生成葡萄糖酸_ S _內(nèi)酯 的反應。另外，通過SDS-聚丙烯酰胺電泳測得的本酶的分子量為約IOOkDa,通過凝膠過濾 測得的本酶的分子量為約400kDa(四聚物)。另一方面，本酶的底物特異性優(yōu)異，選擇性地對D-葡萄糖起作用。詳細來說，本發(fā) 明的FAD-GDH對麥芽糖的反應性非常低，對D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖等的反應性也非 常低。具體而言，將對D-葡萄糖的反應性定為100%時，對于這些底物的反應性都在5%以 下。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，對于麥芽糖的反應性為以下或?qū)嵸|(zhì)上未發(fā)現(xiàn)。在更 優(yōu)選的實施方式中，對于D-果糖的反應性和對于D-半乳糖的反應性的任一個都為1 %以下 或?qū)嵸|(zhì)上未發(fā)現(xiàn)。具有以上這樣優(yōu)異的底物特異性的本酶優(yōu)選作為用于準確測定樣品中的 葡萄糖量的酶。即，根據(jù)本酶，即使在樣品中存在麥芽糖、半乳糖等的夾雜物時，也能更準確 地測定目的的葡萄糖量。因此，本酶可以說適用于預料或擔心在樣品中存在這樣的夾雜物 的用途(典型的是測定血液中的葡萄糖量)，而且，還可適用于包括該用途的各種用途，即 也可以說適用性高。如上所述，本酶由米曲霉BB-56株取得。此外，該菌株保藏于下述的規(guī)定的保藏機 構(gòu)，可以容易地得到。保藏機構(gòu)獨立行政法人制品評價技術基盤機構(gòu)專利微生物保藏中心(亍 292-0818日本國千葉県木更津市力、fS鎌足2-5-8)保藏日2006年5月17日保藏編號NITEBP-236明確由米曲霉BB-56株取得的本酶還具有以下的性狀(詳細參考之前提交的國際 申請 PCT/JP2007/060694)。(4)最適 pH: 7 附近(5)最適溫度60°C附近(6)pH穩(wěn)定性在pH3. 0 7. 0的范圍穩(wěn)定(7)溫度穩(wěn)定性在40°C以下穩(wěn)定(8) Km值對于D-葡萄糖的Km值為約8mM(9)等電點(pi) :6· 4 附近如上所述，判斷本酶對于葡萄糖具有選擇性并具有高親和性，而且穩(wěn)定性優(yōu)異，適 用于對葡萄糖傳感器等的應用、實用化。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體典型的是通過使用導入的DNA或含有該DNA的DNA構(gòu)建物(含有 載體的形態(tài))的轉(zhuǎn)化(transformation)進行制備。在通過載體進行轉(zhuǎn)化時，優(yōu)選使用表達 型載體?！氨磉_型載體”是指，能夠?qū)⒉迦肫涞暮怂釋肽康募毎?宿主細胞)內(nèi)，且在該細 胞內(nèi)可以使其表達的載體。表達型載體通常包含表達插入的核酸所必需的啟動子序列。另 外，優(yōu)選含有促進表達的增強子序列。還可以使用含有選擇標記的表達型載體。在使用所 述表達型載體時，可以利用選擇標記確認表達型載體是否導入(及其程度)。本發(fā)明的基因?qū)d體的插入、選擇標記基因的插入(需要的情況下)、啟動子的插 入(需要的情況下)等可以參照標準的DNA重組技術(例如，可以參照Molecular Cloning, Third Edition, 1. 84, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York，使用限制酶禾口DNA 連接酶的公知的方法)來進行。
轉(zhuǎn)化可以通過磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法(Potter, H. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 81,7161-7165(1984))、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Feigner,P. L. et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 84，7413-7417(1984))、顯微注射法(Graessmann, Μ. & Graessmann，Α.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 73，366-370 (1976) )、Hanahan 方法(Hanahan，D.，J. Mol. Biol. 166， 557-580(1983))、醋酸鋰法(Schiestl，R. H. et al. , Curr. Genet. 16，339-346 (1989))、原生 質(zhì)體-聚乙二醇法(Yelton,M. Μ. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. 81，1470-1474(1984))等進 行實施。作為宿主細胞，可以示例大腸菌等的細菌細胞、絲狀菌細胞(例如米曲 霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger))、酵母細胞(例如釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe))。優(yōu)選的是，將屬于曲霉屬的微生物或?qū)儆诮湍妇鷮俚奈⑸镉米魉拗?。作為?于曲霉屬的微生物，可以示例米曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、土曲霉 (Aspergillus terreus)(Aspergillus awamori), iM^^ii^Wi'e^iiBIS 白質(zhì)所必需的結(jié)構(gòu)，作為基因供給種最優(yōu)選米曲霉。另一方面，作為屬于酵母菌屬的微生 物，可以示例釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、粟酒裂殖酵母，但最優(yōu)選釀酒酵母。 (FAD-GDH的制備方法)本發(fā)明的第二方面是提供使用上述轉(zhuǎn)化體來制備FAD-GDH的方法。在本發(fā)明的制 備方法中，首先在產(chǎn)生由導入到其中的基因編碼的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體(步驟 (1))。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件只要能生產(chǎn)目的的酶即可，沒有特別限定。即，以生產(chǎn)本酶作為 條件，可以適當設定適合于使用的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)的方法、培養(yǎng)條件。以下，作為培養(yǎng)條件，示 例培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。作為培養(yǎng)基，為所使用的轉(zhuǎn)化體能夠生長的培養(yǎng)基即可，任何種培養(yǎng)基都可以。例 如，可以使用添加了葡萄糖、蔗糖、龍膽二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有機酸等的碳 源，還有硫酸銨、碳酸銨、磷酸銨、醋酸銨、或者蛋白胨、酵母抽提物、玉米漿、酪蛋白水解物、 麩皮、肉膏等的氮源，還有鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鐵鹽、鋅鹽等的無機鹽的培養(yǎng)基。 為了促進所使用的轉(zhuǎn)化體的生長，還可以在培養(yǎng)基中添加維生素、氨基酸等。培養(yǎng)基的PH 調(diào)整為例如約3 8，優(yōu)選為約5 7左右，培養(yǎng)溫度通常為約10 50°C，優(yōu)選約為25 35°C左右，在1 15日，優(yōu)選為3 7日左右在需氧條件下進行培養(yǎng)。作為培養(yǎng)方法，例如 可以利用震蕩培養(yǎng)法、利用發(fā)酵罐的需氧深部培養(yǎng)法。接著培養(yǎng)步驟，回收產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(即，F(xiàn)AD-GDH)(步驟(2))。在由培養(yǎng)液回收 FAD-GDH時，例如通過過濾培養(yǎng)上清液、離心處理等除去不溶物后，適當組合利用超濾膜的 濃縮、硫酸銨沉淀等的鹽析、透析、各種色譜等進行分離、純化，由此可以得到目的FAD-GDH。 另一方面，在由菌體內(nèi)回收時，例如通過加壓處理、超聲波處理等破碎菌體后，與上述相同 地進行分離、純化，由此可以得到目的FAD-GDH。此外，還可以通過過濾、離心處理等預先由 培養(yǎng)液回收菌體后，進行上述一系列的工序(菌體的破碎、分離、純化)。此外，在各純化工序中，原則上以FAD-GDH活性為指標進行區(qū)分，進入后續(xù)的步 驟。但是，在通過預試驗等，已經(jīng)可以設定適當?shù)臈l件的情況下，不限于此。FAD-GDH的純化度沒有特別限定，但例如可以純化至比活度為50 160 (U/mg)，優(yōu)選比活度為100 160(U/mg)的狀態(tài)。另外，最終的形態(tài)可以是液體狀也可以是固體狀(包 含粉體狀)。(FAD-⑶H 的用途)本發(fā)明的其它方面涉及用上述的制備方法制備的FAD-GDH的用途。在該方面中， 首先提供使用FAD-GDH的葡萄糖測定法。在本發(fā)明的葡萄糖測定法中，利用通過FAD-GDH 的氧化還原反應測定樣品中的葡萄糖量。本發(fā)明例如用于血糖值的測定、食品(調(diào)味品或 飲料等)中的葡萄糖濃度的測定等。另外，在發(fā)酵食品(例如食用醋)或發(fā)酵飲料(例如 啤酒或酒)的制造工序中，為了調(diào)查發(fā)酵度也可以利用本發(fā)明。在FAD-GDH中，作為輔酶的 FAD通常結(jié)合至⑶H，由此在測定時不需要添加輔酶，可以構(gòu)建簡便的測定體系。本發(fā)明另外提供包含用上述制備方法制備的FAD-GDH的葡萄糖測定用試劑。該試 劑用于上述本發(fā)明的葡萄糖測定法。本發(fā)明還提供用于實施本發(fā)明的葡萄糖測定法的試劑盒(葡萄糖測定用試劑 盒)。本發(fā)明的試劑盒除包含用上述制備方法制備的FAD-GDH的葡萄糖測定用試劑之外，還 包含反應用試劑、緩沖液、葡萄糖標準液等任意的要素。另外，本發(fā)明的葡萄糖測定試劑盒 通常附帶使用說明書。以下，通過實施例對本發(fā)明進行更具體地說明，但本發(fā)明不受這些實施例的限 定。在本實施例中，只要沒有特別記載，作為限制酶和其它基因操作用酶使用TAKARA BIO 公司或東洋紡織株式會社的制品。此外，酶的反應條件等依照附帶的使用說明書。另 外，堿基序列的確定使用 ABIPRISM 310 Genetic Analyzer、BigDye Terminator v3. 1 CycleSequencing Kit (Applied Biosystems 公司)，PCR 反應使用 GeneAmp PCRSystem 9600 (PerkinElmer Japan公司)進行。另外，對于這些裝置和用于本實施例的裝置、基因操 作用制品，只要沒有特別記載，依照各個制品附帶的使用說明書的推薦條件實施操作。實施例1〈米曲霉BB-56的培養(yǎng)>按照以下順序，培養(yǎng)米曲霉BB-56，生產(chǎn)FAD-GDH。將包含以下組成的預培養(yǎng)的培 養(yǎng)基50mL分裝在300mL容積的三角燒瓶中，在121°C、0. 12MPa下滅菌20分鐘。將該培養(yǎng) 基冷卻到室溫后，接種米曲霉BB-56，在30°C、200rpm條件下培養(yǎng)3天。(預培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成)酵母抽提物(Becton，DickinsonCompany) 0. 2% (w/v)大豆蛋白胨(DMV公司)1. 0% (w/v)葡萄糖(和光純藥工業(yè)株式會社)2. 0 % (w/v)KH2PO4 (和光純藥工業(yè)株式會社)0. 1 % (w/v)MgSO4 · 7H20(Sigma-Aldrich 日本公司)0. 05% (w/v)培養(yǎng)基pH5. 7FAD-GDH的生產(chǎn)在包含以下組成的主培養(yǎng)的培養(yǎng)基中進行。將該主培養(yǎng)基50mL 分裝在300mL容積的三角燒瓶中，在121°C、0. 12MPa條件下滅菌20分鐘。將該培養(yǎng)基冷 卻到室溫后，接種上述預培養(yǎng)的培養(yǎng)液lmL，在30°C、200rpm條件下進行4天主培養(yǎng)，生產(chǎn) FAD-GDH。(主培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成)
葡萄糖15. 0% (w/v)Meast P1G(ASAHI FOOD & HEALTHCARE 公司)3· 0% (w/v)大豆蛋白胨6.0% (w/v)KH2PO4O. 3% (w/v)K2HPO4 (和光純藥工業(yè)株式會社)0. 2 % (w/v)4mM氫醌(和光純藥工業(yè)株式會社)培養(yǎng)基pH6. 0實施例2〈源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的純化>在以下條件下進行FAD-GDH的純化。將如上所述得到的培養(yǎng)液通過硅藻土過濾 除去培養(yǎng)液中的菌體和其他固形成分。將通過該操作得到的澄清液用超濾膜進行脫鹽、濃 縮。用90%飽和硫酸銨對該濃縮液進行鹽析處理，利用超濾膜將離心上清液進行脫鹽、濃 縮。將該脫鹽、濃縮液用于以IOmM Mcllvaine緩沖液pH5. 5平行化了的CM Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences 公司)，使 FAD-⑶H 吸附在柱上。用 IOmMMcllvaine 緩沖液 pH5. 5將柱洗凈后，用含有0. IM NaCl的IOmM Mcllvaine緩沖液pH5. 5使FAD-⑶H溶出， 回收FAD-GDH活性部分。用超濾膜將回收的活性部分濃縮，將該濃縮液用于以含有2. 5M硫 酸銨的IOmMK2HPO4-NaOH緩沖液pH6. 5平衡化了的辛基-瓊脂糖凝膠，使FAD-GDH吸附在柱 上。用含有2. 5M硫酸銨的IOmM K2HPO4-NaOH緩沖液pH6. 5將柱洗凈后，將同一緩沖液中的 硫酸銨的濃度階段性地變?yōu)?. 0、1. 5、1. 0、0. 5M，由此使FAD-GDH溶出。回收FAD-GDH的活 性部分，用超濾膜進行脫鹽、濃縮。將該脫鹽、濃縮液用于以20mM K2HPO4-NaOH緩沖液pH6. 5 平衡化了的 DEAE Sepharose CL-6B，用 20mM K2HPO4-NaOH 緩沖液 pH6. 5 將 FAD-⑶H 溶出。 該部分通過超濾膜進行脫鹽、濃縮，由此得到FAD-GDH的純化酶制品。實施例3〈源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的部分氨基酸序列的鑒定>如下所述鑒定源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的部分氨基酸序列。(1) FAD-GDH的等電點區(qū)分將在實施例2得到的純化FAD-GDH溶液3mL加入透析管中，浸漬在純化水中，在 4°C過夜，進行透析。將該透析樣品供給于甘油密度梯度電泳。柱容量IlOmL,使用兩性載體 (Pharmalyte 3-10 for IEF(AmershamBiosciences 公司))，在 5°C、400V 的低電壓下通電 48小時。通電后，將樣品回收，測定各部分的pH和FAD-GDH活性，收集活性部分。(2)部分氨基酸序列分析用樣品的制備將在上述⑴得到的純化FAD-GDH供給于使用凝膠PAG Mini“DAIICHI ”7. 5 (第一 化學藥品株式會社)的SDS-PAGE。將轉(zhuǎn)印緩沖液1 (0. 3M三羥甲基氨基甲烷(pH10. 4) ,20% 甲醇)、轉(zhuǎn)印緩沖液2(30mM三羥甲基氨基甲烷(pH10. 4)、20%甲醇)、轉(zhuǎn)印緩沖液3(40mM 6_氨基己酸(pH7. 6)、20%甲醇)用作轉(zhuǎn)印緩沖液，將泳動后的凝膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用考 馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)R-250將轉(zhuǎn)印后的轉(zhuǎn)印膜染色，檢測相當于FAD-GDH 的條帶，切出。將切出的膜用作N末端氨基酸序列分析用樣品。同樣地，用考馬斯亮藍R-250 將SDS-PAGE后的凝膠染色，檢測相當于FAD-GDH的條帶，切出。將該切出的凝膠用作內(nèi)部 氨基酸序列的分析用樣品。由分析結(jié)果明確N末端氨基酸序列和內(nèi)部氨基酸序列。
實施例4〈同源性檢索〉利用N末端氨基酸序列的同源性檢索如下進行。從日本專利特開2005-176602的 申請人:得到日本專利特開2005-176602所公開的米曲霉RIB40的基因信息中的全⑶S序 列，使用數(shù)據(jù)庫軟件Kiroku Ver. 3 (WORLD FUSION公司)實施利用在實施例3明確的N末端 氨基酸序列的同源性檢索。結(jié)果，認定與葡萄糖氧化酶前體(Glucose OxidasePrecursor) 具有相同性的氨基酸序列(日本特開2005-176602的序列表中的序列編號20494)之間具 有高同源性。在該序列(日本特開2005-176602的序列表中的序列編號20494)中也存在 與在實施例3鑒定的FAD-GDH的內(nèi)部氨基酸序列分析相一致的區(qū)域。通過這些事實表明， 日本特開2005-176602的序列表中的序列編號20494 (序列編號1)對應于FAD-GDH的氨基 酸序列。實施例5〈源自米曲霉BB-56的染色體DNA的提取>使用裝有YPD培養(yǎng)基(1%酵母抽提物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、pH6. 5) 100ml的 坂口瓶在30°C下將米曲霉BB-56培養(yǎng)過夜后，將培養(yǎng)液過濾，得到菌體。將該菌體冷凍 干燥，使用研缽將該干燥菌體約0. 3g與藥匙1杯的海砂一起進行粉碎，在提取緩沖液 (Extraction buffer (1 % 溴化十六烷基三甲基銨、0· 7M NaCl、50mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)、 IOmM EDTAU % β -巰基乙醇)12ml中懸濁。在室溫旋轉(zhuǎn)攪拌30分鐘后，添加等量的苯 酚氯仿異戊醇(25 24 1，ν/ν)溶液，攪拌后進行離心分離(1500g、5分鐘、室溫) 得到上清液。在該上清液中添加等量的氯仿異戊醇(24 1，ν/ν)溶液，攪拌后進行離 心分離(1500g、5分鐘、室溫)得到上清液。在該上清液中穩(wěn)定地添加等量的異戊醇，進 行離心分離(20000g、10分鐘、4°C )。用70%乙醇將得到的沉淀(析出的染色體DNA)洗 凈，真空干燥得到染色體DNA。將該染色體DAN溶解在TE (組成)4ml中，添加10mg/ml RNaseA (Sigma-Aldrich日本公司)200 μ 1，在37°C下溫育30分鐘。接著，添加20mg/ml蛋白 酶K、重組體、PCR Grade (Roche-Diagnostics公司)溶液40 μ 1，在37°C下溫育30分鐘后， 添加等量的苯酚氯仿異戊醇(25 24 l,v/v)溶液。攪拌后，進行離心分離(l，500g、 5分鐘、室溫)得到上清液。進行2次該洗凈操作后，在上清液中添加等量的氯仿異戊醇 (24 1，ν/ν)溶液并攪拌，進行離心分離(1500g、5分鐘、室溫)。在得到的上清液中添加 1/10容量的3M NaOAc (pH4. 8)和2倍容量的乙醇，在_80°C下析出染色體DNA。將析出的染 色體DNA通過離心處理(20000g、20分鐘、4°C )作為沉淀回收。用70%乙醇將回收的染色 體DNA洗凈后，真空干燥。將干燥的染色體DNA溶解于TE溶液400 μ 1，得到約lmg/ml的染 色體DNA溶液。實施例6〈合成引物的設計〉合成相當于編碼日本特開2005-176602的序列表中的以序列編號20494表示的氨 基酸序列(序列編號1)的全鏈長3226bp的源自米曲霉RIB40的基因序列(序列編號2) 的5’、3’兩個末端的序列的合成引物re-F、re-R(序列編號3、4)。實施例7<利用PCR法的FAD-GDH基因的擴增>
以在實施例5制備的源自米曲霉BB-56的染色體DNA為模板實施PCR反應。反應 使用TAKARA LA Taq，反應液組成依照在附帶的使用說明書記載的規(guī)定方法。進行添加以 使引物(re-F、FG-R)分別為0. 4 μ M，模板基因組為IOng/ μ 1的濃度。實施PCR反應。反 應循環(huán)如下。在94°C下反應2分鐘后，重復35次(i)-(iii)的反應(i)在94°C下30秒， ( )在60°C下30秒，(iii)在72°C下3. 5分鐘，最后在72°C下進行10分鐘反應。反應完 畢后將反應液在4°C下保存。實施例8〈源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因的堿基序列分析>將實施例7的PCR反應液供給于瓊脂糖電泳，將擴增片段(3241bp)與引物分離， 使用GENECLEAN III試劑盒(Q-BIOgene公司)由瓊脂糖凝膠提取。將提取的擴增片段亞克 隆在載體PUC19 (TAKARA BIO公司)的SmaI位點上得到(圖1)。分析中的PCR 擴增片段，即，源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的基因的堿基序列。為了分析上述基因的堿基 序列，制備合成引物TO-I (序列編號5)、FG-2 (序列編號6)、FG-3 (序列編號7)、FG-4 (序 列編號8)、FG-5 (序列編號9)、FG-6 (序列編號10)、FG-7 (序列編號11)、FG-8 (序列編號 12) ,FG-9 (序列編號13) ,FG-10 (序列編號14) ,FG-11 (序列編號15) ,FG-12 (序列編號16)、 M13-M5 (序列編號17)和M13-RV2 (序列編號18)。分析堿基序列，結(jié)果明確全鏈長3241bp 的源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因的堿基序列(序列編號19)。由該基因序列預測的氨 基酸序列示于序列編號20。實施例9〈源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的高生產(chǎn)株的取得>源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的高生產(chǎn)株如下取得。(1)利用PCR法的乳清酸核苷酸脫羧酶(pyrG)基因的擴增由日本特開2005-176602得到米曲霉RIB40的pyrG基因的序列信息，制備相當于 該序列的5’、3’兩個末端的合成引物PYR-F、PYR-R(序列編號21、22)。以在實施例5制備 的源自米曲霉BB-56的染色體DNA為模板實施PCR反應。反應使用TAKARA LA Taq，反應 液組成依照在附帶的使用說明書記載的方法。制備反應液以使引物PYR-F和PYR-R分別為 0.4 μ M，模板的染色體DNA為IOng/μ 1，實施PCR反應。PCR反應條件為，在94°C下反應2 分鐘后，重復35次(i)-(iii)的反應⑴在94°C下30秒，(ii)在58°C下30秒，(iii)在 72°C下2分鐘，最后在72°C下進行10分鐘反應。反應完畢后將反應液在4°C下保存。(2)表達型載體的構(gòu)建將上述PCR反應液供給于瓊脂糖電泳，將擴增的pyrG基因片段(1884bp)與引物 分離，使用GENECLEAN III試劑盒(Q-BIOgene公司)由瓊脂糖凝膠提取。利用限制酶SalI 和HindIII將提取的pyrG基因片段的兩個末端消化。使用DNA連接試劑盒Ver. 2. 1將該限 制酶處理了的DNA片段與用SalKHindIII處理的pFG2連接，制作pFGP2 (圖2)。將pFGP2 導入大腸菌DH5感受態(tài)細胞，得到大腸菌的轉(zhuǎn)化體。(3)基因片段的制備培養(yǎng)上述大腸菌的轉(zhuǎn)化體，由菌體提取質(zhì)粒PFGP2。利用限制酶HpaI、HindIII將 提取的PFGP2消化后，供給于瓊脂糖電泳分離出約5kbp的DNA片段，使用GENECLEAN III 試劑盒(Q-BIOgene公司)由瓊脂糖凝膠提取。與預想相同，確認該5kbp的DNA片段為源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因與pyrG連接的DNA片段。(4)源自米曲霉(Aspergillus oryzae)BB-56的尿苷要求株的取得將米曲霉BB-56在YPD培養(yǎng)基(1 %酵母抽提物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂、 pH6. 5)上培養(yǎng)，使胞子寄生。將寄生的胞子在含有0. 01% Tween80的0. 9% NaCl水溶液 中懸濁，得到胞子懸濁液。對胞子懸濁液進行紫外線照射以誘發(fā)突變后，將胞子懸濁液撒在 含有 5-氟乳清酸(5-F0A)的最低限度培養(yǎng)基(0. 052% KCl、0· 152% KH2PO4^O. 6% NaN03、 0. 1 % 微量元素溶液(0. 004 % Na2B4O7 · 10Η20、0· 04 % CuSO4 · 5Η20、0· 08 % FePO4 · ηΗ20、 0. 103% MnSO4 · 5Η20、0· 08% Na2MoO4 · 2Η20,0. 8% ZnSO4 · 7Η20)、0· 2 % 尿苷、1 % 葡萄糖、 0. 052% MgSO4 · 7Η20、0· 1% 5_F0A、2%瓊脂、ρΗ6· 5)上，得到 5-F0A 耐性株。通過 Belser 等的方法(Methods in Enzymology Vol.51 P. 135)確認5-F0A耐性株有無乳清酸磷酸核 糖基轉(zhuǎn)移酶活性和乳清酸核苷酸脫羧酶活性，得到表現(xiàn)出乳清酸核苷酸脫羧酶活性缺失的 尿苷要求性的變異株。(5)對尿苷要求株的轉(zhuǎn)化將如上得到的源自米曲霉BB-56的尿苷要求株在含有尿苷的YPD培養(yǎng)基(1 %酵母 抽提物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%尿苷、pH6. 5)中在30°C下培養(yǎng)過夜后，使培養(yǎng)液通過玻 璃濾器得到菌體，將該菌體懸濁在原生質(zhì)體調(diào)制液(0. 8M NaCl、10mM磷酸鈉緩沖液pH6. 0、 3mg/ml Yatalase 、0· 3mg/ml Novozymes 234(Novo Nordisk Pharma 公司))中，在 30°C、 78rpm條件下處理1小時30分鐘，進行原生質(zhì)體化處理。用濾器將該原生質(zhì)體懸濁液過 濾，將濾液離心分離(780g、5分鐘、室溫)得到沉淀。將該沉淀懸濁在IOmL的0. 8M NaCl 中，將離心分離(780g、5分鐘、室溫)得到的沉淀懸濁在IOml的0. 8M NaCl中。通過顯微 鏡觀察測量該懸濁液的原生質(zhì)體數(shù)后，進行離心分離(780g、5分鐘、室溫)，將沉淀懸濁在 SolKO. 8M NaClUOmM CaCl2UOmM Tris-HCl pH8. 0)中，制備約 2 X 108/ml 的原生質(zhì)體溶 液。在該原生質(zhì)體溶液中添加1/5容量的聚乙二醇(PEG)溶液(25% PEG 6000、50mM CaCl2, IOmM Tris-HCl pH8. 0)，進行混合。將該混合液200 μ 1分裝，添加上述制備的FAD-GDH基因 和pyrG基因連接而成的5kbp的基因片段的溶液(19 μ g/μ 1) 13 μ 1，懸濁后在冰中靜置30 分鐘。在該懸濁液中添加PEG溶液(25% PEG 6000、50mM CaCl2UOmM Tris-HCl pH8. 0) ImL, 懸濁，在室溫下靜置15分鐘。進一步添加SolI 8. 5mL，懸濁并進行離心分離(780g、5分鐘、 室溫)，將由此得到的沉淀在Solll. 2mL中懸濁，得到原生質(zhì)體懸濁液。將該懸濁液0. 2mL 移至培養(yǎng)皿后，注入再生培養(yǎng)基(0. 052% KC1、0. 152% ΚΗ2Ρ04、0. 6% NaN03、0. 微量元素 溶液、21.86%山梨糖醇、1%葡萄糖、0.052%1%504*7!120、2%瓊脂、？!16.5)使其固化。在 30°C下培養(yǎng)5 7天后，將生成的轉(zhuǎn)化體在最低限度培養(yǎng)基(0. 052% KC1、0. 152% KH2PO4, 0. 6% NaN03、0. 1 %微量元素溶液、1 %葡萄糖、0. 052% MgSO4 ·7Η20、2%瓊脂、ρΗ6· 5)中單菌 分離，得到導入了包含源自米曲霉ΒΒ-56的FAD-GDH基因和pyrG的約5kbp的連接DNA片 段的米曲霉轉(zhuǎn)化體。實施例10〈FAD-GDH生產(chǎn)性的確認> 培養(yǎng)在實施例9得到的轉(zhuǎn)化體，確認FAD-GDH的生產(chǎn)性。(1)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)將包含以下組成的預培養(yǎng)的培養(yǎng)基分裝在三角燒瓶中，滅菌。在上述培養(yǎng)基上分別接種米曲霉BB-56、在實施例9得到的轉(zhuǎn)化體，在30°C、200rpm條件下進行3天預培養(yǎng)。(預培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成)酵母抽提物(Becton，Dickinson公司)0. 2% (w/v)大豆蛋白胨(DMV公司)1. 0% (w/v)葡萄糖(和光純藥工業(yè)株式會社)2. 0 % (w/v)KH2PO4 (和光純藥工業(yè)株式會社)0. 1 % (w/v)MgSO4 · 7H20(Sigma-Aldrich 日本公司)0. 05% (w/v)ρΗ5· 7將包含以下組成的主培養(yǎng)的培養(yǎng)基分裝在三角燒瓶中，滅菌。冷卻后，接種上述預 培養(yǎng)后的培養(yǎng)液lmL，在30°C、200rpm條件下進行4天主培養(yǎng)。培養(yǎng)完畢后，將培養(yǎng)液過濾， 測定各濾液的FAD-GDH活性。(主培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成)葡萄糖15. 0% (w/v)Meast P1G(ASAHI FOOD & HEALTHCARE 公司)3· 0% (w/v)大豆蛋白胨6.0% (w/v)KH2PO4O. 3% (w/v)K2HPO4 (和光純藥工業(yè)株式會社)0. 2 % (w/v)4mM氫醌(和光純藥工業(yè)株式會社)pH6. 0(2) FAD-GDH 活性的測定FAD-GDH在電子受體存在下催化將葡萄糖的羥基氧化而生成D-葡萄糖酸-δ -內(nèi) 酯的反應。FAD-GDH活性的測定在以下的反應體系中進行。(I)D-葡萄糖+PMS — D-葡萄糖酸-δ -內(nèi)酯+還原型PMS(2) 2 還原型 PMS+NTB — 2PMS+ 二甲臘(diformazan)此外，式中的PMS表示吩嗪硫酸甲酯(Phenazine methanesulfate)，NTB表示硝基 四氮唑藍(Nitrotetrazorium blue)。在反應(1)中，伴隨葡萄糖的氧化生成還原型PMS，進一步在反應(2)中，在570nm 波長處測定通過利用還原型PMS的NTB的還原而生成的二甲。酶的活性通過下述計算式算出。 此外，式中的Vt表示總液量，Vs表示樣品量，20. 1表示每0. 5 μ mole 二甲臘的吸 光度系數(shù)(cm2/0. 5 μ mole)，1. O表示光路長(cm)，Df表示稀釋倍數(shù)。將含有0. 22 % (w/v) Triton X-IOO 的 50mM PIPES-NaOH 緩沖液 ρΗ6· 52. 55mL、 IM D-葡萄糖溶液0. 09mL、3mM PMS溶液0. 2mL和6. 6mM NTB溶液0. ImL混合，在37°C下保 溫5分鐘后，添加上述培養(yǎng)濾液0. lmL，開始反應。與酶反應進行的同時，生成在570nm處 具有吸收的二甲臘。測定每1分鐘在570nm處吸光度的增加，測定FAD-GDH活性(圖3)。結(jié)果，F(xiàn)AD-GDH活性在源自米曲霉BB-56的培養(yǎng)濾液中為1. 97u/mL，在源自轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng) 濾液中為38.Su/mL。通過轉(zhuǎn)化，酶的生產(chǎn)性大幅提高約20倍。將該轉(zhuǎn)化體命名為米曲霉 (Aspergillus oryzae)56-T0該轉(zhuǎn)化體保藏于下述的規(guī)定保藏機構(gòu)，可以容易地得到。保藏機構(gòu)獨立行政法人制品評價技術基盤機構(gòu)專利微生物保藏中心(〒 292-0818日本國千葉県木更津市力、fS鎌足2-5-8)保藏日2007年10月22日保藏編號NITEBP-438實施例11<屬于米曲霉的各菌株的FAD-GDH生成能力的比較>比較包括米曲霉BB-56的9種米曲霉，S卩，米曲霉BB-56、米曲霉RIB40、米曲 霉IAM2603、米曲霉IAM2609、米曲霉IAM2628、米曲霉IAM2683、米曲霉IAM2736、米曲霉 IAM2706和米曲霉NBRC30113的FAD-GDH的生產(chǎn)能力。培養(yǎng)和FAD-GDH活性的測定依照實 施例1和實施例10的方法。其結(jié)果為，在源自米曲霉RIB40和米曲霉IAM2609的培養(yǎng)液中， 極微弱地具有FAD-GDH活性，但活性在檢測限以下(圖4)。實施例12〈源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因和源自其它米曲霉的FAD-GDH基因的比較>將在實施例8明確的源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的堿基序列和編碼日本特開 2005-176602的序列表中的以序列編號20494表示的氨基酸序列(序列編號1)的全鏈長 3226bp的源自米曲霉RIB40的基因序列(序列編號2)進行比較，由此可知在編碼不含內(nèi) 含子的氨基酸的區(qū)域中，在兩者之間存在18個堿基(6個氨基酸)的不同區(qū)域(圖5、6)。 依照實施例5的方法制備屬于米曲霉的8種菌株，即，米曲霉RIB40、米曲霉IAM2603、米曲 霉IAM2609、米曲霉IAM2628、米曲霉IAM2683、米曲霉IAM2736、米曲霉IAM2706和米曲霉 NBRC30113的各自的染色體DNA，以這些染色體DNA為模板，依照實施例7的方法實施PCR反 應。依照實施例8的方法將這些PCR反應液回收，使用合成引物re-i (序列編號5)確定源 自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因和源自米曲霉RIB40的FAD-GDH基因的18個堿基(6個氨 基酸)的不同區(qū)域的堿基序列。將這些基因序列與在實施例8中確定的源自米曲霉BB-56 的FAD-GDH基因序列(序列編號19)進行比較。結(jié)果，在表示為序列編號31的堿基序列部 分(對應的氨基酸序列表示為序列編號32)中，表明在實施例11中活性在檢測限以下的米 曲霉RIB40和米曲霉IAM2609只有18個堿基(6個氨基酸)不同(圖7、8)。由此啟示，明確了的上述18個堿基(6個氨基酸)對FAD-GDH的生產(chǎn)和酶的穩(wěn)定 性有某種影響。實施例13 <研究利用源自米曲霉RIB40的FAD-GDH基因的轉(zhuǎn)化體的FAD-GDH生產(chǎn)能力〉(1)源自米曲霉RIB40的FAD-GDH基因的擴增由日本特開2005-176602公開的基因信息得到源自米曲霉RIB40的FAD-GDH 基因的序列信息，制備相當于其5’、3’兩末端序列的合成引物re-E22(序列編號23)、 FG-R-Sal (序列編號24)。TO-E22具有限制酶EcoT22I的識別部位，F(xiàn)G-R-Sal具有限制酶 SalI的識別部位。以在實施例11制備的源自米曲霉RIB40的染色體DNA為模板實施PCR 反應。反應使用TKARA LA Taq0調(diào)制PCR反應，以使引物FG-E22 JG-R-Sal分別為0. 4 μ M，模板基因組為IOng/μ 1。反應為，在96°C下反應2分鐘后，重復35次(i)-(iii)的反應 ⑴在94°C下30秒，(ii)在53°C下30秒，(iii)在72°C下3分30秒，最后在72°C下進行 10分鐘反應。反應完畢后將反應液在4°C下保存。利用限制酶EcoT22I和SalI將PCR擴 增片段消化后，供給于瓊脂糖電泳，將PCR擴增片段和引物分離，使用GENECLEAN III試劑 盒(Q-BIOgene公司)由瓊脂糖凝膠提取PCR擴增片段，即源自米曲霉RIB40株的FAD-GDH 基因片段。(2)高表達啟動子片段的制備以包含在日本特開2003-319786中公開的高表達啟動子基因片段的pKF_PCSPb為 模板實施PCR反應。反應使用TKARA LA Taq0加入引物以使合成taaPf (序列編號25)、 taaECOT22R (序列編號26)分別為1 μ Μ,模板質(zhì)粒為0. 5ng/ μ 1的濃度，實施PCR反應。反應 循環(huán)為，在94°C下2分鐘后，重復30次包括以下的反應⑴在94°C下30秒，(ii)在60°C 下30秒，(iii)在72°C下2分鐘，最后在72°C下進行10分鐘反應。反應完畢后將樣品在 4°C下保存。利用限制酶EcoRI和EcoT22I將PCR擴增片段消化后，供給于瓊脂糖電泳，將 PCR擴增片段和引物分離，使用GENECLEAN III試劑盒(Q-BIOgene公司)由瓊脂糖凝膠提 取PCR擴增片段，即高表達啟動子基因片段。(3)質(zhì)粒pCS-FG的制備使用DNA連接試劑盒Ver. 2. 1將如上所述制備的源自米曲霉RIB40的FAD-GDH基 因、高表達啟動子基因片段、和EcoRI及SalI處理的質(zhì)粒pUC118(TAKARA BIO公司)連接， 將構(gòu)建質(zhì)粒PCS-FG的pCS-FG導入大腸菌DH5株感受態(tài)細胞，得到大腸菌的轉(zhuǎn)化體。培養(yǎng) 該轉(zhuǎn)化體，使用GenElute Plasmid Minipr印試劑盒(Sigma-Aldrich日本公司)得到質(zhì) 粒 pCS-FG。(4)質(zhì)粒pCFPT的制備以如上所述制備的pCS-R；作為模板實施PCR反應。反應使用KOD-plus。調(diào)制PCR 反應液，以使合成引物FGH-F (序列編號27)和FGH-R(序列編號28)分別為0. 4 μ Μ, pCS-FG 模板質(zhì)粒為0. 5ng/yl的濃度。反應循環(huán)為，在96°C下2分鐘后，重復30次(i)-(iii)的過 程(i)在94°C下30秒，(ii)在54°C下30秒，(iii)在68°C下3分30秒，最后在68°C下進行 10分鐘反應。反應完畢后將樣品在4°C下保存。用限制酶HindIII將PCR擴增片段消化后， 供給于瓊脂糖電泳，分離為PCR擴增片段和引物，使用GENECLEAN III試劑盒(Q-BIOgene 公司)由瓊脂糖凝膠提取該擴增片段。另一方面，用HindIII將載體pPTRI(TAKARA BIO公 司)消化后，用堿性磷酸酯酶(E. coli C75)進行5’脫磷酸化處理。使用DNA連接試劑盒 Ver. 2. 1將該5’磷酸化載體與上述PCR擴增片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒pCFPT。將該pCFPT導入 大腸菌DH5感受態(tài)細胞，得到大腸菌的轉(zhuǎn)化體。將該轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)，使用QI Afilter Plasmid Maxi試劑盒(QIAGEN公司)提取質(zhì)粒pCFPT。(5)向米曲霉RIB40株的轉(zhuǎn)化米曲霉RIB40的原生質(zhì)體溶液的制備依照實施例9的方法。另外，向原生質(zhì)體的 基因的導入除了導入的基因為1.8yg/y 1的pCFPT溶液10 μ 1以外，依照實施例9的方 法。導入基因后的原生質(zhì)體的再生如下進行。將基因?qū)牒蟮脑|(zhì)體懸濁液0.2mL移至 培養(yǎng)皿，注入再生培養(yǎng)基(0. 052% KC1、0. 152% KH2PO4^O. 6% NaNO3>0. 微量元素溶液、 21. 86%山梨糖醇、葡萄糖、0. 052% MgSO4 · 7Η20、0· 5 μ g/ml吡啶代噻唑硫胺素、2%瓊脂、pH6. 5)使其固化為板狀。在30°C下培養(yǎng)5 7天后，將生成的吡啶代噻唑硫胺素耐性 株在含有0. 5 μ g/ml吡啶代噻唑硫胺素的最低限度培養(yǎng)基(0. 052% KC1、0. 152% KH2PO4, 0. 6% NaNO3>0. 1 % 微量元素溶液、1 % 葡萄糖、0. 052 % MgSO4 · 7Η20、0· 5 μ g/ml 吡啶代噻 唑硫胺素、2%瓊脂、pH6. 5)中單菌分離，得到在染色體上具有多個源自米曲霉RIB40的 FAD-GDH基因的轉(zhuǎn)化體#75。實施例14〈源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的純化>依照實施例10的方法培養(yǎng)在實施例13制備的轉(zhuǎn)化體#75，得到培養(yǎng)液。通過使用 該培養(yǎng)液5. OL的硅藻土過濾來除去培養(yǎng)液中的菌體和其他固形成分。用超濾膜將通過該 操作得到的上清液5. 4L脫鹽、濃縮，同時交換緩沖液為IOmM Mcllvaine緩沖液pH5. 0，制備 pH4. 7、電導率1. 34mS/cm的溶液600mL。將該濃縮液用于以IOmM Mcllvaine緩沖液pH5. 0 平衡化了的SP Sepharose Fast Flow，使FAD-⑶H吸附在柱上。用IOmMMcllvaine緩沖液 pH5. 0將柱洗凈后，用含有0. IM NaCl的IOmM Mcllvaine緩沖液pH5. 0使FAD-⑶H溶出，回 收FAD-GDH活性部分。將FAD-GDH活性部分合并，用超濾膜進行脫鹽、濃縮，同時交換緩沖液 為20mMKH2P04-Na0H緩沖液pH6. 5，制備pH6. 3、電導率2. 80mS/cm的濃縮液300mL。將該濃 縮液用于以 20mM KH2PO4-NaOH 緩沖液 pH6. 5 平衡化了的 DEAE Sepharose CL-6B，用 20mM K2HPO4-NaOH緩沖液pH6. 5將柱洗凈。全部回收柱流過液(力，iw、° ；^ 一)、洗滌液，回 收柱未吸附部分。利用超濾膜將該部分濃縮，由此得到源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的純 化酶溶液。提高轉(zhuǎn)化的酶的生產(chǎn)性并由大量培養(yǎng)液進行純化，由此艱難地成功得到0. Olu/ mL的純化FAD-⑶H溶液。實施例15〈FAD-GDH的最適pH的比較>比較在實施例2制備的源自米曲霉BB-56的FAD-GDH與在實施例14制備的源自 米曲霉RIB40的FAD-GDH的最適pH。將含有0. 22% (w/v) Triton X-IOO 的 IOOmM Mcllvaine 緩沖液(pH 調(diào)整為 4. 5、 5. 0,6. 0,7. 0 或 8. 0) 2. 55mL、lMD_ 葡萄糖溶液 0. lmL、3mMPMS 溶液 0. 2mL 和 6. 6mM NTB 溶 液0. ImL混合，在37°C下保溫5分鐘后，將該混合溶液以每個150 μ 1分裝在96孔微量培 養(yǎng)板孔中，添加源自米曲霉ΒΒ-56或源自米曲霉RIB40的純化FAD-GDH溶液5 μ 1，開始反 應。測定由酶反應生成的二甲臘在570nm的吸光度，測定每1分鐘的二甲臘的生成量，由 此測定酶活性。測定使用POWERSCAN HT(大日本制藥株式會社)。源自米曲霉BB-56的純 化FAD-GDH的最適pH在7附近(圖9A)，源自米曲霉RIB40的純化FAD-GDH的最適pH為 6.0(圖9B)。該結(jié)果表示，兩種酶的最適pH不同。實施例16〈FAD-GDH的pH穩(wěn)定性比較>將源自米曲霉BB-56或源自米曲霉RIB40的純化FAD-GDH溶液分別用0. IM醋酸 緩沖液PH3、同一緩沖液pH4、0. IM Mcllvaine緩沖液ρΗ4· 5、同一緩沖液ρΗ5· 0、同一緩沖 液ρΗ6· 0、同一緩沖液ρΗ7· 0、同一緩沖液ρΗ8· 0或0. IM Na2CO3-NaHCO3緩沖液ρΗ9· 5稀釋， 在各PH中在37°C下處理30分鐘。將各處理液用0. 2M KH2PO4-NaOH緩沖液pH6. 5稀釋，用 與實施例15相同的方法測定FAD-GDH活性。作為對照，還測定用0. IMKH2PO4-NaOH緩沖液pH6. 5稀釋的冰冷保存的純化FAD-GDH的活性，以該活性為100%，算出相對活性。結(jié)果，源 自米曲霉BB-56的純化FAD-GDH在pH3. 0-7. 0的范圍內(nèi)保持80%以上的活性(圖10A)。另 一方面，源自米曲霉RIB40的純化FAD-GDH的pH穩(wěn)定性表明，只在pH4. 0-5. 0的范圍內(nèi)穩(wěn) 定，穩(wěn)定的PH范圍窄(圖10B)。實施例17〈FAD-GDH的溫度穩(wěn)定性的比較〉將源自米曲霉BB-56或源自米曲霉RIB40的純化FAD-GDH用含有0.22% (w/v) Triton X-IOO的50mM PIPES-NaOH緩沖液ρΗ6· 5稀釋，在各指定溫度，即4、30、40、50或 60°C下處理20分鐘。在冰中冷卻后，對各處理液用與實施例15相同的方法測定FAD-GDH 活性。作為對照，也測定未進行熱處理的酶的FAD-GDH活性，以該活性為100%，算出相對 活性。結(jié)果，源自米曲霉BB-56的純化FAD-GDH在到40°C為止基本保持100%的活性(圖
IIA)。另一方面，源自米曲霉RIB40的純化FAD-GDH在30°C以上條件下活性急劇降低(圖
IIB)。實施例18〈FAD-GDH的底物特異性的比較>將含有0. 22% (w/v)Triton X-IOO 的 50mM PIPES-NaOH 緩沖液(pH6. 5)2. 55mL、 IM底物(D-葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、木糖、麥芽三糖、麥芽六糖、或麥芽五糖)溶液0. 09mL、 3mM PMS溶液0. 2mL和6. 6mM NTB溶液0. ImL混合，在37°C下保溫5分鐘后，將該混合溶液 以每個150 μ 1分裝在96孔微量培養(yǎng)板孔中，添加源自米曲霉ΒΒ-56或源自米曲霉RIB40 的純化FAD-GDH溶液5 μ 1 (活性)，開始反應。測定由酶反應生成的二甲臘在570nm的吸 光度，測定每1分鐘的二甲臘的生成量，由此測定酶活性。測定使用POWERSCAN HT(大日本 制藥株式會社)。以對于D-葡萄糖的反應速度為100%，算出對于各底物的相對活性。結(jié) 果，源自米曲霉RIB40的純化FAD-GDH不僅對于葡萄糖，對于麥芽糖、半乳糖、麥芽六糖也起 作用，表明與源自米曲霉BB-56的FAD-GDH相比，底物特異性低(圖12)。以上，由實施例15 18的結(jié)果可知，在源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因序列與 源自米曲霉RIB40的FAD-GDH基因序列之間不相同的18個堿基序列(6個氨基酸)對酶的 PH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、底物特異性有影響。實施例19<導入了 FAD-GHD的cDNA的酵母的轉(zhuǎn)化體的制備>(1)源自米曲霉BB-56或米曲霉RIB40的cDNA的制備將包含以下組成的培養(yǎng)基50mL分裝在300mL容積的三角燒瓶中，在121°C下滅菌 20分鐘。冷卻后，分別接種米曲霉BB-56或米曲霉RIB40，在30°C、200rpm條件下進行3天培養(yǎng)。(培養(yǎng)基組成)葡萄糖15. 0% (w/v)Meast P1G(ASAHI F00D&HEALTHCARE 公司)3· 0% (w/v)大豆蛋白胨6.0% (w/v)KH2PO4O. 3% (w/v)K2HPO4 (和光純藥工業(yè)株式會社)0. 2 % (w/v)
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4mM氫醌(和光純藥工業(yè)株式會社)pH6. 0將通過過濾培養(yǎng)后的培養(yǎng)液回收的菌體在液氮中急速冷凍，進行粉碎。在該粉碎 菌體中加入TRIzoI試劑(Invitrogen公司)2ml，進一步進行粉碎。將粉碎菌體回復至室 溫，將粉碎菌體的懸濁液收集在1. 5ml容量的試管中，依照附帶的使用說明書記載的方法， 得到全RNA0接著，使用MicroFastTrack2. O試劑盒(Invitrogen公司)依照附帶的使用 說明書記載的方法，純化mRNA。使用Takara RNA LA PCR 試劑盒(AMV) ver. 1. 1將該mRNA 逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA溶液。(2) FAD-⑶H 的 cDNA 的制備以如上所述制備的2種cDNA作為模板通過PCR反應使FAD-GDH的cDNA擴增。反 應使用KOD-plus，反應液組成依照在附帶的使用說明書記載的方法。引物為FAD⑶H-I (序 列編號29)、FAD⑶H-2 (序列編號30)分別為1 μ Μ,在反應體系中加入上述cDNA溶液1 μ 1 作為模板cDNA，實施PCR反應。反應循環(huán)為，在94°C下2分鐘反應后，重復35次(i)-(iii) 的反應⑴在94°C下30秒，(ii)在60°C下30秒，(iii)在68°C下2分鐘。反應完畢后 將反應液在4°C下保存。(3)酵母轉(zhuǎn)化體的制備利用限制酶HindIII和BamHI分別將如上所述得到的2種FAD-GDH的cDNA片段 消化。將限制酶反應后的反應液供給于瓊脂糖電泳，分離目的片段，使用GENECLEAN III試 劑盒(Q-BIOgene公司)由瓊脂糖凝膠提取。將這些DNA片段分別與預先用限制酶HindIII 和BamHI處理的酵母表達型載體pYES2 (Invitrogen公司)連接，由此制備具有源自米曲 霉BB-56的FAD-⑶H的cDNA的pYESGDH和具有源自米曲霉RIB40的FAD-⑶H的cDNA的 PYES2-RFGC。上述連接使用DNA連接試劑盒Ver. 2. 1進行。將pYES⑶H和pYES2_RFGC分 別導入釀酒酵母INVSc株(Invitrogen公司)，得到轉(zhuǎn)化體。上述轉(zhuǎn)化通過附帶的說明書記 載的醋酸鋰法進行。(4)轉(zhuǎn)化導入的cDNA片段的堿基序列的確認確認目的cDNA片段正確地導入上述兩種轉(zhuǎn)化體。將在上述(3)得到的用限制酶 HindIII和BamHI消化的2種FAD-GDH的cDNA片段與用限制酶HindIII和BamHI處理的 載體pBR322(東洋紡織株式會社)連接，由此構(gòu)建(i)具有源自米曲霉BB-56的FAD-GDH 的cDNA的ρ⑶H和(ii)具有源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的cDNA的pRFGC。上述連接使 用DNA連接試劑盒Ver. 2. 1進行。將ρ⑶H和pRFGC分別導入大腸菌DH5株感受態(tài)細胞，得 到大腸菌的轉(zhuǎn)化體。分別培養(yǎng)這2種轉(zhuǎn)化體，使用GenElute Plasmid Minipr印試劑盒 (Sigma-Aldrich日本公司)得到質(zhì)粒ρ⑶H和pRFGC。依照實施例8的方法確定ρ⑶H和 pRFGC的堿基序列。結(jié)果確認，pGDH為缺失序列編號19的啟動子序列、終止子序列和內(nèi)含 子序列的序列(圖5上段的cDNA序列)，且具有第4個的堿基序列C取代為G的cDNA片段 (序列編號33)。上述堿基的取代是由限制酶Ncol識別部位的導入生成的。序列編號33對 應的氨基酸序列(序列編號34)只在第2個氨基酸取代為Val上與序列編號20不同。另 一方面確認，PRFGC為缺失序列編號2的啟動子序列、終止子序列和內(nèi)含子序列的序列(圖 5下段的cDNA序列)，且具有第4個的堿基序列C取代為G的cDNA片段。上述堿基的取代 是由限制酶Ncol識別序列的導入生成的。由以上結(jié)果確認，在上述(4)得到的酵母的轉(zhuǎn)化體分別正確地導入(i)源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的cDNA和(ii)源自米曲霉RIB40的 FAD-⑶H 的 cDNA。實施例20<利用酵母的轉(zhuǎn)化體的FAD-GDH的生產(chǎn)和酵母生產(chǎn)能力的比較>培養(yǎng)在實施例19得到的2種轉(zhuǎn)化體，生產(chǎn)FAD-GDH。培養(yǎng)通過在附帶的說明書推 薦的利用半乳糖的誘導培養(yǎng)法進行。為了確認在培養(yǎng)后的菌體外和菌體內(nèi)的FAD-GDH的生 產(chǎn)，測定培養(yǎng)上清液和菌體破碎液的FAD-GDH活性。FAD-GDH活性的測定如下進行。 (FAD-GDH活性的測定)將含有0. 22% (w/v)Triton X-IOO 的 50mM PIPES-NaOH 緩沖液(pH6. 5)2. 55mL、 IM D-葡萄糖溶液0. 09mL、3mM PMS溶液0. 2mL和6. 6mM NTB溶液0. ImL混合，在37°C下保 溫5分鐘后，將該混合溶液150 μ 1分裝在96孔微量培養(yǎng)板孔中，添加上述培養(yǎng)上清液或菌 體破碎液，即用源自米曲霉ΒΒ-56的FAD-GDH的cDNA轉(zhuǎn)化的酵母或用源自米曲霉RIB40的 FAD-GDH的cDNA轉(zhuǎn)化的酵母的培養(yǎng)上清液或菌體破碎液5 μ 1，開始反應。測定由酶反應生 成的二甲臘在570nm的吸光度，測定每1分鐘的二甲臘的生成量，由此測定FAD-GDH活性。 測定使用POWERSCAN HT (大日本制藥株式會社)。結(jié)果，在用源自米曲霉BB-56的cDNA轉(zhuǎn)化的酵母中，在菌體外和菌體內(nèi)都檢測出 FAD-GDH活性。另一方面，在用源自米曲霉RIB40的cDNA轉(zhuǎn)化的酵母中，在菌體外和菌體內(nèi) 都未檢測出FAD-GDH活性(圖13)。實施例21〈FAD-GDH 的純化 >嘗試由在實施例20得到的2種培養(yǎng)上清液純化FAD-GDH。將各自的培養(yǎng)上清 液供給于以IOmM醋酸鈉緩沖液pH5.0作為透析外液的透析。將透析后的溶液用于以 IOmM 醋酸鈉緩沖液 PH5.0 平衡化了的 HiTrap SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Bio-Sciences公司)，使FAD-GDH吸附在柱上。用IOmM醋酸鈉緩沖液pH5. 0將柱洗凈后， 用含有0. IM NaCl的IOmM醋酸鈉緩沖液pH5. 0將FAD-GDH溶出，回收表現(xiàn)出FAD-GDH活性 的部分。FAD-GDH活性的測定依照實施例20的方法。結(jié)果表明，源自米曲霉BB-56的FAD-GDH幾乎全部由柱吸附溶離部分檢測出(圖 14)。另一方面表明，源自米曲霉RIB40的FAD-GDH在柱未吸附部分和柱吸附部分上都未檢 測出活性(圖15)。實施例22〈FAD-GDH的糖鏈的除去>在實施例21的純化操作中得到的純化酶部分中，將源自米曲霉BB-56的FAD-GDH 活性的比活度最高的部分NO. 18 (圖14)、源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的純化部分 NO. 18 (圖15)和在實施例2制備的由源自野生型米曲霉BB-56的培養(yǎng)上清液純化的 FAD-GDH用作糖鏈除去的樣品。將各樣品在含有0. IM β -巰基乙醇和0. 02 % SDS的50mM醋 酸緩沖液PH5. 5中煮沸5分鐘，添加內(nèi)切糖苷酶H處理(Roche-Diagnostics公司)0. 05U，在 37°C下反應過夜。反應后，將反應液供給于使用PhastSystem(GEHealthcare Bio-Sciences 公司)的SDS-PAGE，依照使用說明書附帶的方法對凝膠進行銀染色。結(jié)果表明，導入了編碼 源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的cDNA的酵母生產(chǎn)與源自野生型米曲霉BB-56的FAD-GDH相同的蛋白質(zhì)(圖16的泳道1 4)。另一方面表明，導入了編碼源自米曲霉RIB40的FAD-GDH 的cDNA的酵母不表達FAD-GDH (圖16的泳道5和6)。以上，由各實施例的結(jié)果可知，在編碼源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的基因與編碼 源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的基因之間不相同的18個核酸堿基(6個氨基酸)對FAD-GDH 的最適PH、pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、底物特異性和利用野生型、轉(zhuǎn)化體的酶的生產(chǎn)能力產(chǎn)生影響。產(chǎn)業(yè)上的可應用性根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，能夠以高效率大量生產(chǎn)底物特異性優(yōu)異的FAD-GDHt^IS 明的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的FAD-GDH能夠更準確地測定葡萄糖量，適用于血糖值的測定或食品(調(diào) 味品或飲料等)中葡萄糖濃度的測定等。本發(fā)明不受上述發(fā)明的實施方式和實施例說明的任何限定。在不脫離本申請要 求保護的范圍的記載、本領域技術人員容易想到的范圍內(nèi)的各種變化方式也包含在本發(fā)明 中。在本說明書中明示的論文、公開特許公報和特許公報等的內(nèi)容是援引其所有內(nèi)容 的引用。
權利要求
一種轉(zhuǎn)化體，導入有編碼黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的DNA，所述DNA選自以下的(a)～(f)(a)編碼以序列編號20表示的氨基酸序列的DNA；(b)由以序列編號19表示的堿基序列構(gòu)成的DNA；(c)具有與以序列編號19表示的堿基序列同源的堿基序列，且編碼具有黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA；(d)編碼以序列編號34表示的氨基酸序列的DNA；(e)由以序列編號33表示的堿基序列構(gòu)成的DNA；(f)具有與以序列編號33表示的堿基序列同源的堿基序列，且編碼具有黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
2.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)化體，是將屬于曲霉屬或酵母菌屬的宿主微生物進行轉(zhuǎn)化 而成的。
3.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)化體，是將米曲霉進行轉(zhuǎn)化而成的。
4.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)化體，是將釀酒酵母進行轉(zhuǎn)化而成的。
5.一種黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的制備方法，包含以下步驟(1)和 (2)而成(1)將權利要求1 4中任一項所述的轉(zhuǎn)化體在產(chǎn)生所述DNA編碼的蛋白質(zhì)的條件下 進行培養(yǎng)的步驟；(2)將產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)回收的步驟。
6.一種葡萄糖測定方法，其特征在于，使用以權利要求5所述的制備方法制備的黃素 腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，來測定樣品中的葡萄糖。
7.—種葡萄糖測定用試劑，其特征在于，包含以權利要求5所述的制備方法制備的黃 素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶。
8.—種葡萄糖測定用試劑盒，包含權利要求7所述的葡萄糖測定用試劑。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于，以高效率大量生產(chǎn)能夠更準確地測定葡萄糖量的新型FAD-GDH。本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)化體，導入有編碼黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的DNA，所述DNA選自以下的(a)～(f)(a)編碼以序列編號20表示的氨基酸序列的DNA；(b)由以序列編號19表示的堿基序列的DNA；(c)具有與以序列編號19表示的堿基序列同源的堿基序列，且編碼具有黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA；(d)編碼以序列編號34表示的氨基酸序列的DNA；(e)由以序列編號33表示的堿基序列的DNA；(f)具有與以序列編號33表示的堿基序列同源的堿基序列，且編碼具有黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。另外，本發(fā)明還提供使用該轉(zhuǎn)化體的黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的制備方法。
文檔編號C12N1/15GK101889077SQ20088011773
公開日2010年11月17日 申請日期2008年10月3日 優(yōu)先權日2007年11月28日
發(fā)明者中西雄二, 結(jié)城健介 申請人:天野酶株式會社