專利名稱：用于鑒定樣品中細菌的揮發(fā)性有機化合物的快速檢測的制作方法
技術領域：
在各種實施方式中，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中一種或多種揮發(fā)性有機化合物 (本文也稱為“V0C”或“有機化合物”)的方法以確定樣品中的一種或多種細菌的有無。
背景技術：
細菌感染、細菌污染和耐藥細菌傳播的發(fā)生為不斷增長的全球性健康問題。例如， 在全世界范圍內(nèi)估計每年發(fā)生超過880萬的肺結(jié)核新病例。最新的報道也強調(diào)了肺結(jié)核抗 性株的出現(xiàn)，其對使用公共交通工具(如商業(yè)性飛機)的旅客構成了危險。細菌的有無、細 菌量或細菌的細菌負荷量及細菌抗性株(如肺結(jié)核)的快速檢測為衛(wèi)生組織(如世界衛(wèi)生 組織)當務之急。目前檢測細菌有無的方法通常包括培養(yǎng)疑似含有細菌的樣品并隨后分離，及使用 各種生化試驗。依據(jù)分離和培養(yǎng)所述細菌所耗的時間，所述測試需耗時2 21天來完成。 因此，盡管所述生化試驗相對便宜，但生長和繼代培養(yǎng)樣品中的細菌以達到測試細菌所需 的最低濃度是耗時的。有用于快速檢測細菌的基于PCR的方法，但其通常是昂貴的且需要先進的實驗室 設備和技術及使用的各種試劑。此外，通常有樣品的頻繁污染，其妨礙了在資源非常有限的 環(huán)境中的使用。作為例子，結(jié)核分枝桿菌(本文也稱為“TB”、“MTb”或“M. tuberculosis”)MTb診 斷標準近百年來沒有顯著的變化。至于研發(fā)出新型MTb診斷，對大規(guī)模的使用(例如在第 三世界國家中)而言，其通常是不實際的。一用于活性肺結(jié)核診斷的標準為抗酸桿菌痰涂 片鏡檢。如果患者痰被測試為MTb陽性(認為“涂片陽性”)，則其患有活性肺結(jié)核、被認為 有高傳染性，且為其安排了用于治療的全面藥物療程。然而，痰涂片鏡檢有低敏感性且通常 需要經(jīng)適當培訓的人員來完成。實際上，估計痰涂片鏡檢至多檢測患有活性肺結(jié)核患者的 25% 60%。因其需要至少10，000個MTb桿菌/ml的存在，所述方法也具有相對差的檢測 限制。用于MTb診斷的血清學測試確實存在，但其需繼續(xù)進行開發(fā)且相比活動性疾病， 更特異于接觸。一些商業(yè)化的測試使用免疫顯性的抗原以用ELISA或浸漬片形式檢測免疫 球蛋白類(如IgG)。估計血清學測試可檢測痰涂片陽性的MTb病例的1/3 3/4。其用 HIV共感染可檢測顯著較少部分的涂片陰性病例。實際上，對兼感染了 HIV和MTb的患者而 言，血清學測試可檢測少于1/3的患有所述疾病活動形式的患者。已開發(fā)出噬菌體系統(tǒng)，其可使用通過感染和在MTb細胞中復制而作為指示物的噬菌體檢測液體培養(yǎng)中活的分枝桿菌。噬菌體系統(tǒng)是快速、穩(wěn)健和高靈敏性的，但對其重復性 和性能所知很少。盡管噬菌體系統(tǒng)因其快速、穩(wěn)健和高靈敏性而有很好的前景，但使用時通 常需要專業(yè)技術人員，而結(jié)果其非常昂貴。因此，在發(fā)展中國家所述系統(tǒng)可能不適于很好的 廣泛使用。通常在III級實驗室使用的放射性和熒光液體培養(yǎng)系統(tǒng)是高靈敏性的，也需要完 整的微生物實驗室的支持并通常需要相對長的時間(1 3周)以生成結(jié)果，且購買其相對 昂貴。盡管放射性液體培養(yǎng)系統(tǒng)穩(wěn)健且靈敏，但需要放射性物質(zhì)，因此其通常需要用于其使 用的特殊設施和培訓。其物質(zhì)的成本會非常高且所述系統(tǒng)不便攜。也開發(fā)了一些非標準化培養(yǎng)系統(tǒng)，其采用廉價的試劑且更適合于廣泛的使用，但 需要更多的研究以確定這些系統(tǒng)的準確性。至少已證明了其與標準診斷水平相當?shù)男阅芩?平。采用廉價試劑的非商業(yè)性液體培養(yǎng)生長檢測方法更適合于在發(fā)展中國家中使用，但其 還沒有標準化，因此其未被TB診斷專家欣然認同。它們可受益于試劑、包裝和產(chǎn)品支持的 標準化。核酸擴增(NAA)系統(tǒng)已在工業(yè)化國家使用了一段時間，且FDA已批準了用于痰中 MTb檢測的兩個系統(tǒng)。NAA比涂片鏡檢測試靈敏性高，但比培養(yǎng)靈敏性低。盡管NAA好于涂 片鏡檢，但其昂貴并需要大量的技術支持和質(zhì)量控制。例如，使用于診斷和藥物抗性測定的 細菌的快速測序(即使用PCR)難于使其在野外使用時便攜和穩(wěn)健。其通常需要大量的動 力和經(jīng)特別處理(即冷藏)的試劑。另外，即使在嚴格管理的實驗室仍有可能污染而導致 假陽性測試。對在高需求(發(fā)展中)國家中使用的系統(tǒng)而言，所述原因使其成為不可能的 目標。另一種常見的MTb測試為結(jié)核菌素或純化的蛋白衍生物(PPD) (PPD皮試)，其為研 發(fā)用于篩選潛伏的MTb的皮試。其他的用于潛伏的MTb的篩選包括測量由從MTb、鳥分支 桿菌和牛分支桿菌獲得的PPDs刺激后的全血中的T淋巴細胞產(chǎn)生的IFN-Y的新型體外測 定。也使用單獨的特異性抗原以提高特異性。所述結(jié)核菌素或PPD皮試與普通的肺結(jié)核疫 苗、卡介苗(“BCG”)和環(huán)境細菌共用許多抗原，所以未被潛伏的MTb感染的人常被測試為 陽性。由于臨床醫(yī)生解釋結(jié)果和患者的多次就診以獲得結(jié)果的需要使所述方法進一步復雜 化。在許多患者(包括已接種了 MTb疫苗的患者或用其他類型的分枝桿菌感染的患者)中 所述皮試經(jīng)常得到不可靠的結(jié)果。當HIV/AIDS患者也是MTb的攜帶者時，其經(jīng)常被測試為 陰性。盡管研發(fā)中的其他皮試(如測量IFN-γ的皮試)不完美且提高所述測試的特異性 通常以靈敏性為代價，但其更特異。因此，需要快速的床旁診斷化驗細菌檢測裝置、方法和系統(tǒng)(例如以篩選疑似感 染一種或多種細菌的患者)。優(yōu)選地，所述裝置、方法和系統(tǒng)可用于野外，例如現(xiàn)場快速監(jiān)測 人或動物的細菌感染(例如在發(fā)展中國家或脫離實驗室環(huán)境的任何場所)、確定環(huán)境中細 菌的存在或測試工業(yè)環(huán)境中的細菌。發(fā)明概述在各種實施方式中，本發(fā)明通過利用某些VOC的靈敏檢測以鑒定樣品中某些細菌 的存在從而解決了目前細菌診斷和鑒定的限制。其允許在實驗室外的環(huán)境中進行例如細菌 感染的診斷、藥物療效的確定和/或耐藥細菌株的診斷。所述細菌可包括，例如，結(jié)核分枝 桿菌、金黃色葡萄球菌(本文也稱為“Staph”或“S. aureus”)、肺炎克雷伯菌(本文也稱為“Kleb”或“K. pneumonia")和/或大腸桿菌(本文也稱為“E. coli”)。不受任何理論限制， 認為某些VOC與細菌的代謝相關，因此可使用其進行檢測從培養(yǎng)物中分離或從存在的多種 類型細菌中分離的存活的、近來存活的或生長的細菌。因此，在各種實施方式中，本發(fā)明涉及檢測與特定細菌的代謝、存在和/或生長有 關的一種或多種VOC以檢測樣品中細菌和/或相關細菌株的有無、濃度、狀態(tài)(如存活、生 長等)和/或抗性數(shù)據(jù)?？墒褂帽銛y式裝置(例如床旁診斷化驗裝置(如但不限于微分遷 移率光譜儀(“DMS”)))檢測一種或多種的V0C?？芍苯訌膩碓?例如人或動物的呼出氣 (例如疑似患有肺結(jié)核(再活化的或原發(fā)的))或從自然環(huán)境或工業(yè)來源釋放的氣體)直接 檢測一種或多種的V0C?？蓮墓腆w或液體樣品(例如從身體來源、從自然環(huán)境來源和/或工 業(yè)來源)產(chǎn)生所述V0C。來源可為例如來自身體、水或土壤樣品和/或工業(yè)產(chǎn)品或廢物流樣 品的組織或流體(例如尿液、汗液、血液、痰和/或冷凝液)。一方面，本發(fā)明涉及用于鑒定樣品中結(jié)核分枝桿菌有無的方法。所述方法的實施 方式包括收集疑似具有結(jié)核分枝桿菌的樣品；及檢測一種或多種指示樣品中結(jié)核分枝桿 菌有無的揮發(fā)性有機化合物的有無。所述有機化合物可以是，或包括甲氧基苯(苯甲醚) (CAS 100-66-3)、2_ 丁酮(CAS :513-86_0)、2_乙基己酸甲酯(例如，手性形式的2-乙基 己酸甲酯(CAS :816-19-3))、丙酸甲酯(CAS :554-12_1)、2_ 戊酮、3-戊酮(CAS :96-22_0)、 2，4_ 二甲基-1-庚烯、甲基異丁基酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、二甲基亞砜、二甲基硫、 2-甲基丙酸甲酯(CAS :547-63-7)、1-乙氧基-2-甲基丙烷(CAS :627-02_1)、1-乙氧基丁 烷(CAS :628-81-9)、叔丁基乙醚(CAS :637_92_3)、2_ 甲基丁酸甲酯(868-57-5)、異丁醇 (CAS 78-83-1)和/或圖22中的質(zhì)譜代表的芳香族化合物。另一方面，本發(fā)明涉及用于鑒定樣品中金黃色葡萄球菌有無的方法。所述方法 的實施方式包括收集疑似具有金黃色葡萄球菌的樣品；及檢測一種或多種指示樣品中金 黃色葡萄球菌有無的揮發(fā)性有機化合物的有無。所述有機化合物可以是，或包括甲硫醇 (CAS :74-93-1)、二甲基硫醚(CAS :75-18_3)、2，3-丁二酮(CAS :431-03_8)、3_ 羥基-2-丁 酮(CAS 513-86-0)、醋酸丁酯(CAS 123-86-4)和苯乙醛(CAS :122-78_1)。另一方面，本發(fā)明涉及用于鑒定樣品中肺炎克雷伯菌有無的方法。所述方法的實 施方式包括收集疑似含有肺炎克雷伯菌的樣品；及檢測一種或多種指示樣品中肺炎克雷 伯菌有無的揮發(fā)性有機化合物的有無。所述有機化合物可以是甲硫醇(CAS:74-93-l)、 2-庚酮(CAS 110-43-0)、2_ 壬酮(CAS :821-55_6)和 2- ^^一烷酮(CAS :112-12_9)。另一方面，本發(fā)明涉及用于鑒定樣品中大腸桿菌有無的方法。所述方法的實施方 式包括收集疑似含有大腸桿菌的樣品；及檢測一種或多種指示樣品中大腸桿菌有無的揮 發(fā)性有機化合物的有無。所述有機化合物可以是，或包括甲硫醇(CAS:74-93-l)、二甲基 二硫化物(CAS 75-18-3)和吲哚(CAS 120-72-9)。在所述任一方面，可檢測一種或多種揮發(fā)性有機化合物的濃度。樣品中檢測到的 有機化合物的存在或濃度可指示特定細菌的存在、濃度、狀態(tài)(如存活、生長等)和/或表 型特征(抗生素抗性、株系等)。在某些實施方式中，一種或多種有機化合物的至少一部分 對樣品中的細菌(例如被檢測到的細菌)是唯一的。在某些實施方式中，可在氣相中檢測 有機化合物。所述樣品本身即可為氣相。例如來自個體的呼出氣，或者與固體或液體樣品 (例如在培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中生長的樣品)混合的氣體，或者由固體或液體樣品產(chǎn)生的氣體。
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可由任何來源獲得所述樣品，例如來自個體的呼出氣。所述呼吸可包括來自個體 的體液。另外，所述樣品可包括流體，例如與個體呼吸相關的體液、痰液、血液、尿液或胸膜 液。在某些實施方式中，所述樣品包括固體物質(zhì)，例如組織或排泄物。在某些實施方式中， 所述樣品可來自自然環(huán)境或工業(yè)環(huán)境，例如土壤、水、經(jīng)加工食品和/或加工廢物流。所述樣品可包括暴露于用于處理細菌的候選治療的細菌以檢測細菌的抗治療株。 所述候選治療可為候選藥物(例如抗生素)，且所述細菌的抗治療株可抗所述藥物?？闪?即分析所述樣品的揮發(fā)性有機化合物。另外，可培養(yǎng)所述樣品，并分析培養(yǎng)樣品的液上空間 的揮發(fā)性有機化合物。檢測到的指示細菌的揮發(fā)性有機化合物可為不論培養(yǎng)條件(例如在 培養(yǎng)基內(nèi)容)的相同化合物或所述化合物對在特定培養(yǎng)條件下生長的細菌有特異性。在各 種實施方式中，本發(fā)明涉及用于鑒定樣品中細菌(如結(jié)核分枝桿菌)的方法。所述方法包 括收集疑似含有細菌的樣品、使用特定培養(yǎng)基(例如包含丙酸鹽的培養(yǎng)基)培養(yǎng)樣品；及 檢測與在特定的培養(yǎng)基上的細菌代謝有關的，且指示所述培養(yǎng)樣品中所述細菌的存在，或 者對所述樣品中所述細菌的治療或抗性的應答的一種或多種揮發(fā)性有機物。在各種實施方式中，本發(fā)明涉及用于鑒定樣品中某種細菌的裝置。所述裝置可包 括用于接收疑似有某種細菌的樣品的輸入部；和用于檢測指示所述樣品中所述細菌的存 在、或者對所述樣品中所述細菌的治療或抗性的應答的一種或多種揮發(fā)性有機化合物的工 具。一方面，所述裝置鑒定樣品中的結(jié)核分枝桿菌，且所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包 括甲氧基苯(苯甲醚)(CAS :100-66-3)、2-丁酮(CAS :513-86_0)、2_乙基己酸甲酯(例 如，手性形式的2-乙基己酸甲酯(CAS :816-19-3))、丙酸甲酯(CAS :554_12_1)、2_戊酮、 3-戊酮(CAS 96-22-0) ,2,4- 二甲基-1-庚烯、甲基異丁基酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、 二甲基亞砜、二甲基硫、2-甲基丙酸甲酯(CAS 547-63-7)、1_乙氧基_2_甲基丙烷(CAS 627-02-1)、1_ 乙氧基丁烷(CAS :628_81_9)、叔丁基乙醚(CAS :637-92_3)、2_ 甲基丁酸甲 酯(868-57-5)、異丁醇(CAS :78-83-1)和/或圖22中的質(zhì)譜代表的芳香族化合物。另 一方面，所述裝置鑒定樣品中的金黃色葡萄球菌，且所述一種或多種有機化合物包括甲 硫醇(CAS :74-93-1)、二甲基硫醚(CAS :75-18-3)、2，3-丁二酮(CAS :431-03_8)、3_ 羥 基-2-丁酮(CAS :513-86-0)、醋酸丁酯(CAS 123-86-4)和苯乙醛(CAS 122-78-1)。另 一方面，所述裝置鑒定樣品中的肺炎克雷伯菌，且所述一種或多種有機化合物包括甲硫醇 (CAS 74-93-1)、2-庚酮(CAS 110-43-0)、2_ 壬酮(CAS :821-55_6)和 2- ^^一烷酮(CAS 112-12-9)。另一方面，所述裝置鑒定樣品中的大腸桿菌，且所述一種或多種有機化合物包 括甲硫醇(CAS 74-93-1)、二 甲基二硫化物(CAS :75-18_3)和吲哚(CAS 120-72-9)。在 任一方面，一種或多種有機化合物的存在可指示樣品中相應細菌的存在，或者對所述樣品 中所述相應細菌的治療或抗性的應答。另外或此外，無一種或多種有機化合物可指示樣品 中無相應細菌，或者對所述樣品中所述相應細菌的治療或抗性的應答。在某些實施方式中，基于在樣品中檢測到的有機化合物的存在和/或濃度鑒定樣 品中細菌的存在或量。在某些實施方式中，基于樣品中檢測到的兩種或多種有機化合物的 存在或濃度來測定樣品中細菌的存在或量。在某些實施方式中，可在不同的時間點(例如 施用治療后)鑒定樣品中細菌的存在或量以便鑒定在細菌負荷和/或治療效力上的變化。認為上述的各種實施方式的特征不相互排斥且可以各種組合和排列存在。附圖簡述
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通過涉及使用與相應的附圖相結(jié)合的下列說明更好的理解本發(fā)明實施方式的上 述和其他目的、方面、特征和優(yōu)勢且使其更明顯，其中圖IA描述了快速診斷結(jié)核病(和/或其他細菌)和確定結(jié)核病(和/或其他細 菌)治療抗性的VOC分析的實施方式的流程圖；圖IB示用于檢測來自樣品液上空間的VOC的例示方法；圖2A為DMS的一實施方式的原理框圖；圖2B為當離子流經(jīng)圖2A的DMS時的離子的示意圖；如實施例1所述，圖3A和3B描述了例示DMS輸出的放大區(qū)以示對應于與匹配的 培養(yǎng)基對照相比的在MTb樣品中存在的峰的特征；圖4描述了示從匹配的培養(yǎng)基對照中區(qū)分MTb的特征之間的分離的例示盒式圖；圖5A描述了 MTb (線100)對比丙酸鹽培養(yǎng)基(線102)的總離子色譜圖(“TIC”) 的例示比較；圖5B描述了 MTb (線103)和培養(yǎng)基對照(線104) TIC (左圖)對比恥垢分支桿菌 (線105)和培養(yǎng)基對照(線106)TIC(右圖)的例示比較；圖5C示鑒定的VOC的DMS優(yōu)化的例示結(jié)果。具體而言，由純化的標準物制備五種 鑒定的VOC的混合物，并在DMS上運行。左側(cè)的圖像示以前的運行參數(shù)而右側(cè)的示當傳感 器溫度變?yōu)?0°C時在DMS中更易鑒定所述化合物；圖6A 6E示MTb樣品和匹配的培養(yǎng)基對照的例示疊加氣相色譜_質(zhì)譜(“GC-MS”) 色譜圖，其中圖6B 6E示在圖6A所示的總色譜圖的部分；圖7描述了丙酸甲酯的美國標準技術研究院(“NIST”)主庫質(zhì)譜和MTb峰1的例 示頭-尾比較作為分析的一部分以鑒定作為樣品中結(jié)核分枝桿菌的指示化合物的丙酸甲 酯；圖8描述了乙醇中丙酸甲酯的重復注射的例示色譜圖作為分析的一部分以鑒定 作為樣品中結(jié)核分枝桿菌的指示化合物的丙酸甲酯；圖9描述了甲醇中標準物2- 丁酮的重復注射的例示色譜圖作為分析的一部分以 鑒定作為樣品中結(jié)核分枝桿菌的指示化合物的2-丁酮；

圖10描述了 2- 丁酮和C14H24O的NIST主庫質(zhì)譜的例示頭-尾比較作為分析的一 部分以鑒定作為樣品中結(jié)核分枝桿菌的指示化合物的2- 丁酮；圖11描述了乙醇中標準物3-戊酮的重復注射的例示色譜圖作為分析的一部分以 鑒定作為樣品中結(jié)核分枝桿菌的指示化合物的3-戊酮；圖12描述了 MTb和標準物3-戊酮疊加譜的例示色譜圖作為分析的一部分以鑒定 作為樣品中結(jié)核分枝桿菌的指示化合物的3-戊酮；圖13描述了甲醇中2-戊酮標準物的重復注射的例示色譜圖作為分析的一部分以 鑒定作為樣品中結(jié)核分枝桿菌的指示化合物的2-戊酮；圖14描述了 2-戊酮和標準物2-戊酮的NIST主庫質(zhì)譜的例示頭-尾比較作為分 析的一部分以鑒定作為樣品中結(jié)核分枝桿菌的指示化合物的2-戊酮；圖15描述了 2-甲基-N，N- 二異丙基丙酰胺和標準物2_戊酮的NIST主庫質(zhì)譜的 例示頭-尾比較作為分析的一部分以鑒定作為樣品中結(jié)核分枝桿菌的指示化合物的2-戊 酮；
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圖16描述了 1-氨基-2-甲基吡啶氫氧化物和甲氧基苯(苯甲醚)的NIST主庫 質(zhì)譜的例示頭-尾比較作為分析的一部分以鑒定作為樣品中結(jié)核分枝桿菌的指示化合物 的苯甲醚；圖17描述了甲醇中甲氧基苯標準物的重復注射的例示色譜圖作為分析的一部分 以鑒定作為樣品中結(jié)核分枝桿菌的指示化合物的苯甲醚；圖18A和18B示對于三種不同細菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌及 對照的分別來自DMS和GC-MS的例示DMS和色譜輸出；圖19A和19B描述了對于下列樣品的分別來自DMS和GC-MS的例示DMS和色譜輸 出(i)大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的混合物，( )金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯 菌的混合物，(iii)僅金黃色葡萄球菌和(iv)培養(yǎng)基對照樣品；圖20描述了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的例示GC-MS色譜圖的疊 加部分，其與特異于大腸桿菌或肺炎克雷伯菌的特定VOC相關；圖21描述了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的例示GC-MS色譜圖的疊 加部分，其與特異于金黃色葡萄球菌的特定VOC相關；圖22描述了 MTb培養(yǎng)物中檢測到的不論培養(yǎng)基中的脂質(zhì)成分的揮發(fā)性芳香族化 合物的VOC的例示質(zhì)譜的光譜圖樣；圖23描述了示圖22中代表揮發(fā)性芳香族化合物的峰的恥垢、Mtb和培養(yǎng)基對照 的例示TIC的疊加部分?？稍谟门囵B(yǎng)基中的三種不同脂質(zhì)成分培養(yǎng)的MTb培養(yǎng)物中檢測到 所述化合物；圖24A描述了用含有不同濃度丙酸鈉的培養(yǎng)基制備的MTb培養(yǎng)物的例示TIC的疊 加部分，并示揮發(fā)性有機化合物、丙酸甲酯的峰。圖24B為描述從圖24A中的TIC峰區(qū)發(fā)出 的丙酸甲酯信號強度的柱形圖；及圖25描述了用含有碳來源的混合物的培養(yǎng)基制備的MTb培養(yǎng)物的例示TIC的疊 加部分。發(fā)明詳述在各種實施方式中，本發(fā)明涉及改進的鑒定樣品中細菌的方法，并允許某些細菌 感染或污染的快速和準確診斷。此外，本發(fā)明的實施方式允許藥物(如抗生素)效力的確 定和/或某些耐藥細菌菌株的診斷。更具體而言，可通過檢測與MTb存在或數(shù)量有關的V0C(例如與MTb代謝有關的 V0C)的存在或數(shù)量來鑒定樣品中的MTb。所述VOC包括，但不限于甲氧基苯(苯甲醚) (CAS 100-66-3)、2_ 丁酮(CAS :78-93_3)、手性形式的 2-乙基己酸甲酯(CAS :816-19_3)、 丙酸甲酯(CAS :554-12-1)、2_ 戊酮(CAS 107-87-9)、3-戊酮(CAS :96-22_0)、2，4-二甲 基-1-庚烯(CAS 19549-87-2)、甲基異丁基酮(CAS 108-10-1)、6_ 甲基-5-庚烯-2-酮 (CAS :110-93-0)、二 甲基亞砜(CAS :67-68_5)、二 甲基硫(CAS :75-18_3)、2-甲基丙酸 甲酯(CAS 547-63-7)、乙氧基 _2_ 甲基丙烷(CAS :627_02_1)、乙氧基丁烷(CAS 628-81-9)、叔丁基乙醚(CAS :637-92_3)、2_ 甲基丁酸甲酯(868-57-5)、異丁醇(CAS 78-83-1)和/或圖22中的質(zhì)譜代表的芳香族化合物?？墒褂盟鯲OC中的任一種或這些 VOC的任意組合來指示樣品中MTb和/或相關的細菌株的存在、濃度和/或狀態(tài)(如存活、 生長等)。另外，可使用無一種或多種V0C，或者一種或多種VOC的濃度低于閾值的鑒定來確定樣品中無細菌?？赏ㄟ^檢測與金黃色葡萄球菌存在或數(shù)量有關的VOC(例如與金黃色葡萄球菌代 謝有關的V0C)的存在或數(shù)量來鑒定樣品中的金黃色葡萄球菌。所述VOC包括，但不限于 甲硫醇(CAS :74-93-1)、二甲基硫醚(CAS :75-18-3)、2，3-丁二酮(CAS :431-03_8)、3_ 羥 基-2- 丁酮(CAS 513-86-0)、醋酸丁酯(CAS 123-86-4)和苯乙醛(CAS 122-78-1)?？墒?用所述VOC中的任一種或所述VOC的組合來指示樣品中金黃色葡萄球菌和/或相關細菌株 的存在、濃度和/或狀態(tài)(如存活、生長等)。另外，可使用無一種或多種V0C，或者一種或 多種VOC的濃度低于閾值的鑒定來確定樣品中無細菌。可通過檢測與肺炎克雷伯菌存在或數(shù)量有關的VOC(例如與肺炎克雷伯菌代謝有 關的V0C)的存在或數(shù)量來鑒定樣品中的肺炎克雷伯菌。所述VOC包括，但不限于甲硫醇 (CAS :74-93-1)、2_ 庚酮(CAS 110-43-0)、2-壬酮(821-55-6)和 2—^一烷酮(112-12-9)。 可使用所述VOC中的任一種或這些VOC的任意組合來指示樣品中肺炎克雷伯菌和/或相關 的細菌株的存在、濃度和/或狀態(tài)(如存活、生長等)。另外，可使用無一種或多種V0C，或 者一種或多種VOC的濃度低于閾值的鑒定來確定樣品中無細菌?？赏ㄟ^檢測與大腸桿菌存在或數(shù)量有關的VOC (例如與大腸桿菌代謝有關的V0C) 的存在或數(shù)量來鑒定樣品中的大腸桿菌。所述VOC包括，但不限于甲硫醇(CAS :74-93-1)、 二甲基二硫化物(CAS 75-18-3)和吲哚(CAS 120-72-9)。可使用所述VOC中的任一種或這 些VOC的任意組合來指示樣品中大腸桿菌和/或相關細菌株的存在、濃度和/或狀態(tài)(如 存活、生長等)。另外，可使用無一種或多種V0C，或者一種或多種VOC的濃度低于閾值的鑒 定來確定樣品中無細菌。1.樣品收集和處理可將樣品收集為固體、液體和/或氣體，并對其進行處理以確定指示樣品中特定 細菌存在的一種或多種VOC的有無。可直接分析樣品的一種或多種V0C，例如從疑似患有 肺部感染的患者的呼吸。另外，可在適合的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述樣品以允許樣品中細菌 的生長和代謝。在某些實施方式中，本發(fā)明涉及從個體中取出痰樣品，并例如用微流體將其 放置在培養(yǎng)基中，或例如用常規(guī)培養(yǎng)方法將其放置在培養(yǎng)物中。如果存在細菌，則刺激其代 謝，可收集由所述代謝所產(chǎn)生的液上空間(氣相)并可測試指示所述生長培養(yǎng)基中細菌的 至少一種代謝物的存在。在圖IA中描述了樣品收集和處理的一例示實施方式。在所述圖中1.從受試者 肺中疑似藏有有害細菌(例如MTb)的受試者收集痰樣品；2.將所述痰樣品轉(zhuǎn)移至收集孔 并為其提供培養(yǎng)基以刺激樣品中細菌的代謝；3.可選地，對于已知含有特定細菌(如MTb) 的樣品而言，可添加候選抗生素到收集孔中的痰和培養(yǎng)基以測試抗生素的效力或細菌抗抗 生素的抗性；和4.用檢測系統(tǒng)的傳感器密封所述收集孔，并(例如，由細菌的代謝)產(chǎn)生了 氣體液上空間。檢測液上空間中的一種或多種揮發(fā)性有機化合物以診斷細菌的感染或抗生 素的效力。在圖IB中描述了樣品處理的第二個例示實施方式。在所述圖中1.用重復物和匹 配的培養(yǎng)基對照制備培養(yǎng)的樣品；2.將溫育樣品液上空間中的揮發(fā)性有機化合物吸收至 集中的固相微萃取(SPME)纖維；3.加熱所述SPME纖維并將揮發(fā)性有機化合物吸收進一個 或多個檢測系統(tǒng)(例如GC-MS檢測系統(tǒng)、DMS檢測系統(tǒng)或GC-MS/DMS雙系統(tǒng))，并獲取數(shù)據(jù)；和4.針對區(qū)分樣品中特定細菌的特征(例如一種或多種V0C)對輸出數(shù)據(jù)進行分析。當采 用所述GC-MS/DMS雙檢測時，可利用從任一系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)庫信息與從兩個系統(tǒng)獲得的數(shù) 據(jù)進行比較。可從包括生物、自然環(huán)境和工業(yè)來源的各種來源獲得樣品。生物的樣品可包括，例 如直接來自個體或來自呼吸機(如通氣機)的呼出氣、來自呼出氣或身體氣體的冷凝物、 痰、尿、汗液、血液、血漿、血清、唾液、精液、組織液、腦脊液、在腎臟透析中獲得的透析液、眼 淚、粘液、羊水、組織和糞便物。自然環(huán)境的樣品可包括，例如土壤、水(如河水、池塘水、湖泊水、地下水、污水、飲 用水、游泳池水)、來自醫(yī)院或公共建筑物表面的拭子、建筑物內(nèi)或目的近點(例如空氣管 道)的空氣樣品、來自空氣過濾器、空調(diào)和通風系統(tǒng)、或通風系統(tǒng)的樣品及塵埃樣品。工業(yè)的樣品可包括，例如食品、飲料或藥物之類的工業(yè)產(chǎn)品、來自制造過程的廢物 流及從制造表面或空間收集的拭子或氣體。在某些實施方式中，傳感器確定在氣相中的液上空間VOC的有無、或濃度以確定 在樣品中是否有存活的細菌。因此，設計樣品容器以阻止樣品容器氣體的釋放或周圍氣體 引入到樣品容器內(nèi)。如果也添加了已知的抑制或殺死細菌的抗生素到培養(yǎng)基，然后存活的 細菌可表明樣品中抗性細菌的存在。因此，使用所述方法可篩選潛在的抗生素。可在培養(yǎng)基或培養(yǎng)物中培養(yǎng)樣品中的細菌，且可選擇性地使所述培養(yǎng)基-或培養(yǎng) 物-培養(yǎng)的細菌接受用于處理細菌的候選治療(例如抗生素之類的候選藥物)?？蓪悠?培養(yǎng)使產(chǎn)生VOC的任意時間。例如可培養(yǎng)樣品少于2小時、2 4小時、4 6小時、6 10 小時、多于10小時或多于24小時。所述培養(yǎng)物可包括任何已知的細菌培養(yǎng)基，例如葡萄糖、 脂質(zhì)、短鏈脂肪酸(如丙酸、膽固醇和/或棕櫚酸)等。在某些實施方式中，檢測到的VOC對 在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的特定細菌是特異性的。例如，所述方法可包括收集含有特定細菌 (如MTb)的樣品、在特定的培養(yǎng)基(如丙酸鹽培養(yǎng)基)上培養(yǎng)所述細菌，及檢測指示在特定 培養(yǎng)基上生長的樣品中細菌的存在的至少一種揮發(fā)性有機化合物。例如，當在丙酸鹽中培 養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌時，所述有機化合物可為或包括丙酸甲酯(CAS號554-12-1)、2_甲基丙 酸甲酯(CAS號547-63-7)、甲基-2-乙基己酸(816-19-3)和/或圖22中的質(zhì)譜代表的芳 香族化合物。此外，在生長培養(yǎng)基中可包括不同濃度的丙酸鹽和/或丙酸鹽與其他碳源的 混合物以優(yōu)化用于檢測樣品中特定細菌(例如MTb)的存在或?qū)ζ溥M行定量的特定VOC的 檢測和/或產(chǎn)生。在其他的實施方式中，不論培養(yǎng)基的成分，檢測到的VOC為相同的V0C。2.揮發(fā)性有機化合物檢測可使用各種技術檢測所述一種或多種V0C，其包括但不限于氣相色譜法(GC)、光 譜測定法(例如質(zhì)譜(包括四級子、飛行時間、串聯(lián)質(zhì)譜、離子回旋共振和/或扇區(qū)(磁性 和/或靜電))、離子遷移譜、不對稱場離子遷移譜和/或DMS)、燃料電池電極、光吸收光譜、 納米粒子技術、彎曲板波(FPW)傳感器、模擬自然發(fā)生的細胞機制的生物傳感器、電化學傳 感器、光聲設備、基于激光的設備、電子鼻(生物來源的、表面涂層的)、各種電離技術和/或 受過訓練的動物的檢測。在某些實施方式中，本發(fā)明為對現(xiàn)有用于細菌檢測的方法的改良。例如，MTb檢測 的痰涂片方法依賴于鏡檢以檢測MTb的存在，且具有較低的10，OOOMTb桿菌/mL的檢測限， 而培養(yǎng)的方法具有較低的IO5 IO6桿菌/mL的檢測限。然而，本發(fā)明的實施方式不需要鏡檢且具有低至IO3桿菌/mL的較低的檢測限。本發(fā)明的實施方式超越標準培養(yǎng)方法的一特 有優(yōu)勢為用于分析的時間。使用目前培養(yǎng)的方法通常需耗時1 4周確定TB的存在或抗 性，而痰和呼吸樣品的揮發(fā)性分析都可在數(shù)分鐘至數(shù)小時內(nèi)產(chǎn)生結(jié)果。為達到培養(yǎng)的樣品 能在培養(yǎng)物表面上產(chǎn)生VOC的程度，無需與現(xiàn)有方法一樣的幾星期而可在幾小時到幾天左 右獲得足夠的培養(yǎng)物。此外，如果不管抗生素的添加而測量細菌生長，本發(fā)明的實施方式允 許藥物抗性的快速檢測。因為本發(fā)明的實施方式利用與活細菌有關的VOC的檢測，其也具 有提高靈敏性和選擇性的能力。所述選擇性源自于僅活細菌可進行活性代謝的事實，因此 相對于血清學或其他類似的有敏感性的技術，其將提供標記但不區(qū)分過去的和本次暴露。 所述比其他方法(如涂片鏡檢)提高的靈敏性來自于目前的離子質(zhì)譜分析儀的能力以檢測 從百萬分之幾到萬億分之幾的敏感性范圍。因此，具有揮發(fā)性化合物的已知特征能利用所 述質(zhì)譜分析儀的提高的靈敏性。在某些實施方式中，可使用床旁診斷化驗診斷工具來鑒定細菌的VOC生物標記 物。優(yōu)選床旁診斷化驗診斷工具(如微型機械化DMS)為便攜的且可檢測VOC至低的檢測 限。下述的實施例4描述了通過使用便攜式的方法檢測一種或多種的VOC和/或VOC的光 譜圖樣以鑒定復雜的臨床樣品中細菌的存在的方法。因此，在某些實施方式中，本發(fā)明包括 VOC的數(shù)據(jù)庫和用于鑒定從一種或多種來源獲得的樣品中的細菌的床旁診斷化驗診斷工具 的相關信息。2A.微分遷移率光譜法在某些實施方式中，用于檢測一種或多種VOC的診斷工具為微分遷移率光譜儀 (Model SVAC, Sionex Corporation, Bedford, Massachusetts) ( “DMS” 或“DMS 裝置”)。 DMS裝置可在環(huán)境溫度和壓力下運行。已研發(fā)出微型機械化DMS作為可移動和手持的便攜 單元。所述光譜儀可產(chǎn)生區(qū)別在GC-MS系統(tǒng)共洗脫的化合物的光譜，其通常產(chǎn)生提高的鑒 定樣品中VOC的能力。對于基質(zhì)輔助激光解吸電離/質(zhì)譜法(MALDI-MS)而言，當以1. 5道 爾頓(Da)的范圍對所述光譜質(zhì)量進行分類時，統(tǒng)計模型已證明了區(qū)分類似于枯草芽孢桿 菌的大致10個物種的能力。這是由于每質(zhì)量間隔的蛋白的大致相同的數(shù)量。最新的數(shù)據(jù) 也提示使用MALDI-MS有75%的正確鑒定率且沒有假陽性。然而，因由于不同的離子遷移率 而使光譜比MS更易重疊合，使用所述DMS技術易于區(qū)別甚至更大量的物種。DMS裝置為定量的，且具有極敏感的低至萬億分之幾范圍的檢測限。DMS技術使用 依賴于高強度RF電場的離子的非線性遷移以用于離子的過濾且在處于大氣壓的空氣中運 行。DMS能進行通過其他方法通常無法解析的化合物的快速檢測和鑒定。DMS裝置可很好 的按比例縮小，允許使用微型電子機械化(MEMS)制造的分析單元的小型化，同時保持靈敏 性和分辨率。DMS的這些和其他優(yōu)勢使其有作為在成本上足夠低的定量檢測器的吸引力從 而在所述領域(例如在臨床環(huán)境下的床旁診斷化驗診斷中)為實用的。從概念上講，DMS的工作原理與四極質(zhì)譜計的類似，但也有顯著的區(qū)別即其在大氣 壓下運行，所以其測量離子遷移率而非離子質(zhì)量。遷移率為應答作用力的離子能多容易的 移動通過空氣的測量，且其依賴于離子的大小、電荷和質(zhì)量。DMS光譜儀起可調(diào)離子濾器的 作用?？蓪庀鄻悠穼氲焦庾V儀以進行測量，在其中所述樣品被電離，且通過載氣將 所述離子經(jīng)離子濾器后運向檢測電極(法拉第平板)。所述DMS裝置可基于不同的離子遷
12移率分離物質(zhì)的化學成分。如圖2A和2B所示，DMS裝置的某些實施方式通過將箭頭12所指的氣體引入到電 離區(qū)18來運行。電離的氣體經(jīng)過流道26和構成離子濾器24的平行電極板20和22間的 通道。當氣體經(jīng)過板20和22間時，其暴露于由給板所施加的電壓誘發(fā)的電極板20和22 間的電場中。在某些實施方式中，產(chǎn)生的電場在時間上為不對稱的和振蕩的。當離子流經(jīng)濾器24時，一些被板20和22中和，而其他的經(jīng)過離子探測器32并被 其感知。在某些實施方式中，所述檢測器32包括在預設定電壓下的頂部電極33和通常在 地面上的底部電極35。頂部電極33使離子向下偏轉(zhuǎn)至底部電極35。因而，依賴于離子和 施加于電極的電壓任一電極可檢測離子。此外，可通過使用作為一檢測器的頂部電極33和 作為第二檢測器的底部電極35檢測多離子。電子控制器30可包括，例如放大器34和微處理器36。放大器34放大了檢測器32 的輸出，其為電極35所收集的電荷的函數(shù)，并將所述輸出提供給用于分析的微處理器36。 類似的，當也使用電極33作為檢測器時，可提供在模型中所示的放大器34’?，F(xiàn)在談及圖2B，當離子38通過對氣流12為橫向的交替不對稱電場40時，電場40 導致所述離子沿路徑42a、42b和42c擺動。隨時間變化的電壓V通常在+/-(1000 2000) 伏的范圍內(nèi)，并產(chǎn)生了有40，000V/cm的最高場強的電場40。特定離子所采取的路徑為其質(zhì) 量、大小、截面和電荷的函數(shù)。一旦離子到達電極20或22，其被中和。通過板20和22所使 用的偏壓也通過圖2A的電壓發(fā)生器在28電極20和22間同時誘導由于+/-100伏直流電 壓通常在+/-2000V/cm的范圍內(nèi)的第二、偏或補償場44應答微處理器36以能使預選的離 子種類通過濾器24到檢測器32。補償場44為抵消交替的不對稱場40的固定偏移以允許 預選的離子(如離子38c)通過檢測器32。因此，當其遇到電極板20和22時，使用適當?shù)?偏壓，特定的離子種類將經(jīng)過路徑42c而不需要的離子將經(jīng)過路徑42a和42b而被中和。DMS光譜儀10的輸出為有給定的偏置電場44的檢測器32中的電荷數(shù)量的測量。 濾器24在給定的補償偏壓處固定越長時間，在檢測器32中將積累越多的電荷。然而，通過 預定的電壓范圍掃描補償壓44可完成樣品氣體12的完整光譜。本發(fā)明某些實施方式的 DMS裝置通常需要少于30秒和少至1秒以產(chǎn)生給定的氣體樣品的完整光譜。通過改變補償 偏壓44，可改變檢測到的VOC以提供氣體樣品的完整光譜。在某些實施方式中，所述DMS裝置包括用于推動由電離源產(chǎn)生的離子38經(jīng)由離子 濾器24產(chǎn)生的不對稱電場40并運向檢測器32的離子流發(fā)生器。相反的電極對(例如環(huán) 電極對和/或平面電極對)可產(chǎn)生離子流發(fā)生器。另外，所述離子流發(fā)生器可在向例如檢 測器32的移動方向中產(chǎn)生縱向電場?？v向電場強度可在時間和空間中恒定，也可隨時間和 空間變化?？v向電場可推動離子38經(jīng)過不對稱電場40。在某些實施方式中，所述DMS裝置 包括氣相層析柱。在其他的實施方式中，將所述DMS裝置連接到氣相層析柱。在某些實施方式中，在電離源的下游在分析間隙中安置離子濾器24用于產(chǎn)生不 對稱電場以過濾由電離源產(chǎn)生的離子。在名稱為“Longitudinal Field Driven Field Asymmetric Ion Mobility Filter andDetection System”的美國專利No. 6，512，224和名 禾爾為“MicromachinedField Asym metric Ion Mobility Filter and Detection System，， 的美國專利No. 6，495，823、名稱為“Longitudinal Field Driven Ion MobilityFilter and Detection System”的美國專利No. 6，815，669中用更詳細描述了 DMS裝置，將它們通過引用整體并入本文。2B.數(shù)據(jù)庫在某些實施方式中，診斷裝置(例如GC-MS裝置、DMS裝置、GC-MS/DMS雙系統(tǒng)或 上述的任何裝置)可包括能儲存指示各種微生物的VOC的信息庫的電子設備。另外，所述 電子設備允許連接至一個或多個遠程數(shù)據(jù)庫。在所述庫或數(shù)據(jù)庫中，可將先前收集和/或 已知的VOC數(shù)據(jù)(例如GC-MS和/或DMS光譜圖樣)與某些微生物相聯(lián)系和/或包括與其 他的相關信息的聯(lián)系。其他的相關信息包括，例如經(jīng)歷培養(yǎng)步驟的樣品的培養(yǎng)條件(例如 培養(yǎng)基、培養(yǎng)基成分、溫度和/或培養(yǎng)物上的液上空間氣體)的有關信息、從身體獲得的樣 品(例如組織類型或身體流體類型)的身體來源的有關信息、從自然環(huán)境(例如土壤類型 或液體類型)獲得的樣品的自然環(huán)境來源的有關信息，及為樣品(如可能的污染物和營養(yǎng) 源)來源的工業(yè)環(huán)境的有關信息?？稍诒銛y式裝置中使用所述信息以用于鑒定樣品中特定 微生物的結(jié)果的快速提供。例如，在下文的實施例4中，將從使用GC-MS進行的VOC同步檢測中收集的數(shù)據(jù)與 DMS數(shù)據(jù)相比較。由DMS檢測器所得的數(shù)據(jù)與GC-MS數(shù)據(jù)的比較允許使用DMS檢測的便攜 式裝置的數(shù)據(jù)庫的產(chǎn)生。
實施例實施例1描述了用于從與之匹配的培養(yǎng)基和從其他的分枝桿菌菌株中鑒定單獨 的細菌類型MTb的方法及用于鑒定指示樣品中MTb的VOC的方法。實施例2也描述了用于 鑒定和檢測樣品中例示揮發(fā)性有機化合物的例示方法。具體而言，實施例2描述了使用質(zhì) 譜分析鑒定指示樣品中MTb的揮發(fā)性有機化合物的色譜峰的方法。實施例3描述了從與之 匹配的培養(yǎng)基中鑒定單獨的細菌類型Staph、Kleb和E. coli的例示方法及使用床旁診斷化 驗診斷工具來鑒定樣品中特定細菌的例示方法。實施例3也描述了產(chǎn)生工具的數(shù)據(jù)庫以便 于樣品中細菌的快速鑒定。實施例4描述了示與遇到不同培養(yǎng)基的特定細菌始終相關的或 與用特定類型、濃度或培養(yǎng)基成分的混合物培養(yǎng)的特定細菌始終相關的VOC的實驗。實施 例5示可使用一種或多種VOC以鑒定樣品中特定細菌的狀態(tài)(例如存活、生長等)，例如接 觸抗生素的細菌。實施例1 為評估用于檢測細菌VOC的方法的能力，對MTb及作為對照株的其他兩個分枝桿 菌-恥垢分枝桿菌(MSmeg)和鳥分枝桿菌(MAC)進行了兩項研究。在第一項研究中，在 Bactec 12B培養(yǎng)基中以低濃度( 10~5桿菌/mL)培養(yǎng)MTb的兩株和MAC的一株。所述 研究確定在所述低桿菌濃度進行細菌的鑒定是可能的且可確認所述方法能鑒定a)從其 匹配培養(yǎng)基所得的每個細菌；b)從另一 MTb株所得的一 MTb株；和c)從分枝桿菌對照株 (MAC)所得的MTb。在第二項研究中，提高從液上空間提取的VOC量以確定可通過質(zhì)譜測量 鑒定所述化合物。la.上述圖IB示用于獲得所述兩項研究的數(shù)據(jù)的一般方法。以每個處理八個重復在 Bactec 瓶中培養(yǎng)細菌。如Bactec 機器所測定的在選定的指數(shù)生長時收集所述兩種菌株， 并使用只吸收和濃縮VOC的SPME纖維提取其液上空間。使VOC從SPME纖維脫附進入氣相
14色譜儀，然后在低溫捕集器中再濃縮。層析分離V0C，并在過柱后分離洗脫流。大致一半的 洗脫液被轉(zhuǎn)移進四極質(zhì)譜計(MS)，而另一半被轉(zhuǎn)移至DMS裝置。將MS用于化合物鑒定，并 確保兩個探測器間的峰相關。在第二項研究中，所述桿菌濃度為IO8AiL或比第一項研究高約IO3倍，并提高液 上空間的培養(yǎng)時間至24小時。此外，在使用短鏈脂肪酸(丙酸)代替葡萄糖和甘油作為碳 源的Middlebrook 7H9培養(yǎng)基中培養(yǎng)MTb的一株和一對照株(MSmeg)。因為許多研究表明 MTb在體內(nèi)可能利用脂質(zhì)，預計脂肪酸代謝可產(chǎn)生更多的生理相關V0C。在含有葡萄糖和甘 油的Middlebrook 7H9培養(yǎng)基中制備MTb的第二培養(yǎng)物。使用上述相同方案在每次培養(yǎng)的 指數(shù)生長期間提取液上空間V0C。使用在每個細菌和其匹配培養(yǎng)基對照間及在MTb和對照分枝桿菌菌株間的兩組 數(shù)據(jù)的比較分析由DMS檢測產(chǎn)生的數(shù)據(jù)?；谠诎藗€重復的平均值間的不同的峰完成特征 的選擇。然后對特征進行逐個的研究以確認其在兩組間有無。一旦鑒定了所述特征，其將 被使用以確定分類百分比。
_0] lb.結(jié)果DMS將MTb從培養(yǎng)某和對照分H干菌中區(qū)另I丨開對應于在MTb和匹配的培養(yǎng)基對照中存在的新或更強的峰的陽性特征為理想特 征，因為其代表MTb代謝物的產(chǎn)生，因此其在活動感染期間的患者的肺中存在。在圖3A和 3B中顯示了一組代表性的特征，其描述了 DMS輸出的放大區(qū)以示對應于與匹配的培養(yǎng)基對 照相比在MTb樣品中存在的峰的特征。然后將選定的特征用于在MTb和培養(yǎng)基間及MTb和 對照株間的類分。在圖4顯示了示MTb株1和其匹配培養(yǎng)基間區(qū)別的選定特征的代表性盒 式圖。其為在生長指數(shù)900的MTb株1中發(fā)現(xiàn)的特征之一。使用兩個或三個特征以使用 K最近鄰域或支持向量機的標準算法區(qū)別細菌種類。在表A中顯示了所得的分類效率的總 結(jié)。表A: 具體而言，表A顯示了使用含有揮發(fā)性有機化合物的液上空間的DMS分析的結(jié)核分枝桿菌和匹配培養(yǎng)基或鳥分枝桿菌復合菌群的兩組比較的結(jié)果。以IO5桿菌/mL的初濃 度培養(yǎng)細菌。最后一行為在脂質(zhì)培養(yǎng)基中進行的獨立實驗；所述數(shù)據(jù)的提取和分析過程是 相同的。在使用SPME纖維進行液上空間的提取，并通過DMS分析后，通過用二維離散小波 變換(2D-DWT)變換所述數(shù)據(jù)來分析所述MTb、MAC和匹配的培養(yǎng)基數(shù)據(jù)?？蓪⑿〔ㄒ暈槲?于補償電壓和時間的正交特征；其在濾波、去噪和基線消除任務上有用。然后通過將小波逼 近系數(shù)設置為零，而在信號上完成基線消除。通過從源自最高水平細節(jié)系數(shù)的重要特征移 除在信號上有效的進行濾波。使用費雪線性判定排列剩下的系數(shù)。自動的消去冗余系數(shù)。 最終，通過檢查證實特征用于分類和用于作為生物標記物的考慮。然后將選定的特征提交 給使用交叉驗證的K最近鄰域分類器和支持向量機分類器。表A確認在MTb和培養(yǎng)基背景及MTb和MAC間有高分離性的MTb中檢測到了特征。 在MTb株1和株2間所述特征子集相同，這提示其與來自MTb的VOC對應。應注意MS很少 甚至沒有檢測到所述特征的對應信號，提示在所述實驗中DMS比MS有更低的檢測限和/或 不同的選擇性。然而，此研究證實，可使用具有高分離性和低細菌檢測限(例如在低至IO5 桿菌/mL的桿菌濃度)DMS通過檢測指示MTb (例如MTb V0C)的VOC來鑒定樣品中的MTb。Ic.結(jié)果:ilH普鑒定MTb揮發(fā)丨牛有和,化合物在第二項研究中，提高從液上空間提取的VOC量。在圖5A中示MTb和丙酸鹽培養(yǎng) 基的代表性TIC。圖5A描述了 MTb (線100)對比丙酸鹽培養(yǎng)基(線102)總離子色譜圖的 比較。使用SPME提取由純化合物制備的標準溶液的液上空間，且所得的色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)確 定了指示MTb的V0C。從用包含丙酸鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)的MTb鑒定出MTb特有的七個峰。在 圖5A(箭頭和持續(xù)時間)顯示了七個峰中的四個。在下面的實施例2中更全面的描述用于 鑒定和進一步表征選定的VOC的例示方法。當在使用葡萄糖/甘油作為碳源的7H9培養(yǎng)基中生長相同的MTb株時，在色譜圖 中只鑒定了兩個特有的MTb峰(見在圖5B左圖的箭頭)。圖5B描述了 MTb (線103)和對 照培養(yǎng)基(線104)TIC(左圖)對比恥垢分支桿菌(線105)和對照(線106)TIC(右圖) 的比較。對于在脂相中培養(yǎng)的恥垢分支桿菌而言，相對于匹配的培養(yǎng)基只觀察到了細菌的 一個特有的峰。在脂質(zhì)培養(yǎng)基中在MTb VOC間也觀察到了所述峰，其表明所述兩種細菌共 用至少一種共同的代謝物，且可能共用代謝途徑?？偟膩碚f，所述結(jié)果確定了特有的代謝分 布，其允許對不同的分枝桿菌和不同的生長環(huán)境的辨別。MTb特有的VOC的鑒定也為優(yōu)化各 種檢測方法(例如呼吸中所述化合物的DMS傳感器檢測)提供了機會。具體而言，在當其 從色譜柱洗脫時優(yōu)選目的化合物的固定電壓下保持RF和V。電場，以便將所需離子的最大 量傳遞到檢測器以產(chǎn)生在信號上伴隨的增強。使用所述方式，本文所述方法便于檢測接觸 各種細菌的個體呼吸中存在的所述化合物。在圖5C中顯示了含有由GC-MS鑒定的五種已知VOC的混合物的另一實施例的 優(yōu)化。從純化的標準物制備了五種鑒定的VOC的混合物，并在DMS上運行。圖5C的左側(cè) 示所述化合物在使用先前的運行參數(shù)的DMS上運行，而右側(cè)示使用優(yōu)化的溫度參數(shù)的化 合物。如圖5C所示，當傳感器溫度變至40°C時，在DMS中更容易鑒定出所述化合物。從 850C /1100V(圖5C左側(cè))和40°C /1100V(圖5C右側(cè))的傳感器溫度/色散電壓組合收集 所述數(shù)據(jù)。當色散電壓保持恒定時，在更高的溫度(85°C)未觀察到200秒左右的峰5。然而，當傳感器溫度降低至40°C時，對于在混合物中的所有分析物可觀察到在峰值強度增強 的第五個代謝物峰。在所述兩組實驗中所述色散保持恒定。其他的溫度/色散電壓組合可 提高峰2和3的峰可分性。Id.結(jié)果和討論總之，所述結(jié)果確定可從培養(yǎng)基或有高分類效率的其他細菌區(qū)分出特定細菌。此 外，串聯(lián)檢測系統(tǒng)能鑒定MTb的至少15種指示化合物。所述鑒定允許檢測(例如DMS檢 測)的優(yōu)化以提高(例如在呼吸或痰樣品)VOC生物標記物檢測的靈敏性。實施例2 收集和分析從三組樣品所得的數(shù)據(jù)。所述三組樣品包括在具有添加的丙酸鹽(也 稱為脂相)的Middlebrook 7H9中的結(jié)核分枝桿菌、在Middlebrook 7H9中的結(jié)核分枝桿 菌及在脂相中的恥垢分枝桿菌。將僅有培養(yǎng)基和空氣提取物用作每個數(shù)據(jù)集的對照。在指 數(shù)生長階段使用SPME纖維通過將液上氣體接觸所述纖維30分鐘以提取每個細菌樣品液上 空間的揮發(fā)物，且脂質(zhì)中的MTb、7H9中的MTb及恥垢分枝桿菌的OD值分別為0. 48,0. 48和 0. 63。以如以上的細菌所述的相同方式提取非細菌樣品液上空間的揮發(fā)物，且應注意在相 同的容器和條件中在相同的時間段溫育所述培養(yǎng)基。在表B中總結(jié)了相關的樣品。表B :MTb脂質(zhì)研究分析的樣品的質(zhì)譜分析
空氣提取物對于每個條件，收集各條件的多個氣相提取物樣品，并用唯一的標示符(例如 13_4)標識。例如脂相中的MTb，列出了九個重復。對于恥垢分枝桿菌，未鑒定其空氣提取 纖維。 檢查空氣、脂相和MTb樣品的重復，并收集峰持續(xù)時間的詳細列表及空氣、丙酸鹽 培養(yǎng)基和脂質(zhì)培養(yǎng)基中的MTb的鑒定。使用ChemStation NIST庫將選定的峰與已知的化 合物相比較。一般而言，選擇峰的最高百分比匹配，提供的百分比匹配為彡30%。而在MS 峰鑒定中為不可接受的閾值，其中通常使用> 70%的匹配。在所述數(shù)據(jù)中的大多數(shù)色譜峰 沒有實質(zhì)的峰值強度(即> 10000的總離子豐度)。然而，在未了解MTb液上空間中存在什 么分析物的情況下，采用較低的閾值百分比匹配是合理的。計算每個峰持續(xù)時間的平均值、標準偏差(sd)和百分比相對標準偏差(％ rsd)。 對于穩(wěn)健的色譜系統(tǒng)，需要< 2. 0% rsd的樣品分析物，優(yōu)選< 1. 0%。所述結(jié)果的評估確 定了脂質(zhì)培養(yǎng)基和MTb色譜持續(xù)時間中的持續(xù)時間上的再現(xiàn)性。計算MTb樣品第一峰(平 均持續(xù)時間=3. 18分鐘)的最大％ rsd為1.7%，而相應的脂質(zhì)培養(yǎng)基峰(平均持續(xù)時間 =3. 19分鐘)有0.71%的相對誤差。在所有情況中，其為寬硅氧烷峰且基于其短持續(xù)時 間、寬峰寬度和分析有用性的缺乏，可將其忽視。其他所有剩下的峰有對于MTb的0. 064 0. 40% rsd的相對誤差值，及對于脂質(zhì)培養(yǎng)基的0. 035 0. 36% rsd的相對誤差值。最后 使用標準即所述峰必須在代表樣品處理的八個重復的八個色譜圖中的三個出現(xiàn)來確定在 脂質(zhì)培養(yǎng)基和MTb色譜圖中峰的總數(shù)。因此，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)培養(yǎng)基有39個峰而MTb有38個峰。用評估的峰鑒定和再現(xiàn)性疊加脂相中MTb和只有脂相的TIC。只比較了在同一天 經(jīng)GC-MS分析的細菌和培養(yǎng)基以簡化比較。這使任何色譜技術固有的分析物持續(xù)中的日 間浮動最小化?；诖_定的分析物持續(xù)時間的再現(xiàn)性，通過所述選擇未引入解釋誤差。圖 6A 6E示與匹配培養(yǎng)基對照的色譜圖疊加的例示MTb色譜圖。在圖6B 6E中通過如下 文所確定的峰數(shù)量和化合物的鑒定對MTb的六個例示指示峰進行鑒定。表C =MTb特有的TIC峰的平均持續(xù)時間 基于色譜圖的優(yōu)點、質(zhì)譜評估和與NIST庫的比較來鑒定了七個色譜峰中的六個。 隨后的部分提供了色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的詳細分析，而表D總結(jié)了基于與OTST庫的匹配的總離 子豐度和峰特性。簡言之，NIST庫搜索機制采用了三種方法進行化合物鑒定正向搜索、反 向搜索和匹配概率。正向和反向搜索都基于在未知譜和庫譜間完美匹配的事件中的理想得 分1000。在實際中使用的基準參數(shù)為彡900的值是優(yōu)匹配，800至900間的值為良，700至 800間的值為中，而任何低于600的值為差。在正向搜索中，所述軟件將未知的質(zhì)譜與已知 化合物的質(zhì)譜相比較，且所得分反映了未知的質(zhì)譜能以何種程度匹配已知化合物的質(zhì)譜。 在已知質(zhì)譜中缺無的未知質(zhì)譜中的額外峰導致了兩種化合物間匹配的更低得分。相反，反 向搜索嘗試在未知質(zhì)譜中發(fā)現(xiàn)已知的化合物，并假定在未知中存在但在庫譜中缺無的峰為 雜質(zhì)。表D 在TIC中特有的MTb峰的峰a豐度和庫匹配 a =以持續(xù)時間增加排列的峰。見表C* =峰6為2-乙基己酸甲酯以百分比報告匹配概率值且所述得分體現(xiàn)了未知質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫中的已知化合物 正確匹配的可能性。因而，質(zhì)譜可與多個數(shù)據(jù)庫條目匹配的未知化合物比具有高特有離子 分布的未知化合物得分更低。因此，一給定的質(zhì)譜可在正向和反向搜索中獲得有利的分數(shù)， 但在匹配概率范疇中仍獲得較低的分數(shù)。概率值的解讀類似于正向和反向搜索，但基于理 想得分100。最后，應了解使用OTST庫(同一化合物通常有多個條目)在分數(shù)賦值上很大 變化。主庫為由NIST人員判定的為最優(yōu)譜的條目，然而重復的庫中包含由其他人提交的其 他條目。因而，當為給定的質(zhì)譜提供得分時，可將不同的重復與主庫質(zhì)譜或提供的任何重復 庫比較。在本文提供的分析物中，在匹配的參照質(zhì)譜(即主庫或重復庫條目)間無區(qū)別。盡 管在庫條目間有一些變化，但假定在譜解讀中未引入可觀的錯誤。因為許多外部因素在質(zhì)譜所得分上具有有害的影響，給定的色譜峰的各種OTST得分的理解是相關的。通常而言，基于差的信噪比具有低的總離子豐度的峰趨于獲得更低 的分。如果所述色譜峰不是特別的大(即總離子豐度為5000或更大)，峰的純度會有點不 可靠，且在可測量的強度處所述質(zhì)譜不包括所有的離子片段峰。此外，在數(shù)據(jù)的評估中應注 意MTb文件13_4、6、9、10和14_4、6的所有質(zhì)譜在40和44的m/z值處包含異常大的峰。 在一些情況下，所述峰在質(zhì)譜中有最大的絕對豐度，從而相比于NIST庫參照譜其更重。無 論在色譜圖的何處選定了峰，基于氬氣(m/z = 40)和二氧化碳(m/z = 44)在每個質(zhì)譜中 的普遍性認為所述峰由所述氬氣和二氧化碳所引發(fā)。所述兩種化合物應來源于樣品的外 部，因為其在與儀器系統(tǒng)的無效時間(非殘留溶質(zhì)從柱上洗脫所需的時間)相同的時間洗 脫。因為在每個譜中都出現(xiàn)了所述峰，因此必須有持續(xù)的來源，而其明顯不源于所述SPME 纖維。在所有的可能中，氬氣的來源為氦載氣，而可能由質(zhì)量選擇性檢測器中的漏氣引入二 氧化碳。無論如何，六個文件中所述兩個峰的持續(xù)存在可起到降低與NIST庫的匹配質(zhì)量的 作用。因此，在下述結(jié)果中考慮所述峰的影響。盡可能的經(jīng)在MTb分析中所用的相同方法并在相同的條件下運行已知標準物，以 確認各種色譜峰的特性。標準化合物的持續(xù)時間不應與MTb色譜峰的持續(xù)時間具有顯著差 異，并產(chǎn)生與庫質(zhì)譜幾近匹配的質(zhì)譜。此外，可將以所述方式獲得的標準物的質(zhì)譜與未知化 合物的質(zhì)譜相比較以確定峰鑒定的完整性。除在兩種分析物從柱上共洗脫的罕見情況外， 所述確認方法允許正確的峰鑒定。為此，可經(jīng)不同區(qū)域的色譜峰查看MTb樣品的質(zhì)譜以確 定所述峰是否為色譜純。在下述的分析中未發(fā)現(xiàn)共洗脫的跡象。2b.鑒定丙酸甲酯作為樣品中MTb的指示化合物使用NIST庫初步鑒定峰IMTb重復物，并返回在每個情況下的丙酸甲酯的特有匹 配值。沒有其他的庫譜與化合物的質(zhì)譜有意義地匹配，并在表E中總結(jié)搜索結(jié)果。OTST庫 包含丙酸甲酯的總共五個質(zhì)譜條目(主庫加四個重復庫)。表E =MTb峰1 (tr = 4. 433士0. 007)與丙酸甲酯的NIST庫匹配 除文件13_6的正向搜索外，所有的正向和反向搜索得分為中至良。反向搜索得分 始終比所述正向得分高。甚至更令人鼓舞的是概率匹配得分，其中八個文件中的六個匹配 好于70%，即用于確定相對于所述庫的化合物質(zhì)譜的獨特性的閾值。所述結(jié)果表明峰1為 丙酸甲酯。將個別的MTb重復物質(zhì)譜與庫譜比較，且特別感興趣的為特征性的m/z峰的相對 峰豐度。因為在NIST庫中有丙酸甲酯的五個參照譜，在相對峰豐度上有一些變化。此外，大 多數(shù)參照譜有5 6個m/z值小于39的峰；用于此實驗的儀器方法無m/z值小于39。因為在MTb譜中缺無特征性峰，這影響了峰的得分。使用所述NIST參照譜，預期的m/z值以相 對豐度的降序排列為57 > 88 59 > 45 55。作為主峰，m/z = 57的相對豐度為100%， 而在88和59處的峰約為20 35%，且剩下的兩個峰只有約4 6%的相對豐度。因而， 只能進行相對豐度值的有限的比較。用在表F中提供的相對峰強度的詳細比較，在圖7中 示MTb和丙酸甲酯參照譜的代表性的頭-尾比較。表F 在MTb重復物中丙酸甲酯的相對離子豐度 * =由星號指明的離子疑似由氬氣(m/z = 40)和二氧化碳(為m/z = 44)引發(fā)。 因此，所述離子的豐度可能與化合物特性無關。圖7的檢查示在參照譜中m/z值< 30處的額外峰為可見的。在參照譜中缺無的 小峰遍及在MTb樣品的質(zhì)譜中。如先前所指，對于大多數(shù)MTb文件，氬氣和二氧化碳的相對 離子豐度是相當基本的(在表F中用星號指明)且其還掩蓋了匹配的質(zhì)量。如果可忽視作 為系統(tǒng)性錯誤的所述值，然后很顯然所述相對離子豐度可與參照質(zhì)譜的相對離子豐度能相 當好的匹配。在所有情況下，所述m/z = 57峰為最豐，在59和88處的峰一般為20 35% 的相對豐度，而m/z = 45和55的明顯更低(所有都少于8%)?？偟膩碚f，所述數(shù)據(jù)表明 丙酸甲酯為所述化合物的特性。使用已知的丙酸甲酯對其進一步證實。在乙醇(Sigma-AldriCh，200prOOf)中制 備約20ppmv丙酸甲酯(Aldrich，99% )的溶液，以便在TIC中的所得總離子豐度與在MTb 文件中觀察到的相當。使用SPME纖維提取溶液的液上空間5分鐘，且一式三份地進行所 述實驗。相關數(shù)據(jù)文件為24_7、8和9，且在圖8中示TIC的相關部分。發(fā)現(xiàn)丙酸甲酯的平 均持續(xù)時間為4. 427士0. 004 (% rsd = 0. 10% )，其可與MTb結(jié)果中峰1的平均持續(xù)時間 (4. 433士0. 007)順利的比較。在兩組平均值上進行的t檢驗顯示，兩組持續(xù)時間上以95% 可信度無統(tǒng)計學顯著差異，其還表明了峰1作為丙酸甲酯的鑒定。將標準物的質(zhì)譜與OTST譜庫的相比較，并在表G中列出所述搜索結(jié)果。所述標準 丙酸甲酯溶液的質(zhì)譜都產(chǎn)生了良的正向和反向搜索，且匹配概率值是優(yōu)。
表G 丙酸甲酯標準物的NIST庫匹配 標準物的相對離子豐度也確定了 NIST庫和MTb峰的質(zhì)譜。具體而言，所述m/z = 57峰有100%的相對豐度值，而在88和59處的m/z峰是相當?shù)?，且?0 43%。丙酸甲 酯標準物的m/z = 45相對峰豐度明顯比MTb樣品的高(大致25%對比5% )，可是在表F 中列出的除去m/z = 40和44的所有剩余峰有與MTb樣品相當?shù)南鄬ωS度值?？偟膩碚f， 所述數(shù)據(jù)明確表明了峰1的特性為丙酸甲酯。2c.檢測2- 丁酮作為樣品中MTb的指示化合物根據(jù)NIST庫評估了峰2重復物，且八個重復物中的五個與2- 丁酮最佳匹配。將 剩余峰大部分的匹配于6，10-二甲基_(E，E)-5，9-十二碳二烯-2-酮(C14H24O)。在表H中 示庫搜索的結(jié)果。NIST庫有2-丁酮的總共四個條目主庫質(zhì)譜及三個重復表H :MTb 峰 2(tr = 4. 643 士0. 009)的 NIST 庫匹配 表H檢查的2-丁酮的正向和反向搜索結(jié)果顯示在所有但除去一個的情況下，所述 搜索匹配為中到優(yōu)。只有一個正向搜索結(jié)果為差。C14H24O的正向和反向搜索結(jié)果都是有效 的良。對于這兩種化合物而言，反向搜索總獲得比正向搜索更高的分，這如預期，因為正向 搜索對在已知譜中缺無而在未知中出現(xiàn)的額外峰罰分。無論使用2-丁酮的哪一個庫條目， 結(jié)果是相同的。在任何重復中兩種化合物的概率匹配不超過所需的70%的閾值。在甲醇(Sigma,M1770-1L)中制備約 20ppmv 的 2_ 丁酮(Sigma-Aldrich, 99+% )標準溶液以鑒定MTb峰2。選擇所述濃度以產(chǎn)生與MTb文件所獲得的總離子豐度相當?shù)目?離子豐度。使用SPME纖維一式三份地提取所得溶液的液上空間5分鐘。在提取后，使用雙 檢測器GC-MS捕沖系統(tǒng)分析所述樣品，而相關的數(shù)據(jù)文件為16_3、4和5。在圖9中示所得 的TIC，且2- 丁酮的平均持續(xù)時間為4. 652士0. 009 (rsd = 0. 20% )0 2- 丁酮持續(xù)時間與 MTb峰2持續(xù)時間的比較顯示，在持續(xù)時間上以95%可信度無顯著差異。所述結(jié)果表明MTb 峰2為2-丁酮。然后將標準物2- 丁酮質(zhì)譜與2- 丁酮和C14H24O的NIST譜庫條目相比較，且在表1 中顯示所述結(jié)果。表I :2_ 丁酮標準物的NIST庫匹配 如用MTb重復物所觀察，2-丁酮標準物的正向和反向搜索一般為良至中的匹配。 雖然概率匹配未達到70%的閾值，但對于2-丁酮，所述匹配顯示了比MTb重復物提高的譜 獨特性，而C14H24O的匹配是差。同樣，除了一例外文件16_5，標準物和C14H24O的正向和反向 搜索都為中。反向搜索總返回比正向搜索更高的分?？偟膩碚f，所述結(jié)果表明NIST庫譜匹 配無法預測2- 丁酮和NIST庫間所需的最小匹配概率。毫無疑問，在TIC中觀察到的標準 物( 1600 2800)和MTb重復物(6000 10000)的低總離子豐度導致了較低質(zhì)量的匹 配。然而，對2- 丁酮標準物和MTb重復物都良的匹配概率對于C14H24O顯然更差。比較在各種已知化合物的庫條目中的m/z值的相對豐度以幫助未知化合物的鑒 定。在表J中總結(jié)所述結(jié)果。表J =NIST庫條目的相對離子豐度a a =基于2- 丁酮以相對豐度的降序列出的離子m/z值。b = 2-丁酮的NIST參照譜。主庫來源為(.0拍1~狀&，重復物1為化學的概念，重 復物2為日本AIST/NIMC數(shù)據(jù)庫，及重復物3為DowChemical Company。
c = 6，10-二甲基-(E，E)-5，9-十二碳二烯-2-酮(C14H24O)的 NIST 參照譜。主 庫來源為 Insect Chem. Ecol. Lab如表J所指，很顯然四個2-丁酮庫質(zhì)譜的每個都有相同的相對豐度值順序43 >72 >57 >42 >44。四個譜間的相對豐度相當可比。觀察到了具有相當?shù)南鄬ωS度的 C14H24O譜的幾乎一致的順序；因為m/z = 58具有稍微更高的相對豐度，只有m/z = 44在順 序外。所述數(shù)據(jù)表明2- 丁酮質(zhì)譜實際上為C14H24O主離子峰的子集，且經(jīng)兩個庫譜的頭_尾 比較在圖10中對其進行了圖示的描述。因為所述質(zhì)譜本身實質(zhì)上不是特有的，所述現(xiàn)象為 造成MTb峰的差概率匹配值的部分原因。然后評估2- 丁酮標準物和MTb重復物的主離子的相對豐度。對于八個重復的六 個，在m/z = 40和44處反常大的峰引入了一些誤差到NIST庫的譜解讀和與NIST庫的比 較。為此，對沒有包含所述兩個峰的所有MTb和2-丁酮標準重復物計算主離子的相對豐度。 在表K中示所得值。在表K中，相對離子豐度與2-丁酮和C14H24O NIST庫譜在很大程度上 匹配良好(見表J)。然而，將相對離子豐度的可比性進一步證明峰2為2- 丁酮或C14H24O15表K :2- 丁酮和MTb重復物的相對離子豐度 a =以如表J確定的相對豐度的降序列出的離子m/z值。b = MTb 重復物。
。= 2-丁酮標準物。色譜證據(jù)表明峰2作為2-丁酮的特性。此外，C14H24O不可能與2-丁酮共洗脫。 C14H24O的制劑重量為208，而2-丁酮的為72。因C14H24O的沸點是未知的，認為其與2-丁酮 的沸點是相同的和/或在色譜柱中其經(jīng)歷相同的持續(xù)特征是不切實際的。然而，評判其他 有助于少于理想匹配的MS特征是有益的。如果未知化合物為C14H24O,在m/z = 58、55、41和71處可預期有額外的峰。特別 感興趣的為大于72的m/z值的存在，因為其為2- 丁酮的分子量，且2- 丁酮譜中未觀察到 更大的峰。對于C14H24O而言，按照相對豐度的順序記錄的峰為85、83、84和98。所述峰的 相對豐度約為1 3%。評判2- 丁酮標準物的質(zhì)譜，除在m/z = 85處具有絕對豐度12的 文件16_4中的小峰，未觀察到任何所述峰。在所述MTb文件中，文件13_4和14_6在m/z =85處具有絕對豐度分別為11和17的小峰。具有計算的標準物2- 丁酮的1. 0%相對豐 度的所述值與0. 25% 1. 0%間的相對豐度相對應，其不包含C14H240?？傊谫|(zhì)譜中沒有 有意義的證據(jù)以支持峰2作為C14H24O的鑒定。雖然注射所述化合物的標準物是最有說服力 的，但在NIST庫中為未提供所述化合物的CAS號，且不可能商品化。因此，上述實驗表明峰 2為2-丁酮。在質(zhì)譜數(shù)據(jù)中的最終關注區(qū)為脂質(zhì)培養(yǎng)基TIC中存在4. 6分鐘左右的小峰，然而 峰的總豐度不顯著。整體而言，在培養(yǎng)基中峰的平均持續(xù)時間為4. 644士0. 007 (% rsd = 0. 16% )，其與MTb樣品中2- 丁酮峰的平均值以95%可信度無顯著差異。所述數(shù)據(jù)提示 培養(yǎng)基峰也為2-丁酮。對于由于高色譜背景信號而反常的大于5500的峰，在培養(yǎng)基峰中 所見的絕對離子豐度值的范圍為1200 5500。相比之下，在MTb樣品中所述峰為5700 10200。因此，最高的培養(yǎng)基峰具有比最不豐的MTb峰更低的豐度。總體而言，培養(yǎng)基的平 均峰豐度為3400 士 1300，而MTb峰的平均峰豐度為8600 士 1900。所述兩組平均值以95%可 信度具有顯著差異，所以可推斷MTb樣品比僅培養(yǎng)基含更多的2- 丁酮。然后評估培養(yǎng)基峰的質(zhì)譜以確定其特性，并在表L中顯示所述結(jié)果。如反向匹配 的一半，所有與2-丁酮的正向匹配得分差。2-丁酮的匹配概率得分也差，而在所有類中培 養(yǎng)基峰得分有益為6，10-二甲基_(E，E)-5，9-十二碳二烯-2-酮。質(zhì)譜的評估顯示，峰錯 誤辨識的主要問題為在培養(yǎng)基質(zhì)譜中假峰的存在。除來自其他來源(柱，SPME等)的其他 反常，其包括在13_和14_文件中在m/z = 40和44處的峰。因為所述質(zhì)譜峰不強，在質(zhì)譜 中所述假峰重量不成比例，且降低了匹配的質(zhì)量。所述數(shù)據(jù)表明當2-丁酮在脂質(zhì)培養(yǎng)基中 出現(xiàn)時，在MTb中有所述化合物的更多再現(xiàn)性。表L 脂質(zhì)培養(yǎng)基的譜匹配 a = 2-丁酮的譜匹配值。b =在所述峰的最優(yōu)100個匹配中未列出出現(xiàn)的2-丁酮。。=所述化合物為6，10-二甲基_(E，E)-5，9_十二碳二烯_2_酮。2d.檢測3-戊酮作為樣品中MTb的指示化合物MTb峰3產(chǎn)生了有利為3-戊酮的NIST庫的比較。所述庫包含所述化合物的總共 四個條目主庫加三個重復，并在表M中總結(jié)匹配的結(jié)果。表M:MTb峰3(、= 5.6740.01》與3_戊酮的NIST庫匹配 表M顯示了七個質(zhì)譜產(chǎn)生了 3-戊酮的中至良的正向匹配，而所有的反向匹配為中 至優(yōu)。如往常一樣，由于質(zhì)譜中假峰的存在，反向匹配得分比正向匹配得分更高。獨特性 的概率匹配通常都差(即< 70% )，然而八個中的五個在60 70%的范圍，且一個幾乎為 80%。因此，所述結(jié)果表明峰3的特性為3-戊酮。然后與NIST庫譜比較質(zhì)譜相對豐度，然而四個庫條目有不同的譜。所有四個譜都 還有在m/z值< 39處發(fā)生的10個最強峰中的4個，其為在MTb質(zhì)譜中所測最小離子值。 毫無疑問的是，因為其為用于在匹配算法中確定化合物特性的譜特性，其導致了低質(zhì)量的 匹配。此外，MTb和NIST質(zhì)譜在m/z = 57和86處都有兩個大峰，并有相對豐度非常相當 (即1. 5 6. 5% )的七個額外峰。所述七個額外峰中，只有一個峰(m/z = 58)以最優(yōu)前 十的相對豐度出現(xiàn)在所有四個標準譜中。最后，文件13_4、6、9、10和14_4、6的MTb質(zhì)譜在 m/z = 40(氬氣)和m/z = 44 ( 二氧化碳)處有異常大的峰。所述文件的氬氣峰的相對豐 度值為47 89%，而15_5、7的僅 2. 5%。在13_和14_文件上獲得的文件的二氧化碳 峰為14 22%，而15th的為6 8%。無論使用何種策略，大的假峰產(chǎn)生更低的得分和概率匹配。在乙醇(Sigma-Aldrich，200proof)中制備約30ppmv 的 3-戊酮(Sigma-Aldrich， ReagentPlus, ^99%)溶液以確認峰3的特性為3-戊酮。選擇所述濃度以便標準物色譜 峰的總離子豐度與MTb樣品中所測量的大致匹配。使用SPME纖維一式三份地提取溶液的 液上空間，隨后使用雙檢測器GC-MS捕沖系統(tǒng)對其進行分析。相關的數(shù)據(jù)文件為25_4、5和 6，并在圖11中示TIC的相關部分。3-戊酮標準物的平均持續(xù)時間為5. 696士0. 006(%rsd =0.11% )，其與MTb文件的平均持續(xù)時間(s.e^io.oii)似乎保持良好的吻合。對所述 兩組平均值的標準偏差進行了 F檢驗，且它們以95%可信度無顯著差異。然而基于t檢驗 結(jié)果，標準物和MTb文件的平均持續(xù)時間以95%可信度有差異。疊加MTb和3-戊酮標準物的代表性TIC，并在圖12中顯示以理解持續(xù)時間上的差 異。在圖12中很顯然MTb 3-戊酮峰比標準物更窄，且有更大的總離子豐度。峰形(即高 度寬度比和峰對稱性)可影響峰值偏移的作為質(zhì)量中心的化合物的整體持續(xù)時間。在標準 物和MTb文件中的3-戊酮峰在平均持續(xù)時間上有約1.4秒的差異，其可由儀器的因素(如 流量上的小變化)輕易的造成。如果在這種情況下，預計在其他的色譜峰中由大致相同的 時間差造成的系統(tǒng)偏差是合理的。因為所述3-戊酮為相當純的標準物，在色譜圖中沒有許 多的額外峰用于比較(因為在3-戊酮色譜圖中乙醇峰為不成比例的大，不可使用所述峰)。 在約4. 9分鐘處的硅氧烷峰為僅有的用于比較的合理的峰并在圖12中將其進行標記。在圖12中，很顯然MTb文件的硅氧烷峰(八個MTb重復的平均值4.908分鐘 士0. Ol1)具有比在3-戊酮標準物色譜圖中硅氧烷峰(三個標準物重復的平均值4. 933分 鐘士0.01。)的持續(xù)時間更短的持續(xù)時間。所述兩組平均值以95%可信度具有顯著差異，且 兩組平均值間的時間差大致為1. 5秒。所述結(jié)果與在3-戊酮峰中觀察到的時間差是明顯 相當?shù)?，因此其提示所述差異是系統(tǒng)性的、因此根源于儀器?？傮w而言，持續(xù)時間上的差異 相當小，因此3-戊酮的持續(xù)時間表明MTb峰3的鑒定為3-戊酮。下一步比較庫、3-戊酮標準物和MTb重復物的質(zhì)譜，并在表N中顯示所述結(jié)果。伴 隨在m/z = 86的下一個最大豐度離子處的母離子峰(即無分段的3-戊酮的+1離子的m/ ζ值)，在所有情況下主峰為m/z = 57。有趣的是，對于四個庫條目，在m/z = 45未觀察到 峰，且在八個MTb重復物質(zhì)譜的六個中所述峰幾乎不可測量到。然而3-戊酮標準物每個在 大致11 %的所述值處都有峰。因為在NIST標準庫中其基本上無法測量，不清楚在標準物中 所述片段的來源是什么。具體而言，重復物2和3在它們的參照譜中有無可測量的峰，而在 主庫和重復物1庫條目的譜中可觀察到平凡峰。在所有情況下，所述峰不超過1 %的相對豐 度。因此，標準物的所述峰可為雜質(zhì)，且其在任何的MTb標準物條目中未觀察到。除MTb文 件13_6和14_6在m/z = 39處沒有峰之外，在合理地相當?shù)南鄬姸戎堤幊霈F(xiàn)所有其他剩 余峰。這與所述觀察即所述峰為通過質(zhì)譜儀測量的最低m/z值是一致的，且其有時不出現(xiàn)。 此外，所述峰相當小，且在四個庫重復的三個中缺無。因此，所述質(zhì)譜數(shù)據(jù)支持峰3的特性 為3-戊酮。表N 在NIST庫、標準物和MTb文件中的3_戊酮質(zhì)譜的相對離子豐度 NR =未對所述標準物進行報告；只報告了庫中前十大相對豐度值的片段匪=未對所述MTb重復物進行測量；這表示在m/z值處未出現(xiàn)峰。2e.檢測2-戊酮作為樣品中MTb的指示化合物MTb質(zhì)譜與NIST庫的比較未產(chǎn)生2-戊酮的強(即彡70%)概率匹配。另外，正向 和反向搜索結(jié)果通常產(chǎn)生與NIST庫譜的差匹配。八個重復物的質(zhì)譜通常產(chǎn)生2-甲基-N， N-二異丙基-丙酰胺的更好的概率匹配。在甲醇(Sigma，M1770-1L)中制備約20ppmv的 2-戊酮(Aldrich，HPLC級)標準溶液，以確定峰特性。選擇所述濃度，以產(chǎn)生與MTb樣品 測量的豐度大致相等的標準物的總離子豐度。使用SPME提取所述溶液的液上空間5分 鐘，然后在雙檢測器GC-MS捕沖系統(tǒng)上運行。所述2-戊酮標準物文件為12_7、8和9。在 圖13中示所得的所述標準物的TIC，且2-戊酮的平均持續(xù)時間為5. 786士0. 003 (% rsd = 0. 052% )。峰4的平均持續(xù)時間的結(jié)果的比較(5. 785士0. Ol2)顯示，2-戊酮標準物和MTb 樣品峰4的持續(xù)時間間以95%可信度無統(tǒng)計學顯著差異。所述結(jié)果支持鑒定峰4為2-戊 酮?；?-戊酮的沸點為101 105°C (Aldrich產(chǎn)品目錄)，且有86的制劑重量，而酰胺 有171的制劑重量，2-戊酮和酰胺共洗脫是極不可能的。
也將標準物2-戊酮質(zhì)譜與NIST庫的相比較。對于2-戊酮而言，除了主庫條目外， 有2-戊酮的至少三個重復條目，且其足夠不同以在與已知的2-戊酮比較時產(chǎn)生不同的得 分。因此已知譜的變化性不被認為是需關心的原因。對于標準物2-戊酮的三個重復，在表 0中示2-戊酮和2-甲基-N，N-二異丙基丙酰胺的庫匹配的譜。2-戊酮在NIST庫中的正 向和反向搜索都顯示了所述譜間的良匹配，然而反向搜索始終比正向搜索獲得更高的分。 因為每個標準質(zhì)譜包含假峰，可預期所述結(jié)果。當在庫中將標準物2-戊酮與酰胺質(zhì)譜相比 時，可觀察到相同的趨勢；其中搜索得分為微小至差。表0 :2_戊酮標準物的庫匹配 a = 2_ 戊酮b=酰胺然而，甚至當已知2-戊酮存在時，NIST庫概率匹配不能始終識別出具有所需可信 度的化合物(圖14)。標準物2-戊酮質(zhì)譜與2-甲基-N，N-二異丙基丙酰胺的比較(圖15) 顯示所述兩種化合物間的差相關，其可通過差的概率匹配反映出來。在圖15中很顯然因在 m/z值41、42、43、44、58、71、86和87觀察到的峰，所述2-戊酮的質(zhì)譜為2-甲基-N，N-二 異丙基丙酰胺的子集。這可解釋MTb峰4常被鑒定為酰胺而非酮的原因。因2-戊酮的質(zhì) 譜包含在酰胺的質(zhì)譜內(nèi)，合理預計其“獨特性得分”不會高。此外，預計在正向搜索中2-戊 酮得分差，但在反向搜索中更有利。進一步復雜化的質(zhì)譜鑒定為在八個MTb重復的六個中 氬氣和二氧化碳峰的存在。最后，各種MTb和2-戊酮標準樣品的質(zhì)譜的評估顯示了來自任何數(shù)量來源的額外 的假峰確實規(guī)則地出現(xiàn)。經(jīng)注射器的2-戊酮的直接注射產(chǎn)生了好于90%的概率匹配。所 述假峰不足夠普通(即可重復性)或足夠一致(即相同的m/z比)以提示在同一時間多于 一種的分析物洗脫。然而，基于在所述峰中的低離子豐度，任何異常的峰可對譜匹配具有有 害的影響。在圖15中譜的評估顯示在2-戊酮標準物中在m/z = 114處可觀察到較小的峰。 在相當?shù)南鄬ωS度的2-甲基-N，N-二異丙基丙酰胺中發(fā)現(xiàn)所述峰，并因此降低了匹配的質(zhì) 量。
如果MTb峰4為2-戊酮，無超過86的m/z峰，因為其為制劑的分子量。如圖15， 如果峰4為酰胺，在酰胺的母離子的m/z值100、114、128和171處可預期特征峰?；谒?述峰的相對豐度，應始終觀察到所述峰中的至少兩個。然而，所有八個MTb重復的評估顯示 在100、114或128處沒有峰。只有MTb文件13_9在m/z = 171處顯示了較小的峰(總離 子豐度為10)，且只有2-戊酮標準物文件12_7在114處顯示了較小的峰。因此，質(zhì)譜中特 性的缺無、更高重量的離子表明峰4不是2-甲基-N，N- 二異丙基丙酰胺。表P 在標準物和MTb文件中的2-戊酮質(zhì)譜的相對離子豐度 下一步，將MTb質(zhì)譜與標準物的相比較，并在表P中總結(jié)所述結(jié)果。以降序安排 2-戊酮的m/z值。很顯然酰胺的m/z值的相對強度不以相同的順序下降，其允許了區(qū)別MTb 樣品峰中的所述兩種化合物的一種機制，并進一步表明峰4為2-戊酮。2f.檢測甲氧,某苯(苯甲醚)作為樣品中MTb的指示化合物部分由于在TIC中的弱信號((4000總離子豐度)，在化合物鑒定中峰5存在多 種挑戰(zhàn)。五種庫參照化合物與TB峰有不同程度的匹配甲氧基苯(AKA苯甲醚；麗=108)、 7-脫氧-1-甘油-d-甘露-庚苯酰胼(MW = 300)、1-氨基-2-甲基吡啶氫氧化物(MW = 108)、α，d-gala-辛基苯酰胼(MW = 346)及甲基苯基碳酸(MW = 152)。質(zhì)譜的初步評估 提示所述化合物為甲氧基苯，并在表Q中總結(jié)NIST庫結(jié)果。表Q :MTb峰5(tr = 8. 87。士0. Ol3)與甲氧基苯的NIST庫匹配 除文件15_5和7外，TB質(zhì)譜的幾乎所有正向、反向和概率匹配都是差?；诘头?值強度、假峰的存在及其他的匹配質(zhì)譜的相當大量的庫條目，所述結(jié)果是不出人意料的。鑒定了從其他的庫化合物中區(qū)分甲氧基苯的特有質(zhì)譜特征?；诖瞬⒖紤]其巨大 的制劑重量，排除α，d-gala-辛基苯酰胼和7_脫氧甘油-d_甘露-庚苯酰胼作為可 能的匹配。最令人注意的是，對于這兩種苯酰胼化合物，m/z = 77和78的相對峰豐度分別 為約28%和15%。在MTb質(zhì)譜未觀察到此。同樣，對于所述苯酰胼，m/z = 92和93的相 對豐度值分別約為38% 40%和14 23%。在MTb質(zhì)譜未觀察到所述比率。甲基苯基碳酸的NIST庫條目表明在m/z = 65和108處的峰分別有100%和42% 的相對豐度。在MTb峰中，所述豐度為64%和100% (基本相反)。另外，甲基苯基碳酸的 母離子峰在m/z = 152處以約37%的相對豐度發(fā)生。在MTb質(zhì)譜中其將明顯可見，然而在 所述比率處八個重復物的五個未觀察到峰。在152處確實顯示峰的三個文件有13 17間 的絕對離子豐度值。使用m/z = 108的絕對離子豐度值和m/z = 152的估計的相對離子豐 度37%，在所述質(zhì)譜中所述峰應有90 200的絕對豐度。在MTb文件中的豐度值太低不足 以支持與甲基苯基碳酸的匹配。甲基苯基碳酸的最終特性為在m/z = 59處具有21%相對 豐度的峰的存在。在八個重復中的六個中完全無所述峰。不具有所述峰的譜有遠未達到預 期值的5. 3和9. 0%的相對豐度值。所述數(shù)據(jù)未為峰作為甲基苯基碳酸的特性提供有說服 力的支持。區(qū)分甲氧基苯和吡啶鹽的質(zhì)譜更具挑戰(zhàn)性，尤其根據(jù)兩種化合物都是芳香族的且 具有相同分子量的事實。因此，如在圖16中所見，兩種化合物以相當?shù)南鄬ωS度產(chǎn)生大部 分相同的離子碎片。在圖16中兩種質(zhì)譜間的主要、有用的差異為甲氧基苯在m/z = 39處峰的存在和 在m/z = 92和93處峰的相對豐度。對于吡啶鹽，所述峰的相對豐度值分別為60%和27%; 在14%處甲氧基苯值為m/z = 93，而在 5%處m/z = 92。MTb質(zhì)譜的評估顯示八個重復 的六個有在m/z = 39處具有28% (范圍13 40% )平均相對豐度和在參照譜中約20% 的峰。因為m/z = 39為由儀器測量的最低離子比率且在每個質(zhì)譜中不總出現(xiàn)(即通常χ 軸在m/z = 40，而非39處開始)，所述譜中的兩個不顯示所述峰。下一步，如果所述MTb峰 為所述鹽，m/z = 92應是m/z = 93峰的約2倍豐度。如果所述峰為吡啶鹽，MTb重復物的 m/z = 93的平均相對豐度為14% (范圍=7. 5 20% )，所以應沒有測量92的峰的困難。 其在任何的MTb質(zhì)譜中未被觀察到，其中在m/z = 92處八個重復的五個沒有峰，三個確實 有以2. 8% 5. 6%相對豐度的峰范圍。所述數(shù)據(jù)表明MTb峰5不是1-氨基-2-甲基吡啶 氫氧化物。
在甲醇(LC-MSChromasolv, Sigma-Aldrich)中制備約 30ppmv 濃度的甲氧基苯 (無水，99. 7%, Sigma-Aldrich)以驗證峰5的特性。所述溶液濃度產(chǎn)生了約18，000的總離 子濃度，其遠大于在MTb文件中所見的2000 4000范圍。在較低的范圍下，與MTb文件的 觀察一致，甲氧基苯標準物不產(chǎn)生與NIST庫的良匹配。所述數(shù)據(jù)文件為24_3、4和5，并在 圖17中示所得文件的TIC。甲氧基苯的平均持續(xù)時間為8.886士0.014(%1^(1 = 0. 15%)。 具有8. SliO. Ol3平均持續(xù)時間的所述結(jié)果可更有利地與峰5的比較，且兩組持續(xù)時間間 以95%可信度無統(tǒng)計學顯著差異。所述結(jié)果表明峰5為甲氧基苯。下一步將甲氧基苯的標準譜與NIST庫條目相比較，并在表R中總結(jié)所述結(jié)果。標 準物的正向和反向譜匹配是優(yōu)，而匹配概率是良。表R 甲氧基苯標準物的NIST庫條目匹配 然后將標準物的質(zhì)譜與MTb文件的相比較(見表S)，且兩組數(shù)據(jù)集間的相對豐度 值非常吻合。相對峰豐度顯示下面的趨勢108 > 78 ^ 65 > 39 > 77 ^ 51 ^ 79 ^ 93，因 此提供了額外的證據(jù)以支持所述峰的鑒定。表S 在標準物和MTb文件中甲氧基苯質(zhì)譜的相對離子豐度 在表S中，值得注意的是對于兩個MTb文件而言，在m/z = 39處未測量到峰。因 為所述值為通過所述方法測量的最低m/z，且在質(zhì)譜中通常不出現(xiàn)，其不是不常見的?；?所述數(shù)據(jù)，鑒定峰5為甲氧基苯(苯甲醚)。2g.檢測2-乙某P1酸甲酯(甲某2-乙某P1酸酯)作為樣品中MTb的指示化合物在表T中顯示甲基2-乙基己酸酯(MW= 158)的MTb峰6與NIST庫匹配。所有 的正向搜索和大部分的反向搜索獲得差的得分，而約一半的質(zhì)譜獲得中概率匹配分數(shù)。所 述庫包含所述化合物的三個總條目(主條目加兩個重復)。尤其值得注意的是，對于八個重 復的每一個，所述峰通常有最低總離子豐度4500)中的一個，因此在質(zhì)譜中的總信號強 度比所需的要更弱。表T :MTb峰6(tr = 12.536士0.02》與甲基2_乙基己酸酯的NIST庫匹配 庫質(zhì)譜的評估顯示了主m/z值的相對豐度值的下列順序102 87 > 57 > 41 > 55 > 43 101 130。如表U所示，MTb峰與所述值相當好的吻合，其支持峰6作為甲基 2-乙基己酸酯的鑒定。此外，沒有其他的化合物始終和/或接近地匹配所述質(zhì)譜。表U 在MTb文件中甲基2-乙基己酸酯質(zhì)譜的相對離子豐度 在所述研究的過程中確定甲基2-乙基己酸酯有手性中心。某些生物(如MTb)可 產(chǎn)生所述化合物的單獨手性形式，而非所述化合物的消旋混合物。因此，依賴于各種因素 (例如生物的來源、樣品中的各種生物、所述生物的代謝狀態(tài)和可選的培養(yǎng)條件)，所述化 合物的單獨手性形式的有無可指示樣品中MTb的有無。2h.檢測其他芳香族化合物收集樣品并進行如上通常所述的分析以鑒定指示樣品中MTb存在的其他揮發(fā)物， 其包括2-甲基丙酸甲酯(CAS :547-63-7)、2，4_ 二甲基-1-庚烯(CAS 19549-87-2)、甲基 異丁基酮(CAS 108-10-1)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(CAS 110-93-0)、二甲基亞砜(CAS 67-68-5)、二 甲基硫(CAS :75-18-3)、1_ 乙氧基-2-甲基丙燒(CAS :627-02_1)、1-乙氧 基-丁烷(CAS 628-81-9)、叔丁基乙醚(CAS :637_92_3)、異丁醇(CAS :78_83_1)和圖 22 中 的質(zhì)譜代表的芳香族化合物。在下文的實施例4中詳述圖22中用于獲得質(zhì)譜的具體分析 條件。實施例3 本實施例描述了用于使用從GC-MS分析和DMS分析所得的數(shù)據(jù)鑒定樣品中特定細 菌(例如金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大腸桿菌)的方法。因此，本實施例也描述了用 于床旁診斷化驗診斷工具產(chǎn)生數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)庫和方法以便于樣品中細菌的快速鑒定。微機 械化DMS裝置為床旁診斷化驗診斷工具的例子。DMS裝置是便攜的，且所述檢測方法能夠分 析物的低檢測限。具體而言，使用由GC-MS和DMS的同時分析以鑒定樣品中醫(yī)學重要的細菌(包括 金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大腸桿菌)。雙系統(tǒng)平臺允許在DMS中細菌VOC的光譜圖 樣與用GC-MS的各化合物結(jié)構的鑒定相關聯(lián)，和DMS數(shù)據(jù)庫的生成以允許基于僅DMS數(shù)據(jù) 的細菌鑒定。所述處理也導致了各特定細菌的生物標記物的多種VOC的發(fā)現(xiàn)。鑒定的金黃 色葡萄球菌生物標記物的利用能使鑒定在與其他醫(yī)學重要的細菌的混合培養(yǎng)物中其的存 在。所述系統(tǒng)代表有力的平臺，其中新型VOC的發(fā)現(xiàn)可適用于用DMS的檢測。快速鑒 定和形成醫(yī)學重要的細菌病原體的能力為所述平臺的一項應用，并可加強生命威脅感染的 醫(yī)療護理。3a.背景目前的用于鑒定醫(yī)學重要細菌的臨床實驗室方法依賴于較好建立的相對慢的微 生物技術，通常需要許多天用于物種形成。已很好的研究和開發(fā)不同類型細菌的獨特生物 化學途徑以用于細菌物種形成測試。這形成了臨床鑒定平臺(如API測試條(bioMerieux Vitek, Inc^Marcy-IEtoile，法國))的基礎，其常用于形成細菌分離物。用于形成細菌的更多最新技術很大程度上依賴于基于核酸的檢測方法，如聚合酶鏈式反應(PCR)，其為昂貴 的、需要有效的專業(yè)人員來執(zhí)行、通常限于在多重格式內(nèi)可檢測生物的類型，并有產(chǎn)生由核 酸污染所致的假陽性結(jié)果的危險。因此，有將基于傳統(tǒng)培養(yǎng)的技術的簡單性、特異性和廣泛 適用性與PCR的快速性和靈敏性結(jié)合的新技術的必要。由不同的細菌物種使用的不同組代謝途徑導致了一組獨有化合物的產(chǎn)生，其為它 們代謝的副產(chǎn)品。所述代謝副產(chǎn)品的子集，VOC為用于診斷檢測的強候選生物標記物。VOC 是具有低蒸汽壓和低水溶性的化合物?？赏ㄟ^各種技術(包括易被人嗅覺途徑輕易感覺到 的那些)檢測V0C，并代表醫(yī)學技術人員能通過它們的氣味鑒定細菌的基礎。然而，由于(1) 靈敏性和(2)使用關于質(zhì)量或質(zhì)量片段的光譜信息以確定分子結(jié)構，GC-MS保持檢測VOC的 黃金標準。不幸的是，在所述領域中或甚至在控制環(huán)境的外部(如先進的臨床實驗室)，目 前的GC-MS技術對于床旁診斷化驗的應用是不可行的。這尤其由于便攜性的相對缺乏、明 顯的功耗和先進的維修需求。所述DMS裝置為已顯示檢測選定的低至萬億分之幾的VOC的微機械化傳感器。然 而，與GC-MS相比，其為便攜和相對不昂貴的。先前的用DMS的研究已顯示了識別化合物、 使用圖樣識別區(qū)分細菌的種類和檢測有高可靠性的化學或生物試劑的能力。然而，基于可 以痕量檢測到V0C，有假陽性檢測的明顯憂慮。此外，基于當比較來自不同細菌和背景分析 物的DMS標記時足夠特異性的缺乏，識別共用的DMS標記的圖樣識別算法難以適用于臨床 診斷。在各種實施方式中，通過研制和開發(fā)同時用DMS和GC-MS鑒定化合物的雙檢測系 統(tǒng)，本發(fā)明成功使用了 DMS以鑒定樣品中的特定細菌。因此，通過GC-MS可快速鑒定為細菌 或其他過程的生物標記物的V0C，并可同時確定相應的DMS譜圖樣且儲存在庫中以用于隨 后的參照。一旦在DMS數(shù)據(jù)庫中收集所述鑒定，然后只通過DMS將DMS譜圖樣用于細菌形 成。隨后的方案描述了用于確定生物標記物的雙檢測系統(tǒng)的開發(fā)，并顯示了使用只由床旁 診斷化驗診斷工具所得的數(shù)據(jù)，所述平臺如何被用于檢測包含多種不同細菌物種的復合臨 床樣品中特定細菌和/或相關細菌株的存在、量和/或狀態(tài)(例如存活、生長等)。此外，使 用下面的方案以鑒定和表征特定細菌的新型標記物。3b.方法與材料3b 1.儀器使用配備有Rtx _200MS三氟丙基甲基聚硅氧烷柱(30mX0. 32mm I.D.，1μπι厚 WII ；Restek Corporation ；Bellefonte, PA)白勺 Agilent 6890N(Agilent Technologies ； Palo Alto, CA)氣相色譜儀完成VOC的色譜分離。通過標準溶液的使用每天監(jiān)測多次色譜 性能的一致性。以2分鐘清洗延遲的無分流模式在250°C的固定溫度下操作沿SPME注射 套管(0. 75mm I. D. ； Supe Ico，Bellefonte，PA)排列的 GC 注射口。用 _125°C 的液氮低溫冷 卻 GC 柱(Cryogenic EnrichmentSystem CTE ；GERSTEL ；Baltimore, MD)的前端 2 分鐘，而 在50°C維持所述GC爐。隨后以20°C /秒提高低溫冷阱至240°C，而最初以10°C /分鐘提 高爐至67°C。經(jīng)6分鐘的保持后，以10°C /分鐘升高爐溫度至100°C，然后以20°C /分鐘 升高至230°C的最終溫度，其被保持3分鐘。經(jīng)0.25mm I. D.禾P0.5mm I. D 的保護柱使用 Press-Tight Y-connector (Restek Corporation ；Bellefonte, PA)將柱洗脫物引至 Agilent 5975 四極質(zhì)譜儀(AgilentTechnologies ；Palo Alto, CA)和微分遷移光譜儀(SVAC-V 型，Sionex Corporation ； Bedford,MA)。不管兩個檢測器操作壓上的不同，選擇不同的保護柱以確保洗脫物的進一步 分開。加熱DMS傳感器的傳輸線至180°C以防止沿GC爐和DMS傳感器間區(qū)段的冷凝。以 5. 25循環(huán)/秒的速度掃描39 300m/z值的電子碰撞電離模式操作質(zhì)譜儀。每天都使用 PFTBA(AglientTechnologies ；Palo Alto, CA)在質(zhì)譜儀上進行調(diào)節(jié)。以 0. 65 掃描 / 秒通 過從-26V至+8V的補償電壓的掃描來進行DMS分析，而色散電壓維持在1100V，并在85°C 設置傳感器溫度。以400mL/分鐘的流量使用氮作為漂移氣。3b2.細菌培養(yǎng)物的制備在胰酶解大豆酪蛋白瓊脂5%羊血平板(Remel,Lenexa，KS)上37°C過夜培養(yǎng)大腸 桿菌的ATCC株(ATCC#25924)、金黃色葡萄球菌的ATCC株(ATCC#25923新青霉素敏感型) 和肺炎克雷伯菌的ATCC株(ATCC#13883)。在補充1 %葡萄糖的腸發(fā)酵基礎培養(yǎng)基(EFM， Becton Dickinson, Sparks, MD)中懸浮菌落，并將其稀釋以獲得指定光密度(OD6tltl = 0. 1) 的液體培養(yǎng)物。將其在37°C振蕩(200rpm)培養(yǎng)直到細菌生長達到中對數(shù)期(約2小時)。3b3.提取過稈在40°C爐中預平衡固相微萃取纖維/支座集合至提取溫度。以2mL的等分物將所 述培養(yǎng)物分配至IOmL SPME液上空間瓶(Supelcolnc. ；Bellafonte, PA)，并用具有隔的螺 帽密封，以制備各細菌的六個重復樣品。通過吸取2mL的純EFM培養(yǎng)基進六個液上空間 瓶的每個來制備對照樣品?；旌系臉悠酚捎邢嗤饷芏?0D_ = 0. 3)的等量細菌組成。在 軌道搖床(中等速度)上室溫搖動所述瓶15 20分鐘，然后將其取出并放在用戶定制的 瓶支架上，所述瓶支架被設計為支持在提取期間的纖維集合。使SPME纖維去蓋并穿透各瓶 的隔。一旦在40°C爐中安置所述支架，所述纖維接觸培養(yǎng)物/對照的液上空間1小時。在 提取期的最后階段，將所述纖維收回、從瓶中移出，并蓋上蓋。在2 8°C儲存纖維集合，直 到通過GC/MS和DMS分析。使用組裝于TuffSyringe 支架(Field Forensics ；St. Petersburg, FL)的 50/30 μ m 二乙烯基苯 /Carboxen/ 聚 二甲基硅氧烷(DVB/Carboxen/PDMS) SPME 纖維 (Supelco Inc. ；Bellefonte，PA)進行液上空間的提取，以便于操作。用用戶定制的PTFE 尖安置纖維針，以限制運輸和儲存期間的污染。依據(jù)制造商的建議，初次使用前在250°C 270°C時使所述纖維適于GC注射口 1小時，以防止后遺作用。3c.結(jié)果3d.雙系統(tǒng)的裝備依據(jù)圖IB中的流程圖實施雙檢測系統(tǒng)，以在確定DMS特定光譜圖樣時便于細菌特 異性VOC的快速確定。在GC柱的近端使用冷凍調(diào)焦裝配以便于復合混合物的快速鑒定。這 能使其有收集的VOC的更好分辨率?；谒瞿芰捎眠x擇的30米Restek柱裝備氣相色 譜儀器以分離V0C。用Y連接器分開柱的末端，以同時轉(zhuǎn)移柱洗脫物至DMS和MS。當在大 氣壓下運行所述DMS時，將較窄的ID保護柱用于轉(zhuǎn)移所述洗脫物至MS，以減弱來自MS的真 空拉力。測量流量以確認所述分流可均勻的分布洗脫物至兩個傳感器平臺。加熱至DMS的 傳輸線，以確保樣品洗脫液中不發(fā)生冷凝。在樣品導入期間實行MS和DMS的同時起動以確 保在MS和DMS軟件的收集參數(shù)間同步化啟動時間。盡管由于在傳輸線長度上的差異而發(fā)生了輕微的變化，導入的分析物的持續(xù)時間是大約相同的。兩個傳感器輸出間持續(xù)時間上的差異總是低于5%，因此能確定相應的DMS 峰禾口 MS峰。3c2.提取參數(shù)的優(yōu)化一旦建立了雙檢測平臺的參數(shù)，與SPME聯(lián)合使用系統(tǒng)，以鑒定細菌特異揮發(fā)性有 機化合物。因為有許多類型的SPME涂層，測試許多類型以鑒定優(yōu)化的涂層。事先鑒定三相 纖維以能提取最廣泛范圍的VOC(包括極性、非極性和半揮發(fā)性化合物)。當與其他的SPME 涂層比較時，測試通過顯示所述纖維有更大量的提取的不同化合物來證明這一點。例如，與 200的PDMS/DVB纖維相比，所述PDMS/DVB/Carboxen纖維有平均為350的特有揮發(fā)物。對 提取溫度和時間進行了進一步的優(yōu)化，其顯示在37°C的1小時的提取產(chǎn)生了與更高溫度和 更長提取時間約相同數(shù)量的峰。甚至盡管高于70°C的溫度也可提高化合物的揮發(fā)性，但因 為其可破壞細菌從而產(chǎn)生與穩(wěn)健的新陳代謝無關的V0C，并未這樣操作。3c3.細菌牛物標記物的鑒定一旦優(yōu)化了樣品制備和儀器參數(shù)，用雙GC-MS/DMS系統(tǒng)進行了細菌生物標記物的 鑒定。在有葡萄糖碳源的腸發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)醫(yī)學重要細菌。制備每個細菌的六個重 復來控制樣品間的變化并獲得足夠數(shù)量的樣品以用于準確豐度的計算。由菌落培養(yǎng)三種不 同物種的醫(yī)學重要細菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌)至0. 6的0D_以使 其在對數(shù)生長期。用培養(yǎng)基對照進行所有的實驗。此外，在工作空間中也利用了空白纖維 以控制可能污染纖維的環(huán)境來源的V0C。然后使用有隨機進入?yún)^(qū)域的樣品的GC-MS和DMS 儀器提取和分析VOC以避免混淆錯誤。分析細菌培養(yǎng)物中存在但僅培養(yǎng)基或空氣對照中不 存在的特有化合物的輸出。圖18A和18B分別示三種不同細菌和對照的例示DMS及DMS和 GC-MS的例示色譜輸出。在所述圖中，以圓圈(圖18A)或通過箭頭(圖18B)顯示指示代 表性細菌的例示VOC峰。依賴于圍繞或疊加候選化合物信號的噪音或其他信號，DMS數(shù)據(jù) (圖18A)和GC-MS數(shù)據(jù)(圖18B)輸出的比較顯示樣品中特定細菌的指示峰在一個分析中 對比在其他的分析中更明顯。因此，在各種實施方式中，可通過僅一種分析技術(如DMS或 GC-MS)或多于一種分析技術檢測樣品中特定細菌(例如MTb、Staph、Kleb或E. coli)的指 示 V0C。一旦使用匹配統(tǒng)計及正向和反向分析(類似于先前描述的實施例的方法)由NIST 確定候選化合物，排序候選標準物，并在相同的條件下通過運行所述標準物來確認它們的 特性。表V列出了在鑒定中有中等或高可信性的三種不同類型細菌的例示揮發(fā)性生物標記 物。表V 特定細菌的例示VOC-生物標記物 3c4.復合混合物實驗對于復合混合物(如痰或血液)中特定細菌的檢測，重要的是顯示了從可能污染 樣品的不同細菌中檢測特定細菌的能力。例如，痰樣品通常可被口腔微生物叢(如草綠色 鏈球菌(Sti^ptococcis viridans)、非致病奈瑟菌(Neisseria)和各種厭氧菌)污染(見， 例如 Manual ofClinical Microbiology, 9th Edition)。為了顯示特定細菌的 VOC 和 / 或 VOC的組合能鑒定在細菌混合物中的細菌，制備有或無需要在臨床環(huán)境中快速鑒定的攻擊 性病原體_金黃色葡萄球菌的含肺炎克雷伯菌和大腸桿菌的等量混合物的培養(yǎng)物，以優(yōu)化 患者結(jié)果。圖19A和19B分別示(i)大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的混合物、(ii)金黃色葡萄 球菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的混合物、(iii)僅金黃色葡萄球菌和(iv)培養(yǎng)基對照的 例示DMS及DMS和GC-MS的例示色譜輸出。在所述圖中，以圓圈(圖19A)或通過箭頭(圖 19B)顯示例示VOC峰。所述混合物的分析顯示甚至通過生物標記物特異性DMS數(shù)據(jù)(見圖 19A和19B，及表W)的視查，可從大腸桿菌和肺炎克雷伯菌中區(qū)分出金黃色葡萄球菌。隨后 使用DMS數(shù)據(jù)區(qū)分含金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)物的多種算法的準確性分析顯示100%的準確 性，其提示使用便攜式DMS傳感器所述生物標記物能直接在臨床分離物中進行金黃色葡萄球菌的鑒定。表W 復合混合物中細菌的檢測 具體而言，可重疊合在復合樣品中檢測到的VOC以鑒定樣品中的特定細菌。如在 表X中所示，在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的復合混合物中，通過檢測樣品 中的2，3- 丁二酮、3-羥基-2- 丁酮和/或苯乙醛來鑒定出金黃色葡萄球菌。通過檢測樣品 中的2-庚酮和/或2-壬酮鑒定出肺炎克雷伯菌。簡言之，可確定復合樣品中無特定細菌。 例如，樣品中無甲硫醇表明所述樣品中無大腸桿菌和肺炎克雷伯菌。在圖20和21中顯示了 示大腸桿菌特異性、肺炎克雷伯菌特異性和金黃色葡萄球菌特異性VOC的GC-MS色譜的例 示區(qū)段。具體而言，依賴于樣品中的其他生物，對大腸桿菌(或肺炎克雷伯菌)甲硫醇是特 異性的；對肺炎克雷伯菌2-庚酮或2-壬酮是特異性的；對金黃色葡萄球菌3-羥基-2- 丁 酮、苯乙醛或2，3_ 丁二酮是特異性的。此外，樣品中無所述化合物可指示樣品中無相應細 菌。表X 復合樣品中的細菌特異性VOC Y =可檢測到的；ND =未檢測到的3d.討論3dl.揮發(fā)件牛物標記物方法所述實驗部分描述了用于細菌VOC生物標記物鑒定的雙檢測系統(tǒng)的建立和應用。 因為與需要核酸或蛋白的分離和鑒定的傳統(tǒng)方法相比，氣體(例如樣品中的液上空間氣體)的檢測需要少得多的樣品處理時間和專業(yè)知識，VOC為有力的診斷生物標記物。然而， 因為VOC通常以痕量(萬億分之幾及更低)存在，有污染和/或錯誤鑒定的潛在性。因此， 尤其對于復合樣品技術的應用，只使用沒有化合物結(jié)構的之前、同時和/或隨后鑒定的圖 樣識別算法可引入錯誤，尤其對復合樣品的技術的應用中。為了解決所述問題，可用GC-MS 同時鑒定用DMS傳感器檢測到的化合物，以確定化合物的特性，并產(chǎn)生可被參照的DMS床旁 診斷化驗裝置的數(shù)據(jù)庫，以鑒定只使用DMS床旁診斷化驗裝置的隨后的樣品。床旁診斷化 驗裝置的能力在于便攜性、準確性和速度。使用雙檢測平臺以建立床旁診斷化驗裝置的數(shù) 據(jù)庫允許了使用的床旁診斷化驗形式并在臨床和/或野外環(huán)境中直接給出結(jié)果。3d2.應用，包括體外診斷、呼吸分析和環(huán)境監(jiān)控上述數(shù)據(jù)顯示了 DMS系統(tǒng)的能力以鑒定醫(yī)學重要細菌(金黃色葡萄球菌)的生物 標記物。此外，使用所述生物標記物以高準確性的鑒定多種細菌混合物中金黃色葡萄球菌 的存在。這顯示了使用床旁診斷化驗裝置鑒定混合樣品中細菌的能力。因此，如果檢測限是 低的，且從背景揮發(fā)物中區(qū)分VOC的能力為足夠的，所述技術能進行各種來源(例如血液、 痰、土壤、水、工業(yè)產(chǎn)品和/或工業(yè)廢物流)中細菌的快速物種確定。例如，將本發(fā)明的實施 方式用于肺部感染的呼吸分析。已知金黃色葡萄球菌為在醫(yī)院獲得性或呼吸機有關的肺炎 中涉及的重要病原體。如果能檢測所述細菌的揮發(fā)性生物標記物的存在或增多，然后早期 干預可拯救生命，且節(jié)省與所述感染和污染相關的大量醫(yī)療費用?？赏ㄟ^本文所述方法進行模擬臨床樣本中細菌的揮發(fā)性生物標記物的進一步表 征和細菌標記物庫的驗證。因為所述DMS裝置的便攜性，在不需要中央微生物實驗室的情 況下，所述檢測平臺的野外應用是可行的。例如，小診所或老人護理站可使用本文所述方法 診斷細菌特異性肺炎。此外，因為臨床醫(yī)生可開發(fā)和使用床旁診斷化驗數(shù)據(jù)庫以檢測宿主 和病原特異性VOC的廣泛種類，對樣本或呼吸樣品的DMS生物標記物分析的應用能使平臺 同時檢測宿主疾病進程。實施例4 本實施例顯示某些VOC始終與在不同類型培養(yǎng)基中的特定細菌有關。此外，本實 施例顯示在某些情況下，細菌VOC表達可依賴于培養(yǎng)基的組成。所述方法對用于檢測和/ 或定量樣品中細菌及用于鑒定培養(yǎng)基特異性的VOC和非培養(yǎng)基特異性的VOC的改良方法是 有用的。4. 1 培養(yǎng)在均用10% OADC富集物補充的Middlebrook 7H10瓊脂或7H9肉湯中維持結(jié)核 分枝桿菌株H37Rv。以4000rpm沉淀所述細胞5分鐘，用磷酸鹽緩沖液洗滌，并在包含棕櫚 酸(0. w/v)、甘油(0. )、膽固醇(0.01% )或丙酸鈉(0. 10% )的最小培養(yǎng)基 (0. 5g/L 天冬酰胺、lg/L KH2PO4,2. 5g/L Na2HPO4、50mg/L 枸櫞酸鐵銨、0. 5g/LMgS04 · 7H20、 0. 5mg/L CaCl2,0. lmg/L ZnSO4)中重懸。以ImL的等分將所得的培養(yǎng)物分配至液上空間瓶 以建立五或六個各重復。通過吸取純培養(yǎng)基進入瓶中產(chǎn)生未經(jīng)接種的對照培養(yǎng)物。在37°C 過夜培養(yǎng)全部樣品且使其在37°C經(jīng)受30分鐘的SPME液上空間提取。4. 2 樣品分析使用配備有Rtx _200MS三氟丙基甲基聚硅氧烷柱(30mX0. 32mm I.D.，1μπι厚 WII ；Restek Corporation ；Bellefonte, PA)白勺 Agilent 6890N(Agilent Technologies ；Palo Alto，CA)氣相色譜儀完成色譜分離。用 Merlin Microseal (Supelco Inc.； Bellefonte, PA)配置 GC 注射 口，并沿 0. 75mm I. D. SPME 注射套管(Supelco Inc.)排列 GC注射口。用4. 75psig的固定操作壓將所述輸入部設置在270°C (DVB/Carboxen/PDMS纖 維)或300°C (Carboxen/PDMS纖維)的溫度；在分析物脫附(2分鐘)期間以無分流模式 運行，隨后以分流模式(20mL/分鐘分流)運行GC程序的剩余部分。始終維持2. OmL/分鐘 的柱流量。使用經(jīng)SGT三重濾器(Restek Corp.)凈化的瓶裝氦氣(99. 99%純度)作為載 氣。在脫附期間用的液氮低溫冷卻GC柱(Cryogenic Enrichment System CTE ；GERSTEL ； Baltimore, MD)的近端至_125°C，然后經(jīng)2分鐘的維持從20°C /秒提高至240°C。主要的 爐溫程序如下50°C的初始溫度，保持2分鐘后以10°C /分鐘處提高至67°C，保持6分鐘 后，以10°C /分鐘升高至100°C，然后以20°C /分鐘升高至230°C并保持3分鐘。分另Ij經(jīng) 0. 25mm I. D.和 0. 5mm I. D 的保護柱使用 Press- Tight Y-connector (Restek Corp.)以同時將GC柱洗脫物引至Agilent 5975四極質(zhì)譜 儀(Agilent Technologies ；Palo Alto, CA)和微分遷移光譜儀(SVAC-V 型，Sionex Corporation ；Bedf0rd，MA)。選擇所述保護柱以補償在檢測器操作壓上的巨大差異(DMS單 元在大氣壓下運行而MS檢測器在約5X 107torr處工作)。經(jīng)驗的流量測量確認可均勻分 配柱洗脫物至兩個傳感器平臺。使用彈性加熱帶和調(diào)壓變壓器加熱DMS的傳輸線至180°C 以防止冷凝。液氮充當DMS偏流氣，其具有400mL/分鐘的流速。隨著以1.28秒/掃描的 速度掃描從-26V至+8V的補償電壓，進行DMS數(shù)據(jù)收集。在1100V維持DMS色散電壓，并 在85°C操作63Ni源。以5. 25循環(huán)/秒的速度用在39 300m/z范圍內(nèi)的全掃描模式記錄 MS譜。在分析物脫附的起始處同時引發(fā)MS和DMS數(shù)據(jù)收集以確保與時域的同步化。4. 3 不同樣品培養(yǎng)基中細菌VOC表汰在一組實驗中，樣品培養(yǎng)基各包含一種不同脂質(zhì)-類型的碳源，即膽固醇、棕櫚 酸或丙酸鈉。在每個培養(yǎng)基中培養(yǎng)MTb，并搖動所述細胞以提高細胞對氧氣的利用能力。使 用上文所述方法檢測提取的V0C。在表Y中顯示所得數(shù)據(jù)。在三個培養(yǎng)基類型的每一個都 可檢測甲基-2-乙基己酸酯和具有圖22所示的MS譜的額外的芳香族化合物。如圖23所 示，在培養(yǎng)基中未觀察到具有圖22中所示的MS譜的芳香族化合物，也未在相同的條件下制 備的恥垢培養(yǎng)物中觀察到。具體而言，使用上述的分析方法圖23顯示了具有圖22中所示 的MS譜的、具有約18. 44分鐘持續(xù)時間的芳香族化合物的峰。所述峰在所述Mtb樣品中存 在，但在樣品對照或恥垢樣品中不存在。所述實驗顯示某些VOC (如甲基-2-乙基己酸酯和具有圖22中所示的MS譜的額外 的芳香族化合物)與不同培養(yǎng)基中的特定細菌有關。另外，某些V0C(如丙酸甲酯和3-戊 酮)與在單獨培養(yǎng)基中的細菌有關。(即在培養(yǎng)基中存在丙酸鹽時存在)表Y 在三種不同培養(yǎng)基脂質(zhì)上搖動的MTb培養(yǎng)物 *=未確定總體而言，由所述實驗所得的VOC數(shù)據(jù)顯示了在有基于丙酸鹽的培養(yǎng)基的MTb培 養(yǎng)物中可檢測到特定VOC (即丙酸甲酯、3-戊酮、甲基-2-己酸乙酯和具有圖22中所示譜圖 樣的額外的芳香族化合物)。用振蕩選擇膽固醇、棕櫚酸鹽和丙酸鹽的特定培養(yǎng)基源，以模擬身體細胞內(nèi)隱蔽的典型MTb細菌的細胞內(nèi)環(huán)境。因此，除了顯示不管改變培養(yǎng)基和/或 來源條件，某些VOC可始終鑒定特定細菌之外，可在從身體(例如從個體的呼吸)直接獲得 的樣品的VOC數(shù)據(jù)庫中使用所述數(shù)據(jù)。4. 4 不同濃度丙酸鹽中MTb VOC表汰在另一組實驗中，用含濃度0. 10%的丙酸鈉的培養(yǎng)基培養(yǎng)MTb。使用上述的 方法檢測提取的V0C。提取的某些VOC (丙酸甲酯、3-戊酮、2-甲基丙酸甲酯和2-乙基己酸 甲酯)量依賴于培養(yǎng)基中的丙酸鹽濃度。在圖24A和24B中描述了培養(yǎng)基濃度對丙酸甲酯 的表達的影響。4. 5 培養(yǎng)干不同鉬合脂類中的MTb VOC表汰在另一個實驗中，在含有一種或多種碳源(即丙酸鹽(0. 3% )、甘油(0. )和 /或膽固醇(0.01%))的培養(yǎng)基的組合上培養(yǎng)MTb。使用上述方法檢測提取的V0C。提取 的某些VOC(丙酸甲酯、3-戊酮、2-甲基丙酸甲酯和2-乙基己酸甲酯)量依賴于培養(yǎng)基的 成分。在一種情況下，如圖25中的GC-MS總離子色譜所示，在含丙酸鹽和甘油或丙酸和膽 固醇的培養(yǎng)基中極大的提高了由MTb表達的丙酸甲酯量。實施例5 所述實驗顯示可使用一種或多種VOC以鑒定樣品中特定細菌的狀態(tài)(例如存活、 生長等)。特別的是，MTb培養(yǎng)物接受了抗生素的處理，且可檢測到所述V0C。在表Z中顯 示所得結(jié)果。表Z 接觸抗生素后的MTb VOC 表AA中的結(jié)果顯示經(jīng)VOC檢測可鑒定MTb的有效抗生素處理。援引并入本文將本文涉及的每個出版物、專利文件和其他參考文獻的整個公開內(nèi)容通過引 用整體并入本文以用于通過弓I用并入單獨指定每個個體來源的相同程度的所有目的。等同發(fā)明
在未背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，可以其他的具體形式實施本發(fā)明。 因此要以所有的說明性方面考慮上述的實施方式而非限制在本文所述的發(fā)明上。因此通過 附加的權利要求而非通過上述的說明指明本發(fā)明的范圍，并希望等量權利要求的含義和范 圍內(nèi)的所有變化被包含在其中。權利要求為
權利要求
用于鑒定樣品中結(jié)核分枝桿菌細菌的方法，所述方法包括a.收集疑似包含結(jié)核分枝桿菌細菌的樣品；及b.檢測一種或多種揮發(fā)性有機化合物，●所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物指示■所述樣品中所述結(jié)核分枝桿菌細菌的存在、或者■對所述樣品中所述結(jié)核分枝桿菌細菌的治療或抗性的應答，●所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物選自甲氧基苯(苯甲醚)、2 丁酮、2 乙基己酸甲酯、手性形式的2 乙基己酸甲酯、丙酸甲酯、2 戊酮、3 戊酮、2，4 二甲基 1 庚烯、甲基異丁基酮、6 甲基 5 庚烯 2 酮、二甲基亞砜、二甲基硫、2 甲基丙酸甲酯、1 乙氧基 2 甲基丙烷、1 乙氧基丁烷、叔丁基乙醚、異丁醇和圖22中的質(zhì)譜代表的芳香族化合物。
2.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含甲氧基苯(苯甲 醚)。
3.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含2-丁酮。
4.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含2-乙基己酸甲酯。
5.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含丙酸甲酯。
6.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含2-戊酮。
7.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含3-戊酮。
8.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含2，4-二甲基-1-庚火布。
9.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含甲基異丁基酮。
10.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含6-甲基-5-庚 烯-2-酮。
11.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含二甲基亞砜。
12.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含二甲基硫。
13.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含2-甲基丙酸甲酯。
14.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含1-乙氧基-2-甲基丙燒。
15.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含1-乙氧基丁烷。
16.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含叔丁基乙醚。
17.權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含異丁醇。
18 .權利要求1的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物包含圖22中的質(zhì)譜代 表的芳香族化合物。
19.權利要求1的方法，其中兩種或多種揮發(fā)性有機化合物的組合指示所述樣品中結(jié) 核分枝桿菌的存在、或?qū)λ鰳悠分兴鼋Y(jié)核分枝桿菌的治療或抗性的應答。
20.權利要求1的方法，其中所述樣品經(jīng)歷用于處理結(jié)核分枝桿菌的候選治療。
21.權利要求1的方法，其中所述樣品包含來自個體的呼出氣。
22.權利要求1的方法，其中所述樣品選自痰、血液、尿液、胸膜液和胸膜的活體檢查 組織。
23.權利要求1的方法，其中一種或多種揮發(fā)性有機化合物的量被檢測。
24.權利要求1的方法，其中所述檢測使用便攜式裝置進行。
25.權利要求1的方法，其中所述檢測使用微分遷移率光譜儀進行。
26.鑒定樣品中結(jié)核分枝桿菌細菌的裝置，所述裝置包含a.接受疑似包含結(jié)核分枝桿菌細菌的樣品的輸入部；和b.用于檢測一種或多種揮發(fā)性有機化合物的工具， 所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物指示■所述樣品中所述結(jié)核分枝桿菌細菌的存在、或者 ■對所述樣品中所述結(jié)核分枝桿菌細菌的治療或抗性的應答， 所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物選自甲氧基苯(苯甲醚)、2_ 丁酮、2-乙基己 酸甲酯、手性形式的2-乙基己酸甲酯、丙酸甲酯、2-戊酮、3-戊酮、2，4_ 二甲基-1-庚烯、 甲基異丁基酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、二甲基亞砜、二甲基硫、2-甲基丙酸甲酯、1-乙氧 基-2-甲基丙烷、1-乙氧基丁烷、叔丁基乙醚、異丁醇和圖22中的質(zhì)譜代表的芳香族化合 物。
27.用于鑒定樣品中結(jié)核分枝桿菌細菌的方法，所述方法包括a.收集疑似包含結(jié)核分枝桿菌細菌的樣品；b.使用包含丙酸鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)所述樣品；及c.檢測一種或多種揮發(fā)性有機化合物， 所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物與包含丙酸鹽的培養(yǎng)基上的結(jié)核分枝桿菌代謝 有關，且 所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物指示■所培養(yǎng)樣品中所述結(jié)核分枝桿菌細菌的存在、或者■對所培養(yǎng)樣品中所述結(jié)核分枝桿菌細菌的治療或抗性的應答。
全文摘要
在各種實施方式中，本發(fā)明涉及用于鑒定樣品中特定細菌存在的方法。所述方法包括收集包括或已與特定細菌接觸的樣品，及在樣品中檢測指示細菌存在的至少一種揮發(fā)性有機化合物。
文檔編號C12Q1/04GK101918583SQ200880117761
公開日2010年12月15日 申請日期2008年10月17日 優(yōu)先權日2007年10月19日
發(fā)明者J·M·特雷韋霍, P·瑞爾登, S·霍尼格曼 申請人:查爾斯斯塔克德雷珀實驗室公司