專(zhuān)利名稱(chēng)：：具有纖維二糖水解酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。相關(guān)技術(shù)描述纖維素是一種通過(guò)β-1，4_鍵共價(jià)結(jié)合的簡(jiǎn)單糖類(lèi)葡萄糖的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解β-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機(jī)位置消化纖維素聚合物，使其對(duì)纖維二糖水解酶的攻擊敞開(kāi)。纖維二糖水解酶從纖維素聚合物的末端順序釋放纖維二糖分子。纖維二糖是水溶性β-1，4-連接的葡萄糖二聚體。β-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將纖維素原料轉(zhuǎn)化成乙醇具有以下優(yōu)勢(shì)大量原料現(xiàn)成可用，避免焚燒或填埋材料的合意性，和乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認(rèn)為是用于乙醇產(chǎn)生的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，葡萄糖將容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。WO2004/056981公開(kāi)了來(lái)自嗜熱毛殼(Chaetomiumthermophilum)和嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)的纖維二糖水解酶。Gusakov等，2007，BiotechnologyBioengineering97:1028_1038描述了分離自Chrysosporiumlucknowense的纖維二糖水解酶。本發(fā)明涉及具有纖維二糖水解酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及選自下組的具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%同一性的氨基酸序列；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；和(d)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽。本發(fā)明還涉及選自下組的分離的多核苷酸，其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽(a)多核苷酸，其編碼包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)多核苷酸，其在至少高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多核苷酸，其包含與SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；和(d)多核苷酸，其編碼變體，該變體包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體、重組宿主細(xì)胞，和產(chǎn)生具有纖維二糖水解酶活性的多肽的方法。本發(fā)明還涉及抑制多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，包括向所述細(xì)胞施用或在所述細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本發(fā)明的多核苷酸的亞序列。本發(fā)明還涉及這樣的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任選地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。本發(fā)明還涉及在洗滌劑和在將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖和多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)化中使用所述具有纖維二糖水解酶(活性)的多肽。本發(fā)明還涉及包含分離的多核苷酸的植物，所述多核苷酸編碼這樣的具有纖維二糖水解酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這樣的具有纖維二糖水解酶(活性)的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物部分，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物部分包含編碼這樣的具有纖維二糖水解酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及包含編碼蛋白質(zhì)的基因的核酸構(gòu)建體，其中所述基因與編碼信號(hào)肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號(hào)肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1-17或由SEQIDNO2的氨基酸1-17組成，其中所述基因?qū)τ谒龊塑账嵝蛄惺峭庠吹?。附圖簡(jiǎn)述圖IA和IB顯示嗜熱毀絲霉CBS202.75纖維二糖水解酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO1和2)。圖2顯示pSMail80的限制圖譜。圖3顯示pSMail82的限制圖譜。定義纖維二糖水解酶活性術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶活性”在本文中定義為1，4-D_葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)活性，其催化纖維素、纖維四糖(cellotetriose)或任何含有β_1，4-連接的葡萄糖的聚合物中l(wèi)，4-i3-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)由Lever等，1972,Anal.Biochem.47=273-279；vanTilbeurgh等，1982，F(xiàn)EBSLetters,149152-156；vanTilbeurgh禾口Claeyssens，1985，F(xiàn)EBSLetters,187:283_288；和Tomme等，1988，Eur.J.Biochem.170:575_581描述的方法測(cè)定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，可以采用Lever等的方法評(píng)定玉米秸稈(cornstover)中纖維素的水解，而vanTilbeurgh等和Tomme等的方法可以用于測(cè)定纖維二糖水解酶對(duì)于熒光二糖衍生物的活性。內(nèi)切葡聚糖酶活性術(shù)語(yǔ)內(nèi)切葡聚糖酶活性”在本文中定義為內(nèi)切-1，4-(1，3;l，4)-i3-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-(1，3；1，4)-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(Ε.C.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-β-D-糖苷鍵、混合型β_1，3葡聚糖如谷類(lèi)β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β_1，4鍵和其它含有纖維素組分的植物材料的內(nèi)水解(endohydrolysis)。就本發(fā)明而言，內(nèi)切葡聚糖酶活性是使用羧甲基纖維素(CMC)水解根據(jù)Ghose，1987，PureandApp1.Chem.59:257_268的方法測(cè)定的。β_葡糖苷酶活性術(shù)語(yǔ)“β-葡糖苷酶活性”在本文中定義為β-D-葡糖苷葡糖水解酶(Ε.C.3.2.1.21)活性，其催化末端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解并釋放β-D-葡萄糖。纖維二糖酶與葡糖苷酶同義。就本發(fā)明而言，葡糖苷酶活性是在25°C使用ImM4-硝基苯基-β-D-吡喃型葡糖苷作為底物在50mM檸檬酸鈉pH4.8中測(cè)定的。將一個(gè)單位的β-葡糖苷酶活性定義為在25°C、pH4.8每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的4-硝基酚。家族6或家族GH6或Cel6術(shù)語(yǔ)“家族6”或“家族GH6”或“Cel6”在本文中定義為根據(jù)HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309_316,及HenrissatB.禾口BairochΑ.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695_696屬于糖苷水解酶家族6的多肽。根據(jù)這樣的分類(lèi)，SEQIDNO2或其成熟多肽屬于家族6并被預(yù)測(cè)為纖維二糖水解酶II。分離的多肽術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”用于本文中指從來(lái)源分離的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，如通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的，所述多肽為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多肽術(shù)語(yǔ)“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計(jì)至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如，這能夠通過(guò)如下實(shí)現(xiàn)由公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。成熟多肽術(shù)語(yǔ)“成熟多肽”在本文中定義為具有纖維二糖水解酶活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最終形式存在。在一個(gè)優(yōu)選的方面，基于預(yù)測(cè)SEQIDNO:2的氨基酸1-17是信號(hào)肽的SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1_6)，所述成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸18-482。成熟多肽編碼序列術(shù)語(yǔ)“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有纖維二糖水解酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，基于預(yù)測(cè)核苷酸1-51編碼信號(hào)肽的SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1_6)所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸52-1809。同一性?xún)蓚€(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“同一性”來(lái)描述。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276_277)(優(yōu)選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443-453)來(lái)測(cè)定的。使用的可選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一性并且是如下計(jì)算的(相同的殘基XlOO)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-比對(duì)中的缺口總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，見(jiàn)上)(優(yōu)選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見(jiàn)上)測(cè)定。使用的可選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一性并且是如下計(jì)算的(相同的脫氧核糖核苷酸XlOO)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-比對(duì)中的缺口總數(shù))同源序列術(shù)語(yǔ)“同源序列”在本文中定義為用SEQIDNO2的嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶或其成熟多肽，在tfasty檢索(Pearson，W.R.，1999，于BioinformaticsMethodsandProtocols，S.Misener和S.A.Krawetz編，185-219頁(yè))中給出小于0.001的E值(或預(yù)期分?jǐn)?shù))的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)。多肽片段術(shù)語(yǔ)“多肽片段”在本文定義為從SEQIDNO2的成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的多肽；或其同源序列；其中所述片段具有纖維二糖水解酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少415個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少435個(gè)氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少455個(gè)氨基酸殘基。亞序列術(shù)語(yǔ)“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的5'和/或3'端缺失了一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸的核苷酸序列；或其同源序列；其中所述亞序列編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少1245個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少1305個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選至少1365個(gè)核苷酸。等位變體(allelicvariant)術(shù)語(yǔ)“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過(guò)突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無(wú)變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”用于本文中指從來(lái)源分離的多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的方面，如通過(guò)瓊脂糖電泳測(cè)定的，所述多核苷酸為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語(yǔ)“基本上純的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制備物，其不含其它外來(lái)的或不期望的核苷酸，并且處于適合于在遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動(dòng)子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計(jì)至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即所述多核苷酸制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來(lái)源的，或它們的任何組合。編碼序列當(dāng)用于本文時(shí)術(shù)語(yǔ)“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開(kāi)讀框確定，所述開(kāi)讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開(kāi)始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。cDNA:術(shù)語(yǔ)“cDNA”在本文中定義為能夠通過(guò)反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級(jí)的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過(guò)一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過(guò)稱(chēng)為剪接的過(guò)程去除內(nèi)含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒(méi)有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛?lái)不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段或所述核酸分子是合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”在本文定義為包括對(duì)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的或有利的所有組分。各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對(duì)于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括任何細(xì)胞類(lèi)型，所述細(xì)胞類(lèi)型對(duì)于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)0修飾術(shù)語(yǔ)“修飾”在本文的意思是，對(duì)由SEQIDNO2的成熟多肽組成的多肽或其同源序列的任何化學(xué)修飾，以及對(duì)編碼這樣的多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當(dāng)用在本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“人工變體”的意思是具有纖維二糖水解酶活性的多肽，所述多肽由表達(dá)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的修飾的多核苷酸序列或其同源序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的核苷酸序列通過(guò)人為干預(yù)(humanintervention)，通過(guò)修飾公開(kāi)于SEQIDNO:1的多核苷酸序列或其同源序列來(lái)獲得。發(fā)明詳述具有纖維二糖水解酶活性的多肽在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含下述氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多肽具有纖維二糖水解酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個(gè)氨基酸，優(yōu)選相差五個(gè)氨基酸，更優(yōu)選相差四個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個(gè)氨基酸，最優(yōu)選相差兩個(gè)氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個(gè)氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維二糖水解酶活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸18至482，或其等位變體；或它們的具有纖維二糖水解酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸18至482。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體，或它們的具有纖維二糖水解酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO2的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸18至482或其等位變體，或它們的具有纖維二糖水解酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸18至482組成。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選極低嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選低嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選中嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選中_高嚴(yán)緊條件、甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊條件、和最優(yōu)選非常高嚴(yán)緊條件下與下列雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列，(iii)⑴或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(J.Sambrook，Ε·F.Fritsch禾口Τ·Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)的核苷酸。而且，所述亞序列可以編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述互補(bǔ)鏈?zhǔn)荢EQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。SEQIDNO1的核苷酸序列或其亞序列；以及SEQIDNO2的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的DNA。具體而言，可將這些探針用于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定并從其中分離相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長(zhǎng)度上應(yīng)為至少14個(gè)，優(yōu)選至少25個(gè)，更優(yōu)選至少35個(gè)，并且最優(yōu)選至少70個(gè)核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針長(zhǎng)度上是至少100個(gè)核苷酸。例如，所述核酸探針長(zhǎng)度上可以是至少200個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少400個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸。甚至可以使用更長(zhǎng)的探針，例如，長(zhǎng)度是優(yōu)選至少600個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少700個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選至少800個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少900個(gè)核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以探測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。將這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過(guò)其它分離技術(shù)分離來(lái)自這些其它菌株的基因組或其它DNA?？梢詫?lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)緊條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列；SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列；其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或其亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸52-1809。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(E.coli)NRRLB-50059中的質(zhì)粒pSMail82中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50059中的質(zhì)粒pSMail82中含有的成熟多肽編碼區(qū)。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，將非常低至非常高的嚴(yán)緊條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對(duì)于非常低和低嚴(yán)緊性為25%的甲酰胺、對(duì)于中和中-高嚴(yán)緊性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)緊性為50%的甲酰胺，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時(shí)。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選在45°C(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在50°C(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在55°C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在60°C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選在65°C(高嚴(yán)緊性)，并且最優(yōu)選在70°C(非常高嚴(yán)緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將嚴(yán)緊條件定義為在比使用根據(jù)Bolton和McCarthy計(jì)算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)計(jì)算得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40，IXDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM舞酸二Mi內(nèi)(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時(shí)。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計(jì)算得出的T1Jg5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及由如下多核苷酸編碼的具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、甚至更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%、并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性程度的核苷酸序列或由所述核苷酸序列組成，其編碼活性多肽。參見(jiàn)本文多核苷酸部分。在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及人工變體，所述人工變體包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(或幾個(gè))氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽；或其同源序列。優(yōu)選地，氨基酸改變對(duì)性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或其它功能來(lái)促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(poly-histidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neuratt和PR.L.Hill,1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20個(gè)基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴(lài)氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過(guò)修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上可得到的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells，1989，Science244:1081_1085)來(lái)鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測(cè)試所得突變分子的生物活性(即，纖維二糖水解酶活性)以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見(jiàn)Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)的物理分析而確定，如通過(guò)以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)確定。參見(jiàn)例如deVos等，1992，Science255306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899_904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.30959-64。必需氨基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來(lái)推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science241:53_57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152_2156；WO95/17413；或W095/22625公開(kāi)的那些方法來(lái)進(jìn)行并測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美國(guó)專(zhuān)利5，223，409號(hào)；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動(dòng)化的篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許快速確定感興趣的多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO2的成熟多肽如SEQIDNO2的氨基酸18-482的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。具有纖維二糖水解酶活性的多肽的來(lái)源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來(lái)源有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來(lái)源產(chǎn)生，或由其中插入了來(lái)自所述來(lái)源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選的方面，獲得自給定來(lái)源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)>？LIf菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有纖維二糖水解酶活性；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有纖維二糖水解酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)>l^^^^ffelf|if(Bacillusamyloliquefaciens)、^Hf包|f菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲(chóng)鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如念珠菌屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽，其具有纖維二糖水解酶活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、麥角菌屬(Claviceps)、方寵抱腔菌屬(Cochliobolus)、Coprinopsis、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二胞屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、線黑粉酵母屬(Filibasidium)、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全毛蟲(chóng)目(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、耙菌屬(Irpex)、香菇屬(Lentinula)、小球腔菌屬(L印tospaeria)、梨孢菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌屬(Meripilus)、毛毒屬(Mucor)、毀絲毒屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(PeniciIlium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia^{段M盤(pán)菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha^根毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤(pán)菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、草菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，其具有纖維二糖水解酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的解纖維枝丁頁(yè)抱霉(Acremoniumcellulolyicus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、^^ft#(Aspergillusawamori).ft#(Aspergillusfumigatus).1ft#(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、昆士蘭金抱子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、褐薄金抱子菌(Chrysosporiumzonatum)、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷鐮孢(Fusariumcerealis)、庫(kù)威鐮孢(Fusariumcrookwellense)、大刀鐮孢(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)毒(Humicolalanuginosa)、白囊奉巴菌(Irpexlacteus)、米M毛毒(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfunieulosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、Thielaviaaustraleinsis、Thielaviafimeti、微抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana^罾fe冑(Thielaviaspededonium)、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木毒(Trichodermaharzianum)、康寧木毒(Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)多月太。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是嗜熱毀絲霉、Myceliophthorafergusii、Myceliophthorahinnulea、Myceliophthorahistoplasmoides、Myceliophthoraindica、藤黃毀絲霉(Myceliophthoralutea)、硫磺毀絲霉(Myceliophthorasulphurea)、嗜熱毀絲霉或Myceliophthoravellerea多月太。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的嗜熱毀絲霉多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的嗜熱毀絲霉CBS202.75多肽，例如，包含SEQIDNO2的成熟多肽的多肽?？衫斫獾氖菍?duì)于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類(lèi)學(xué)的等同物(equivalent)，例如無(wú)性型(anamorph)，而無(wú)論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員會(huì)容易地識(shí)別適合的等同物的身份(identity)。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)對(duì)于公眾能夠容易地獲得，所述保藏機(jī)構(gòu)如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專(zhuān)利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來(lái)源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。然后可通過(guò)相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫(kù)來(lái)獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測(cè)到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見(jiàn)，例如，Sambrook等，1989，見(jiàn)上)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過(guò)將編碼另一個(gè)多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來(lái)產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們符合讀框，并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點(diǎn)。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點(diǎn)，從融合蛋白質(zhì)釋放具有纖維二糖水解酶活性的多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括，但不限于，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(diǎn)(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3568-76；Svetina，2000，J.Biotechnol.76245-251；Rasmussen-ffilson1997,Appl.Environ.Microbiol.633488-3493；Ward等，1995,Biotechnology13498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology9:378_381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點(diǎn)，其在精氨酸殘基后通過(guò)因子X(jué)a蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點(diǎn)，其在賴(lài)氨酸后通過(guò)腸激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982_987)；His-Tyr-Glu位點(diǎn)或His-Tyr-Asp位點(diǎn)，其通過(guò)GenenaseI切割(Carter等，1989,Proteins-Structure,Function,andGenetics6:240_248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點(diǎn)，其在Arg后通過(guò)凝血酶切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld435-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點(diǎn)，其在Gin后通過(guò)TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，見(jiàn)上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點(diǎn)，其在Gin后通過(guò)遺傳工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，見(jiàn)上)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列，或由該核苷酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDN0:1或由SEQIDNO:1組成。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50059中所含質(zhì)粒pSMail82中的序列，或由該序列組成。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的核苷酸52-1809或由SEQIDNO:1的核苷酸52-1809組成。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50059中所含質(zhì)粒pSMai182中的成熟多肽編碼序列或由該成熟多肽編碼區(qū)組成。本發(fā)明還包含編碼如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO2的氨基酸序列或其成熟多肽組成；由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維二糖水解酶活性的SEQIDNO2的片段。本發(fā)明還涉及突變的多核苷酸，其在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)突變或由具有至少一個(gè)突變的SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成，其中突變的核苷酸序列編碼SEQIDN02的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^(guò)例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來(lái)檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見(jiàn)，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法，如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴(kuò)增(NASBA)?？梢詮臍Ыz霉屬菌株，或另外的或相關(guān)的生物體克隆所述多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其組成，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多核苷酸編碼活性多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對(duì)于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術(shù)語(yǔ)與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來(lái)源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的人工變體。可以在作為SEQIDN01的成熟多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過(guò)引入如下核苷酸取代來(lái)構(gòu)建變體序列所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見(jiàn)，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpressionandPurification2一107。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，這些取代能夠在對(duì)于分子功能重要的區(qū)域之外進(jìn)行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對(duì)于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進(jìn)行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見(jiàn)，例如，Cunningham和Wells，1989，見(jiàn)上)來(lái)鑒定。在后一技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個(gè)荷正電的殘基處，并且測(cè)試所得突變分子的纖維二糖水解酶活性，以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物_酶相互作用的位點(diǎn)也能夠通過(guò)分析三維結(jié)構(gòu)確定，通過(guò)如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記這樣的技術(shù)來(lái)確定(參見(jiàn)，例如，deVos等，1992，見(jiàn)上；Smith等，1992，見(jiàn)上；fflodaver等，1992，見(jiàn)上)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選低嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中_高嚴(yán)緊條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊條件，并且最優(yōu)選非常高的嚴(yán)緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈，或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定義的。在一個(gè)優(yōu)選的方面，互補(bǔ)鏈?zhǔn)荢EQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。本發(fā)明還涉及如下獲得的分離的多核苷酸(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴(yán)緊條件下，將DNA的群體與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDN01的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述互補(bǔ)鏈?zhǔn)荢EQIDN0:1的成熟多肽編碼序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。可以用許多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以供多肽的表達(dá)。依賴(lài)于表達(dá)載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，其是由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識(shí)別的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下述獲得的啟動(dòng)子大腸桿菌lac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),\)JsRtacj^sj]^(DeBoer1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21_25)。另夕卜的啟動(dòng)子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于ScientificAmerican，1980，242:74_94中；和在Sambrook等，1989，見(jiàn)上中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動(dòng)子由Romanos等，1992，Yeast8:423_488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其是由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見(jiàn)上描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識(shí)別為向轉(zhuǎn)錄的mRNA添加聚腺苷殘基的信號(hào)?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology15:5983_5990描述。調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號(hào)肽編碼序列，該信號(hào)肽編碼序列與編碼分泌多肽的編碼序列區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?；蛘?，編碼序列5’端可含有對(duì)于所述編碼序列為外源的信號(hào)肽編碼序列。外源信號(hào)肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號(hào)肽編碼序列時(shí)可為必需的。或者，外源信號(hào)肽編碼序列可以簡(jiǎn)單地取代天然信號(hào)肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號(hào)肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號(hào)肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號(hào)肽編碼序列由Romanos等，1992，見(jiàn)上描述。在一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽包含SEQIDNO2的氨基酸1至17或由SEQIDN02的氨基酸1至17組成。在另一優(yōu)選的方面，信號(hào)肽編碼序列包含SEQIDNO1的核苷酸1至51或由SEQIDNO1的核苷酸1至51組成。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱(chēng)為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱(chēng)為酶原(zymogen))0前肽通常是無(wú)活性的并且能夠通過(guò)前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母a因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。當(dāng)信號(hào)肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時(shí)，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號(hào)肽序列置于緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開(kāi)啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過(guò)在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來(lái)表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸序列。在制備表達(dá)載體的過(guò)程中，將編碼序列置于載體中，使得該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)用調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴(lài)于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))選擇性標(biāo)記，其允許簡(jiǎn)單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等價(jià)物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴(lài)編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過(guò)同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對(duì)，優(yōu)選400至10，000堿基對(duì)，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對(duì)，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過(guò)非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以還包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(r印licator)，其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文定義為能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和pAM31的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMA1和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。分離AMA1基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開(kāi)于WO00/24883中的方法完成。可以將多于一個(gè)拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過(guò)如下方法獲得將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過(guò)在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，從而也含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)，例如，Sambrook等，1989，見(jiàn)上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，將所述重組宿主細(xì)胞有利地用于多肽的重組產(chǎn)生。將包含本發(fā)明的多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞使得所述載體作為染色體整合體或作為自復(fù)制的染色體外載體保持，如前文所述。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包含親本細(xì)胞的任何子代，其因?yàn)樵趶?fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而與該親本細(xì)胞不同。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上會(huì)依賴(lài)于編碼多肽的基因及其來(lái)源。宿主細(xì)胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞，例如，原核或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的鏈球菌屬細(xì)胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是似馬鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是釀膿鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是乳房鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的鏈霉菌屬細(xì)胞包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲(chóng)鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是除蟲(chóng)鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是天藍(lán)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是灰色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111_115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，Young和Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823_829或Dubnau禾口Davidoff-Abelson,1971，JournalofMolecularBiology56:209_221)，電穿孑L(參見(jiàn)，例如，Shigekawa禾口Dower，1988，Biotechniques6742-751)或接合(參見(jiàn)，例如，Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriologyl69:5771_5278)。可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166557-580)或電穿孔(參見(jiàn)，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127_6145)?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見(jiàn)，例如，Gong等，2004，F(xiàn)oliaMicrobiol.(Praha)49:399_405)，接合(參見(jiàn)，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583_3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見(jiàn)，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98=6289-6294)?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞例如電穿孔(參見(jiàn)，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見(jiàn)，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51_57)?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見(jiàn)，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32:1295_1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68189-207)，電穿孔(參見(jiàn)，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.653800-3804)或接合(參見(jiàn)，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45409-436)。然而，可以使用任何已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的方法。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物或真菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T(mén)子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)禾口接合菌門(mén)(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby，sDictionaryofTheFungi，第八版，1995，CABInternational,UniversityPress，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(mén)(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見(jiàn)上，171頁(yè)中所引用)，和所有有絲分裂孢^(guò)^^(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995,)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(lèi)(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類(lèi)在未來(lái)可能改變，就本發(fā)明而言，會(huì)將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,禾口Davenport,R.R.,eds,Soc.App.Bacterid.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在甚至更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括真菌門(mén)(Eumycota)和卵菌門(mén)的亞門(mén)(如由Hawksworth等，1995，見(jiàn)上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過(guò)菌絲延伸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而碳分解代謝是專(zhuān)性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、線黑粉酵母屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)成鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑刺■i胃(Bjerkanderaadusta)^Ceriporiopsisaneirina^Ceriporiopsisaneirina^Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta^Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、Ceriporiopsissubvermispora、口譽(yù)角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、氈金孢子菌、昆士蘭金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、剌芹側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉、Trametesvillosa、Trametesversicolor、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞?？梢詫⒄婢?xì)胞通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78147-156和W096/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon,M.I(編者)，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,182-187頁(yè)，AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是毀絲霉屬的。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是嗜熱毀絲霉。在最優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是嗜熱毀絲霉CBS202.75。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)如本文所述的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個(gè)突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，所述多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過(guò)在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組成制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細(xì)胞裂解物(lysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對(duì)于所述多肽是特異性的方法來(lái)檢測(cè)多肽。這些檢測(cè)方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(yàn)(enzymeassay)可用于測(cè)定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過(guò)常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過(guò)多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取(參見(jiàn)，例如，ProteinPurification，J.Janson禾口LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明還涉及植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽，從而以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生所述多肽?？蓮闹参锘蛑参锊糠只厥斩嚯摹；蛘?，可使用含有該重組多肽的植物或植物部分本身(assuch)來(lái)改進(jìn)食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties)，或用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股穎屬)；和谷類(lèi)，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例是煙草(tobacco)，豆類(lèi)(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實(shí)例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(shí)(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細(xì)胞區(qū)室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)>(vacuole)、過(guò)氧化物酶體(peroxisome)和細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)也被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無(wú)論什么組織來(lái)源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分，如為了促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用而分離的特定組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)0同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代。表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)如下方法構(gòu)建所述植物或植物細(xì)胞將編碼本發(fā)明多肽的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))表達(dá)構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的修飾植物或植物細(xì)胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。表達(dá)構(gòu)建體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達(dá)該多核苷酸序列所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含對(duì)于鑒定其中整合了表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞有用的選擇性標(biāo)記，和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴(lài)于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，如啟動(dòng)子和終止子序列和任選地信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇，舉例來(lái)說(shuō)，基于期望何時(shí)、何處以及如何表達(dá)多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86506描述。對(duì)于組成性表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子(Franck等，1980，Cell21:285-294，Christensen等，1992，PlantMo.Biol.18:675_689；Zhang等，1991，PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如來(lái)自貯藏庫(kù)組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊蓮和果實(shí)的啟動(dòng)子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來(lái)自代謝庫(kù)組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動(dòng)子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863_878)，種子特異性啟動(dòng)子諸如來(lái)自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動(dòng)子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885_889)，來(lái)自豆球蛋白(legumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知種子蛋白基因的蠶豆啟動(dòng)子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiologyl52:708_711)、來(lái)自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動(dòng)子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935_941)，來(lái)自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動(dòng)子，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何其它種子特異性的啟動(dòng)子，例如，在TO91/14772中所描述的。此外，啟動(dòng)子可為葉特異性的啟動(dòng)子，如來(lái)自稻或番茄的rbcs啟動(dòng)子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991_1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動(dòng)子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology26:85_93)，或來(lái)自稻的aldP基因啟動(dòng)子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248:668_674)，或傷口誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。同樣地，所述啟動(dòng)子可通過(guò)非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理如溫度、干旱或鹽度變化，或通過(guò)外源施加的激活所述啟動(dòng)子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid)，和重金屬。啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件也可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的較高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見(jiàn)上，公開(kāi)了使用稻肌動(dòng)蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science2441293；Potrykus,1990,Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989，Nature338274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)，是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見(jiàn)Hooykas和Schilperoort，1992，PlantMolecularBiology19:15_38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對(duì)于這些植物其它的轉(zhuǎn)化方法是常用的。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5158-162；Vasil等，1992,Bio/Technology10667-674)0轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415_428所描述的。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇并入了表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化方法用于通過(guò)如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過(guò)特異性重組酶位點(diǎn)特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。去除或減少纖維二糖水解酶活性本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細(xì)胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法導(dǎo)致在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與親本細(xì)胞相比突變的細(xì)胞產(chǎn)生較少的所述多肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法(例如，插入、破壞、替代或缺失)通過(guò)減少或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達(dá)來(lái)構(gòu)建突變細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列是被失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是，例如，編碼區(qū)或其對(duì)活性關(guān)鍵的部分，或表達(dá)編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分，即，足以影響核苷酸序列表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其它調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子?？梢酝ㄟ^(guò)向親本細(xì)胞施以誘變，并且選擇其中已將所述核苷酸序列的表達(dá)減少或消除的突變細(xì)胞來(lái)進(jìn)行核苷酸序列的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機(jī)的，可以通過(guò)例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行，通過(guò)使用合適的寡核苷酸進(jìn)行，或通過(guò)將所述DNA序列進(jìn)行PCR產(chǎn)生的誘變。此外，可以通過(guò)使用這些誘變劑的任何組合來(lái)進(jìn)行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類(lèi)似物。當(dāng)使用這些試劑時(shí)，通常通過(guò)如下來(lái)進(jìn)行所述誘變?cè)诤线m條件下存在優(yōu)選的誘變劑時(shí)培育待誘變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達(dá)減少的或無(wú)基因表達(dá)的突變體細(xì)胞。通過(guò)導(dǎo)入、取代或去除基因中的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)節(jié)元件可以實(shí)現(xiàn)所述核苷酸序列的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開(kāi)放閱讀框。按照本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變可以實(shí)現(xiàn)這種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行，即，直接在表達(dá)待修飾核苷酸序列的細(xì)胞上進(jìn)行，但優(yōu)選如下面所示例的那樣在體外進(jìn)行所述修飾。消除或減少核苷酸序列通過(guò)細(xì)胞的表達(dá)的便利方式的例子是基于基因替代、基因缺失或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將相應(yīng)于內(nèi)源核苷酸序列的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷性的核酸序列，隨后將其轉(zhuǎn)化入親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過(guò)同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內(nèi)源性核苷酸序列?？赡芾硐氲氖撬鋈毕菪院塑账嵝蛄羞€編碼標(biāo)記，其可用于選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化子。在特別優(yōu)選的方面，用可選擇的標(biāo)記(如本文所述的那些)來(lái)破壞所述核苷酸序列?；蛘?，可以使用與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列通過(guò)確定的反義或RNAi技術(shù)來(lái)進(jìn)行所述核苷酸序列的修飾或失活。更具體地，通過(guò)導(dǎo)入與所述基因的核苷酸序列互補(bǔ)的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過(guò)細(xì)胞的表達(dá)，所述序列可以在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并且能夠與細(xì)胞中產(chǎn)生的mRNA雜交。在允許所述互補(bǔ)反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，由此減少或消除翻譯的蛋白質(zhì)的量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及親本細(xì)胞的突變體細(xì)胞，其包含編碼多肽的核苷酸序列或其調(diào)控序列的破壞或缺失，這導(dǎo)致與親本細(xì)胞相比突變體細(xì)胞產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽。這樣生成的多肽缺陷型突變細(xì)胞作為表達(dá)天然和/或異源多肽的宿主細(xì)胞特別有用。所以，本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生天然或異源多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。術(shù)語(yǔ)“異源多肽”在本文中定義為對(duì)宿主細(xì)胞不是天然的多肽，進(jìn)行了修飾以改變天然序列的天然蛋白，或作為通過(guò)重組DNA技術(shù)對(duì)宿主細(xì)胞操作的結(jié)果其表達(dá)在量上改變的天然蛋白。在另一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生本發(fā)明的多肽以及目標(biāo)蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)基本上無(wú)纖維二糖水解酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法在發(fā)酵之前、之中或發(fā)酵完成之后向發(fā)酵液(fermentationbroth)中添加有效量的能夠抑制纖維二糖水解酶活性的試劑，從發(fā)酵液中回收目標(biāo)產(chǎn)物，并且任選地將回收的產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步純化。在另一方面，本發(fā)明涉及如下生產(chǎn)基本上無(wú)纖維二糖水解酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法在允許產(chǎn)物表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行組合的PH和溫度處理以實(shí)質(zhì)上(substantially)減少纖維二糖水解酶活性，和從發(fā)酵液中回收產(chǎn)物?；蛘?，可以將從培養(yǎng)液回收的酶制備物進(jìn)行組合的PH和溫度處理。所述組合的pH和溫度處理可任選地與纖維二糖水解酶抑制劑處理組合使用。依照本發(fā)明的這個(gè)方面，可能去除至少60%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少85%，還更優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選至少99%的纖維二糖水解酶活性?？墒褂么朔椒ǐ@得纖維二糖水解酶活性的完全去除。組合的pH和溫度處理優(yōu)選在2-4或9-11范圍內(nèi)的pH和至少60_70°C范圍內(nèi)的溫度進(jìn)行一段足夠的時(shí)間以達(dá)到期望的效果，通常30至60分鐘是足夠的。用于培養(yǎng)和純化感興趣的產(chǎn)物的方法可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。本發(fā)明用于產(chǎn)生基本上無(wú)纖維二糖水解酶產(chǎn)物的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質(zhì)如酶的產(chǎn)生中是特別令人有興趣的。所述酶可以選自，例如，淀粉分解酶(amylolyticenzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulolyticenzyme)、氧化還原酶或植物細(xì)胞壁降解酶。這些酶的實(shí)例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶(chitinase)、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、商素過(guò)氧化酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。纖維二糖水解酶缺陷細(xì)胞也可以用于表達(dá)在制藥上引起興趣的異源蛋白質(zhì)例如激素、生長(zhǎng)因子、受體等?？衫斫獾氖切g(shù)語(yǔ)“真核多肽”不僅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通過(guò)氨基酸取代、缺失或添加或其它這樣的修飾而被修飾以增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性、PH耐受性等。在另外的方面，本發(fā)明涉及基本上無(wú)纖維二糖水解酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生。抑制具有纖維二糖水解酶活性的多肽表達(dá)的方法本發(fā)明還涉及抑制具有纖維二糖水解酶活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括對(duì)細(xì)胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子或者在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本發(fā)明多核苷酸的亞序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，dsRNA長(zhǎng)約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的雙鏈體核苷酸。dsRNA優(yōu)選是小干擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制轉(zhuǎn)錄的小干擾RNA(siRNA)。在另一優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制翻譯的微RNA(miRNA)。本發(fā)明還涉及用于抑制細(xì)胞中多肽表達(dá)的這些包含SEQIDNO:1成熟多肽編碼序列的部分的雙鏈RNA(dsRNA)分子。本發(fā)明不受到任何特定作用機(jī)制的限制，dsRNA能進(jìn)入細(xì)胞，并引起相似或相同序列的單鏈RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括內(nèi)源mRNA。當(dāng)細(xì)胞接觸dsRNA時(shí)，來(lái)自同源基因的mRNA選擇性地受到稱(chēng)為RNA干擾(RNAi)的過(guò)程的降解。本發(fā)明的dsRNA可以用于基因沉默療法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的dsRNAi選擇性地降解RNA的方法。所述過(guò)程可以在體外、在活體外(exvivo)或在體內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)方面，dsRNA分子能夠用于產(chǎn)生細(xì)胞、器官或動(dòng)物中的功能喪失突變(loss-of-functionmutation)。制備或使用選擇性降解RNA的dsRNA分子的方法在本領(lǐng)域中公知，參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利No.6，506，559；美國(guó)專(zhuān)利No.6，511，824；美國(guó)專(zhuān)利No.6，515，109；和美國(guó)專(zhuān)利No.6，489，127。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語(yǔ)“富含”表示所述組合物的纖維二糖水解酶活性，例如，以至少1.1的富集因數(shù)(enrichmentfactor)增力口。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶組分，例如，單組分組合物?；蛘撸鼋M合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、葡糖苷酶、鹵素過(guò)氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(p印tidoglutaminase)、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過(guò)例如屬于以下屬或種的微生物產(chǎn)生曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉或疏棉狀腐質(zhì)霉；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木毒o可以依照本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知方法將包括于所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。下面給出的是本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選的用途的實(shí)例。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法確定。用途本發(fā)明還涉及使用具有纖維二糖水解酶活性的多肽或其組合物的方法，如下文所述。纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化本發(fā)明還涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括在有效量的本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽存在下，用包含一種或多種纖維素分解蛋白的組合物處理纖維素材料。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述方法進(jìn)一步包括回收降解的或轉(zhuǎn)化的纖維素材料。本發(fā)明的多肽和宿主細(xì)胞可用于單糖、二糖和多糖的生產(chǎn)中，所述糖類(lèi)作為來(lái)自纖維素生物質(zhì)的化學(xué)或發(fā)酵原料用于產(chǎn)生乙醇、塑料、其它產(chǎn)品或中間物。包含具有纖維二糖水解酶活性的多肽的組合物可以是去除或不去除細(xì)胞的粗發(fā)酵液形式，或是半純化或純化的酶制備物形式。組合物還可以包含在生物質(zhì)的加工中有用的其它蛋白質(zhì)和酶，例如，內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖苷酶、半纖維素分解酶(hemicellulolyticenzyme)、增效劑(enhancer)(WO2005/074647,WO2005/074656)等?；蛘撸M合物可以包含本發(fā)明的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞在使用生物質(zhì)的發(fā)酵方法中作為具有纖維二糖水解酶活性的多肽的來(lái)源。具體地，本發(fā)明的多肽和宿主細(xì)胞可以通過(guò)部分或全部降解纖維素或半纖維素而增加加工殘余物(干燥的蒸餾殘?jiān)?、釀酒酒糟、甘蔗渣?的價(jià)值。宿主細(xì)胞也可以含有編碼在生物質(zhì)加工中有用的上述其它蛋白質(zhì)和酶的天然或異源的基因。生物質(zhì)初生細(xì)胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纖維素，其次最豐富的是半纖維素，而第三是果膠。次生細(xì)胞壁(secondarycellwall)在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后產(chǎn)生，其同樣含有多糖并通過(guò)聚合木質(zhì)素共價(jià)交聯(lián)至半纖維素而加強(qiáng)。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是線性0-(1-4)_D-葡聚糖，而半纖維素包括多種具有系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)的化合物，如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖。盡管通常是多形的，但是纖維素主要作為平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)存在于植物組織中。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。在本發(fā)明的方法中，纖維素材料可以是任何含纖維素的材料。纖維素通常存在于例如植物的莖、葉、外皮(hull)、外殼(husk)和穗軸(cob)，或樹(shù)木的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、市政固體廢物、廢紙、紙漿和造紙廠殘余物。纖維素材料可以是任何類(lèi)型的生物質(zhì)，包括但不限于木材資源、市政固體廢物、廢紙、作物和作物殘余物(參見(jiàn)，例如，Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman編)，105-118頁(yè)，Taylor&Francis,WashingtonD.C.；ffyman,1994,BioresourceTechnology503~16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695_719;Mosier等，1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Sch印er，主編，Volume65，23—40頁(yè)，Springer—Verlag，NewYork)。本文中可理解的是纖維素可以是木素纖維素的形式，其為在混合基質(zhì)中含有木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料。在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是玉米秸稈。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是稻草。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是造紙和紙漿加工廢物(paperandpulpprocessingwaste)在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是木本或草本植物。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是桔橙皮(orangepeel)。將三種主要類(lèi)別的酶用于分解纖維素生物質(zhì)(1)“內(nèi)切-1，4_0-葡聚糖酶”或1，4-0_D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.4)，其隨機(jī)作用于可溶和不溶的1，4-0_葡聚糖底物。(2)“外切-1，4-0-葡聚糖酶”，包括1，4-0-D-葡聚糖葡糖水解酶(EC3.2.1.74)，其從1，4-0-D-葡聚糖釋放D-葡萄糖并且緩慢水解D-纖維二糖；和纖維二糖水解酶(1，4-3-D-葡聚糖纖維二糖水解酶，EC3.2.1.91)，其從1，4-0-葡聚糖釋放D-纖維二糖。(3)“0-D-葡糖苷酶”或0-D-葡糖苷葡糖水解酶(EC3.2.1.21)，其作用于從纖維二糖和可溶的纖維糊精以及一系列糖苷釋放D-葡萄糖單位。本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽優(yōu)選與其它纖維素分解蛋白(例如，內(nèi)切-1，4-0-葡聚糖酶和外切-1，4-0-D-葡聚糖酶)一同使用以降解生物質(zhì)底物的纖維素組分(參見(jiàn)，例如，Brigham等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman編)中，119-141頁(yè)，Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Lee,1997,JournalofBiotechnology561-24)。內(nèi)切-1，4-0-葡聚糖酶和外切-1，4-0-D-葡聚糖酶可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何己知方法產(chǎn)生(參見(jiàn)，例如，Bennett,J.ff.禾口LaSure，L.(編)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA,1991)。具有纖維二糖水解酶活性的多肽和其它纖維素分解蛋白的最適量取決于幾個(gè)因素，其包括但不限于，組分纖維素分解蛋白的混合物、纖維素底物、纖維素底物的濃度、纖維素底物的預(yù)處理、溫度、時(shí)間、PH和包括發(fā)酵生物體(例如，用于同步糖化和發(fā)酵的酵母)。術(shù)語(yǔ)“纖維素分解蛋白”在本文中定義為顯示出能夠在測(cè)試條件下水解或轉(zhuǎn)化或降解纖維素的那些蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的混合物。在一個(gè)優(yōu)選的方面，每克纖維素材料的具有纖維二糖水解酶活性的多肽的量是約0.5至約50mg，優(yōu)選約0.5至約40mg，更優(yōu)選約0.5至約25mg，更優(yōu)選約0.75至約20mg，更優(yōu)選約0.75至約15mg，甚至更優(yōu)選約0.5至約10mg，并且最優(yōu)選約2.5至約10mg每克纖維素材料。在另一優(yōu)選的方面，每克纖維素材料的纖維素分解蛋白的量是約0.5至約50mg，優(yōu)選約0.5至約40mg，更優(yōu)選約0.5至約25mg，更優(yōu)選約0.75至約20mg，更優(yōu)選約0.75至約15mg，甚至更優(yōu)選約0.5至約10mg，并且最優(yōu)選約2.5至約10mg每克纖維素材料。在本發(fā)明的方法中，組合物可補(bǔ)充一種或幾種其它的酶活性，以改善纖維素材料的降解。優(yōu)選的其它酶是半纖維素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角質(zhì)酶)、蛋白酶、漆酶、過(guò)氧化物酶或它們的混合物。在本發(fā)明的方法中，可以在發(fā)酵前或發(fā)酵過(guò)程中(包括在發(fā)酵微生物的繁殖的過(guò)程中或之后)加入其它酶。酶可以源自或獲得自任何合適的來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌、酵母或哺乳動(dòng)物來(lái)源。術(shù)語(yǔ)“獲得”在本文中表示酶可以從自然地產(chǎn)生所述酶作為天然酶的生物體分離。術(shù)語(yǔ)“獲得”在本文中還表示酶可以在宿主生物體中重組產(chǎn)生，其中重組產(chǎn)生的酶對(duì)宿主生物體是天然或外源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，缺失、插入和/或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，即，其為天然氨基酸序列的突變體和/或片段的重組產(chǎn)生的酶，或由本領(lǐng)域已知的核酸改組方法產(chǎn)生的酶。天然酶的意義中包含天然變體，而外源酶的意義中包含通過(guò)重組，如通過(guò)位點(diǎn)定向誘變或改組獲得的變體。還可以將酶純化。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“純化”包括不含來(lái)自其所源自的生物體中其它組分的酶。術(shù)語(yǔ)“純化”還包括不含來(lái)自其所獲得自的天然生物體的組分的酶。可將酶純化，僅存在少量的其它蛋白質(zhì)。表述“其它蛋白質(zhì)”具體涉及其它酶。本文使用的術(shù)語(yǔ)“純化”還指去除其它組分，特別是其它蛋白質(zhì)，并且最特別是存在于本發(fā)明的酶的起源細(xì)胞中的其它酶。所述酶可以是基本上純的。本發(fā)明使用的酶可以是適用于本文所述方法的任何形式，如，例如，含有或者不含細(xì)胞的粗發(fā)酵液、干粉或顆粒、無(wú)粉塵顆粒、液體、穩(wěn)定化的液體或受保護(hù)的酶。顆粒可以通過(guò)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，106，991和4，661，452中公開(kāi)的方法產(chǎn)生，并且可以任選地通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法包覆。可以，例如，根據(jù)已確立的方法通過(guò)加入穩(wěn)定劑(如糖、糖醇或另一種多羥基化合物(polyol)，和/或乳酸或另一種有機(jī)酸)將液體酶制備物穩(wěn)定化。受保護(hù)的酶可以根據(jù)EP238，216中公開(kāi)的方法制備?？梢允褂帽景l(fā)明的方法將纖維素材料處理成為很多有用的有機(jī)產(chǎn)品、化學(xué)品和燃料。除乙醇外，一些可以由纖維素產(chǎn)生的用品和專(zhuān)門(mén)化學(xué)品包括木糖、丙酮、乙酸、甘氨酸、賴(lài)氨酸、有機(jī)酸(例如，乳酸)、1，3_丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糠醛、多羥基鏈烷酸(polyhydroxyalkanoates)、順式、順式-粘康酸和動(dòng)物飼料(Lynd，L.R.，ffyman,C.E.禾口Gerngross,T.U.,1999,BiocommodityEngineering,Biotechnol.Prog.,15777-793；Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179—212；及Ryu,D.D.Y.和Mandels，M.，1980，Cellulases:biosynthesisandapplications,Enz.Microb.Technol.，2:91_102)?？赡艿墓采a(chǎn)效益擴(kuò)大而超越了多種有機(jī)產(chǎn)物從可發(fā)酵糖的合成。生物處理后殘留的富含木質(zhì)素的殘余物可以轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素衍生的化學(xué)品，或者用于產(chǎn)生能量(powerproduction)。根據(jù)本發(fā)明的方法用于處理纖維素材料的常規(guī)方法為本領(lǐng)域那些技術(shù)人員充分理解?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)生物質(zhì)處理設(shè)備來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法，所述設(shè)備經(jīng)配置以根據(jù)本發(fā)明操作。這種設(shè)備可以包括分批式攪拌反應(yīng)器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應(yīng)器、連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器(Gusakov,A.V.,禾口Sinitsyn,A.P.,1985,Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346_352)、研磨反應(yīng)器(Ryu,S.K.，禾口Lee，J.M.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.2553-65)，或者具有由電磁場(chǎng)引起的強(qiáng)烈攪拌的反應(yīng)器(Gusakov，A.V.，Sinitsyn,A.P.，Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。常規(guī)方法包括但不限于，糖化、發(fā)酵、分離的水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)，和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。SHF使用分離的處理步驟，首先將纖維素用酶水解為葡萄糖，然后將葡萄糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，纖維素的酶水解和葡萄糖到乙醇的發(fā)酵組合在一個(gè)步驟中(Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,inHandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan,J.，和Himmel，M.，1999,Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy'sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15=817-827)。HHF包括在同一個(gè)反應(yīng)器但不同的溫度進(jìn)行的兩個(gè)分開(kāi)的步驟，即，高溫酶糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進(jìn)行SSF。DMC在一個(gè)步驟中組合了所有三個(gè)過(guò)程(纖維素酶產(chǎn)生、纖維素水解和發(fā)酵)(Lynd，L.R.，ffeimer,P.J.，vanZyl,W.H.,禾口Pretorius,I.S.,2002,Microbialcelluloseutilization:Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506_577)。“發(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法包括而不限于，用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵產(chǎn)品包括醇(例如，阿拉伯糖醇(arabinitol)、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機(jī)酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、蟻酸、反丁烯二酸、葡萄糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴(lài)氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(C02)和一氧化碳(C0))。發(fā)酵方法還包括在消費(fèi)品醇工業(yè)(例如，啤酒和酒)、乳制品業(yè)(例如，發(fā)酵乳制品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)中使用的發(fā)酵方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生物質(zhì)的方法，其包括(a)在有效量的本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽存在下，用有效量的包含一種或多種纖維素分解蛋白的組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟(a)的糖化的纖維素材料；和(c)從發(fā)酵回收物質(zhì)。包含具有纖維二糖水解酶活性的多肽的組合物可以是去除或不去除細(xì)胞的粗發(fā)酵液的形式，或者是半純化或純化的酶制備物形式，或者組合物可以包含本發(fā)明的宿主細(xì)胞，作為具有生物質(zhì)的發(fā)酵方法中具有纖維二糖水解酶活性的多肽的來(lái)源。物質(zhì)可以是任何源自發(fā)酵的物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，物質(zhì)是醇。可理解的是，術(shù)語(yǔ)“醇”包括含一個(gè)或多個(gè)羥基部分(moiety)的物質(zhì)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醇是丁醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醇是乙醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醇是甘油。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醇是甲醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醇是1，3_丙二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醇是山梨醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醇是木糖醇。參見(jiàn)，例如，Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207_241；Silveira,M.M.禾口Jonas，R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59400~408；Nigam,P.禾口Singh,D.,1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117_124;Ezeii,T.C.,Qureshi,N.禾口Blaschek,H.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBA101andinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595_603。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是有機(jī)酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是乙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是醋酮酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是己二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是抗壞血酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是檸檬酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是蟻酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是反丁烯二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是葡萄糖二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是葡糖醛酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是戊二酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是3-羥基丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是衣康酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是乳酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是蘋(píng)果酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是丙二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是草酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是琥珀酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是木糖酸。參見(jiàn)，例如，Chen,R.，和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63—65:435_4480在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是酮?？衫斫獾氖切g(shù)語(yǔ)“酮”包括含有一個(gè)或多個(gè)酮基的物質(zhì)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見(jiàn)，例如，Qureshi和Blaschek，2003，見(jiàn)上文。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是氨基酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是天冬氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸是賴(lài)氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸是蘇氨酸。參見(jiàn)，例如，Richard，A.，和Margaritis，A.，2004，Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是氣體。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氣體是甲烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氣體是H2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氣體是co2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氣體是CO。參見(jiàn)，例如，Kataoka，N.，A.Miya,禾口K.Kiriyama，1997，Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7):41_47；禾口GunaseelanV.N.inBiomassandnBioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。從纖維素材料產(chǎn)生物質(zhì)通常需要四個(gè)主要步驟。這四個(gè)步驟是預(yù)處理、酶水解、發(fā)酵和回收。下面示例的是產(chǎn)生乙醇的過(guò)程，但可理解的是，可以使用相似的過(guò)程產(chǎn)生其它物質(zhì)，例如，上述物質(zhì)。預(yù)處理。在預(yù)處理或預(yù)水解步驟中，將纖維素材料加熱以分解木質(zhì)素和碳水化合物結(jié)構(gòu)，溶解大部分半纖維素，并使纖維素分解酶能夠到達(dá)纖維素部分。加熱或者直接用蒸汽進(jìn)行，或者在漿料中進(jìn)行，此時(shí)也可向材料加入催化劑以加速反應(yīng)的進(jìn)行。催化劑包括強(qiáng)酸，如硫酸和S02，或堿，如氫氧化鈉。預(yù)處理階段的目的是促進(jìn)酶和微生物的滲透。纖維素生物質(zhì)還可以經(jīng)過(guò)水熱蒸汽爆炸預(yù)處理(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0020164730)。糖化。在酶水解步驟(也稱(chēng)作糖化)中，將本文所述酶加入預(yù)處理的材料中以將纖維素部分轉(zhuǎn)化成葡萄糖和/或其它糖。糖化通常在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中，在受控的PH、溫度和混合條件下進(jìn)行。糖化步驟可以持續(xù)長(zhǎng)達(dá)200小時(shí)。糖化可以在約30°C至約65°C，特別是約50°C的溫度，和約4-約5，尤其是約pH4.5的pH進(jìn)行。為了產(chǎn)生能由酵母代謝的葡萄糖，通常在存在葡糖苷酶時(shí)進(jìn)行水解。發(fā)酵。在發(fā)酵步驟中，作為預(yù)處理和酶水解步驟的結(jié)果從纖維素材料釋放的糖，通過(guò)發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為乙醇。發(fā)酵還可與酶水解在同一個(gè)容器中，同樣在受控的PH、溫度和混合條件下同時(shí)進(jìn)行。當(dāng)糖化和發(fā)酵在同一個(gè)容器中同時(shí)進(jìn)行時(shí)，該方法通常稱(chēng)作同步的糖化和發(fā)酵或SSF。在本發(fā)明的發(fā)酵過(guò)程中可以使用任何合適的纖維素底物或原材料。通常根據(jù)理想的發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和使用的方法來(lái)選擇底物，如本領(lǐng)域中所公知。適用于本發(fā)明的方法中的底物的實(shí)例包括含纖維素材料，如木材或植物殘余物或獲得自能夠由發(fā)酵微生物代謝的經(jīng)處理的纖維素材料的低分子量糖DP1-3，所述物質(zhì)可通過(guò)直接向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入而提供。術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵培養(yǎng)基”可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化方法產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基?！鞍l(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法中的任何微生物。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)成理想的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵微生物的實(shí)例包括真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種的菌株，且具體為釀酒酵母。商業(yè)上可得到的酵母包括，例如REDSTAR/LesaffreEthanolRed(nJ/ARedStar/Lesaffre,USA)>FALI(nJ/AFleischmann'sYeast,BurnsPhilpFoodInc.，USA的部門(mén)獲得)、SUPERSTART(可從Alltech獲得)、GERTSTRAND(可從GertStrandAB,Sweden獲得)和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是酵母屬菌種。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是釀酒酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是克魯維酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)0在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)0在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是念珠菌屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是假熱帶念珠菌(Candidapseudotropicalis)0在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是蕓苔念珠菌(Candidabrassicae)0在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是棍孢屬(Clavispora)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是葡萄牙棍孢(Clavisporalusitaniae)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是仙人掌棍孢(Clavisporaopuntiae)0在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是管囊酵母(Pachysolentannophilus)0在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是酒香酵母屬(Bretarmomyces)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,ffyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)?？梢杂行У貙⑵咸烟前l(fā)酵成乙醇的細(xì)菌包括，例如，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)和熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis，1996，見(jiàn)上文)。在本領(lǐng)域中公知上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。$酉良胃—(Chen,Z.，Ho,N.ff.Y.,1993,CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135—147；Ho,N.ff.Y.，Chen,Z,Brainard,A.P.，1998,GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.641852-1859)或在細(xì)菌如大腸桿菌(Beall,D.S.,Ohta,K.,Ingram,L.0.,1991,ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38296-303)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(Ingram,L.0.，Gomes,P.F.，Lai,X.，Moniruzzaman,M.,Wood,B.E.,Yomano,L.P.,York,S.ff.,1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction，Biotechnol.Bioeng.58:204_214)禾口運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(zhang,M.,Eddy,C.,Deanda,K.,Finkelstein,M.,禾口Picataggio,S.,1995,MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis,Science267:240_243；Deanda,K.,Zhang,M.,Eddy,C.,禾口Picataggio,S.,1996,Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.624465-4470)中克隆異源基因?qū)е聵?gòu)建能將己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體。通常向降解的纖維素或水解產(chǎn)物中加入酵母或另一種微生物，進(jìn)行約24至96小時(shí)的發(fā)酵，如約35至約60小時(shí)。溫度通常在約26°C-約40°C，特別是約32°C，并在約pH3至約pH6，特別是約pH4-5進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將酵母或另一種微生物施用于降解的纖維素或水解產(chǎn)物，且發(fā)酵進(jìn)行約24至約96小時(shí)，如通常35-60小時(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，溫度通常在約26至約40°C之間，特別是約32°C，而pH通常在約pH3至約pH6，優(yōu)選約pH4_5。優(yōu)選以大約105至1012，優(yōu)選大約107至101(1，特別是大約5xl07活菌計(jì)數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用酵母或另一種微生物。在乙醇產(chǎn)生階段的過(guò)程中，酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)該優(yōu)選在大約107至10"1的范圍內(nèi)，尤其是約2xl08。關(guān)于使用酵母進(jìn)行發(fā)酵的其它指導(dǎo)可見(jiàn)于例如“TheAlcoholTextbook，，(K.Jacques,T.P.Lyons禾口D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)中，所述文獻(xiàn)通過(guò)提述并入本文。本領(lǐng)域最廣泛使用的方法是同步的糖化和發(fā)酵(SSF)方法，其中沒(méi)有糖化的保留階段，意味著酵母和酶是一起添加的。對(duì)于乙醇產(chǎn)生，在發(fā)酵后蒸餾醪(mash)以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；飲用乙醇，即，中性飲料酒(potableneutralspirits)，或工業(yè)乙醇。發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何酶方法組合使用，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵方法，而且特定地，改進(jìn)發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率?！鞍l(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長(zhǎng)的刺激劑。優(yōu)選的用于生長(zhǎng)的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實(shí)例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、維生素B6(pyrid0Xine)、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D和E。參見(jiàn)，例如，Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag(2002)，其通過(guò)提述并入本文。礦物質(zhì)的實(shí)例包括能夠提供營(yíng)養(yǎng)物的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，所述營(yíng)養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。Ml。從發(fā)酵的纖維素材料中分離醇，并通過(guò)常規(guī)的蒸餾方法純化。能夠獲得純度高達(dá)約96體積％乙醇的乙醇，其可以用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇(即，中性飲料酒)或工業(yè)乙醇。對(duì)于其它物質(zhì)，可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、蒸餾或提取。在本發(fā)明的方法中，可以向具有纖維二糖水解酶活性的多肽和其它纖維素分解蛋白補(bǔ)充一種或多種其它酶活性，以改進(jìn)纖維素材料的降解。優(yōu)選的其它酶是半纖維素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角質(zhì)酶)、蛋白酶、漆酶、過(guò)氧化物酶，或它們的混合物。在本發(fā)明的方法中，可以在發(fā)酵前或發(fā)酵過(guò)程中(包括在發(fā)酵微生物繁殖的過(guò)程中或之后)加入其它酶。洗滌劑組合物本發(fā)明還涉及洗滌劑組合物，其包含表面活性劑和本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶活性的多肽?？梢约尤胨鼍哂欣w維二糖水解酶活性的多肽并由此使其成為洗滌劑組合物的組分。例如，本發(fā)明的洗滌劑組合物可以配制成手洗或機(jī)洗洗滌劑組合物，其包括適合于預(yù)處理沾污織物的洗衣添加劑組合物和漂洗添加的織物柔軟劑組合物；或者可以配制成用于一般家庭硬表面清潔操作的洗滌劑組合物；或者配制用于手洗或機(jī)洗洗碗操作。在具體的方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種其它的酶，如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶(marmanase)、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶，和/或過(guò)氧化物酶。通常酶組分的性質(zhì)應(yīng)與選擇的洗滌劑相容(即，最適pH、與其它酶和非酶成分的相容性等)，并且所述酶組分應(yīng)該以有效量存在。蛋白酶合適的蛋白酶包括動(dòng)物、植物或微生物來(lái)源的那些。微生物來(lái)源是優(yōu)選的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選是堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶-樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例是枯草蛋白酶，特別是源自芽孢桿菌屬的那些枯草蛋白酶，例如，枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在W089/06279中描述)。胰蛋白酶-樣蛋白酶的實(shí)例是胰蛋白酶(例如，豬或牛來(lái)源的)和W089/06270和W094/25583中描述的鐮孢屬蛋白酶。有用的蛋白酶的實(shí)例是W092/19729,W098/20115,W098/20116和W098/34946中描述的變體，特別是在以下位置中的一個(gè)或多個(gè)具有取代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的蛋白酶包括ALCALASE、SAVINASE、PRIMASE、DURALASE、ESPERASE、和KANNASE(NovozymesA/S)、MAXATASE、MAXACAL、MAXAPEM、PROPERASE、PURAFECT、PURAFECTOXP、FN2和FN3(GenencorInternationalInc.)。MM:合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的突變體。有用的脂肪酶的實(shí)例包括來(lái)自腐質(zhì)霉屬(同物異名嗜熱霉屬(Thermomyces))的脂肪酶，例如EP258068和EP305216中所述來(lái)自疏棉狀腐質(zhì)霉(細(xì)毛嗜熱霉(T.lanuginosus))的脂肪酶或W096/13580中所述來(lái)自特異腐質(zhì)霉的脂肪酶；假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶，例如來(lái)自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB1，372，034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌屬菌種菌株SD705(W095/06720和W096/27002)、威斯康辛假單胞菌(P.wisconsinensis)(W096/12012)；芽孢桿菌屬脂肪酶，例如來(lái)自枯草芽孢桿菌(Dartois等，1993，BiochemicaetBiophysicaActa，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(W091/16422)。其它例子是脂肪酶變體，如在W092/05249,W094/01541、EP407225,EP260105、W095/35381、W096/00292、W095/30744、W094/25578、W095/14783、W095/22615、W097/04079和W097/07202中描述的那些變體。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的脂肪酶包括LIP0LASE、LIPEX和LIP0LASEULTRA(NovozymesA/S)。淀粉酶合適的淀粉酶(a和/或0)包括細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的突變體。淀粉酶包括，例如，獲得自芽孢桿菌屬，例如地衣芽孢桿菌的特殊菌株的a-淀粉酶，在GB1，296，839中有更詳細(xì)的描述。有用的淀粉酶的實(shí)例是W094/02597,W094/18314,W096/23873和W097/43424中描述的變體，特別是在以下位置中的一個(gè)或幾個(gè)具有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商業(yè)上能夠獲得的淀粉酶是DURAMYLtm、TERMAMYLtm、FUNGAMYL和BAN(NovozymesA/S)，RAPIDASE和PURASTAR(來(lái)自GenencorInternationalInc.)。纖維素酶合適的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的突變體。合適的纖維素酶包括來(lái)自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如從特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢產(chǎn)生的真菌纖維素酶，其在美國(guó)專(zhuān)利4，435，307號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利5，648，263號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利5，691，178號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利5，776，757號(hào)和W089/09259中公開(kāi)。特別合適的纖維素酶是具有顏色保護(hù)益處的堿性或中性纖維素酶。這些纖維素酶的實(shí)例是EP0495257、EP0531372、W096/11262、W096/29397、W098/08940中描述的纖維素酶。其它實(shí)例是纖維素變體如WO94/07998、EP0531315、美國(guó)專(zhuān)利5，457，046號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利5，686，593號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利5，763，254號(hào)、W095/2447UW098/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些變體。商業(yè)上能夠獲得的纖維素酶包括CELLUZYME，和CAREZYME(NovozymesA/S)，CLAZINASE禾口PURADAXHA(GenencorInternationallnc.),禾口KAC—500(B)(KaoCorporation)。過(guò)氧化物酶/氧化酶合適的過(guò)氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的突變體。有用的過(guò)氧化物酶的實(shí)例包括來(lái)自鬼傘屬(Coprinus)例如來(lái)自灰蓋鬼傘(C.cinereus)的過(guò)氧化物酶，和它們的變體，如W093/24618,W095/10602和W098/15257中所述的那些變體。商業(yè)上能夠獲得的過(guò)氧化物酶包括GUARDZYME(NovozymesA/S)?？梢酝ㄟ^(guò)加入含有一種或多種酶的單獨(dú)的添加劑，或通過(guò)加入包含全部這些酶的組合添加劑，將酶成分包括在洗滌劑組合物中。可以將本發(fā)明的洗滌劑添加劑，即單獨(dú)添加劑或組合添加劑，配制成例如顆粒、液體、漿料等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑劑型是顆粒，特別是無(wú)粉塵的顆粒；液體，特別是穩(wěn)定化的液體；或漿料。無(wú)粉塵的顆?？梢岳缛缑绹?guó)專(zhuān)利4，106，991和4，661，452號(hào)中所公開(kāi)的產(chǎn)生，并且可以任選地通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行包覆。蠟質(zhì)包覆材料的實(shí)例是具有1000-20000的平均摩爾量(meanmolarweight)的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50個(gè)環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中所述醇含有12-20個(gè)碳原子且其中存在15-80個(gè)環(huán)氧乙烷單位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單-和二-和三酸甘油酯。適于通過(guò)流化床技術(shù)施用的成膜包覆材料的實(shí)例在GB1483591中給出。例如，可以通過(guò)根據(jù)已確定的方法添加多羥基化合物如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來(lái)使液體酶制備物穩(wěn)定化。受保護(hù)的酶(protectedenzyme)可根據(jù)EP238,216中公開(kāi)的方法來(lái)制備。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如，條、片劑、粉劑、顆粒(granule)、糊劑(paste)或液體。液體洗滌劑可以是含水的，通常含有多至70%水和0-30%有機(jī)溶劑；或者是非水的。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，所述表面活性劑可以是非離子的包括半_極性的和/或陰離子的和/或陽(yáng)離子的和/或兩性離子的。表面活性劑通常以按重量計(jì)0.-60%的水平存在。當(dāng)包括于其中時(shí)，洗滌劑通常會(huì)含有約至約40%的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸酯(linearalkylbenzenesulfonate),a-烯烴磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯(alcoholethoxysulfate)、仲烷基磺酸酯(secondaryalkanesulfonate)、a-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或肥皂(soap)。當(dāng)包括于其中時(shí)，洗滌劑通常會(huì)含有約0.2%至約40%的非離子表面活性劑，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲胺氧化物(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide)、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides)，，)。洗滌劑可以含有0-65%的洗滌劑增效劑(builder)或絡(luò)合劑如沸石、二磷酸鹽/酯、三磷酸鹽/酯、膦酸鹽/酯(phosphonate)、碳酸鹽/酯、檸檬酸鹽/酯、氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}(例如來(lái)自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實(shí)例是羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸鹽/酯(polycarboxylate)如聚丙烯酸鹽/酯、馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可含有漂白體系，所述體系可包含H202源如過(guò)硼酸鹽或過(guò)碳酸鹽，可將其與形成過(guò)酸的漂白活化劑如四乙酰乙二胺或壬酰氧基苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)組合?？晒┻x擇的是，漂白體系可包含過(guò)氧酸，例如酰胺、酰亞胺或砜型的過(guò)氧酸?？梢允褂贸Ｒ?guī)穩(wěn)定劑使本發(fā)明的洗滌劑組合物中的酶組分穩(wěn)定化，所述穩(wěn)定劑例如，多羥基化合物如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯，或苯基硼酸(phenylboronicacid)衍生物如4_甲酰苯基硼酸，并且所述組合物可如例如W092/19709和W092/19708中所述配制。洗滌劑也可含有其它常規(guī)洗滌劑成分如織物調(diào)節(jié)劑，包括粘土、泡沫促進(jìn)劑、抑泡劑、抗腐蝕劑、懸污劑、防污物再沉積劑、染料、殺菌劑、光學(xué)增亮劑、助水溶物(bydrotrope)、晦暗抑制劑(tarnishinhibitors)或香料。在洗滌劑組合物中，可以以相當(dāng)于每升洗滌液0.01-100mg酶蛋白，優(yōu)選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白，特別是每升洗滌液0.1-lmg酶蛋白的量加入任何酶組分，特別是本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶活性的多肽。可以額外地將本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶活性的多肽并入W097/07202中公開(kāi)的洗滌劑配方，在此將W097/07202并入作為參考。信號(hào)月太本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼蛋白質(zhì)的基因，其中所述基因與編碼信號(hào)肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號(hào)肽包含SEQIDN02的氨基酸1到17，或由SEQIDNO:2的氨基酸1至17組成，其中所述基因?qū)τ谒龊塑账嵝蛄惺峭庠吹?。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸1-51或由SEQIDN0:1的核苷酸1-51組成。本發(fā)明還涉及包含這樣的核苷酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在適合于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)這樣的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)對(duì)于宿主細(xì)胞可以是天然的或異源的。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”在本文的意思不是指具體長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，并因此包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”還包括組合以形成編碼產(chǎn)物的兩種或兩種以上多肽。所述蛋白質(zhì)還包括雜合多肽，其包含部分或全部多肽序列的組合，所述多肽序列從至少兩種不同的蛋白質(zhì)獲得，其中一種或多種(幾種)對(duì)于宿主細(xì)胞可以是異源或天然的。蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括上述蛋白質(zhì)和雜合蛋白質(zhì)天然存在的等位基因變異和工程化的變異。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報(bào)告蛋白(reporter)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構(gòu)酶或連接酶。在更加優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、3-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶?；蚩梢垣@得自任何原核、真核或其它來(lái)源。通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例材料用作緩沖液和底物的化學(xué)品是至少試劑級(jí)的商業(yè)產(chǎn)品。菌株使用嗜熱毀絲霉CBS202.75作為具有纖維二糖水解酶活性的家族6多肽的基因的來(lái)源。使用米曲霉JaL355菌株(W02002/40694)用于表達(dá)編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的嗜熱毀絲霉基因。培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基平板每升由6gNaN03、0.52gKCl、1.52gKH2P04、lmlCOVE痕量元素溶液、20gNoble瓊脂、20ml50%葡萄糖、2.5mlMgS04*7H20和20ml0.02%生物素溶液組成。COVE痕量元素溶液每升由0.04gNa2B40710H20、0.4gCuS045H20、1.2gFeS047H20、0.7gMnS04H20、0.8gNa2Mo022H20和lOgZnS047H20組成。MDU2BP培養(yǎng)基每升由45g麥芽糖、lgMgS04.7H20、lgNaCl、2gK2S04、12gKH2P04、7g酵母提取物、2g尿素和0.5mlAMG痕量金屬溶液；pH5.0組成。AMG痕量金屬溶液每升由14.3gZnS047H20、2.5gCuS045H20、0.5gNiCl26H20、13.8gFeS047H20、8.5gMnS047H20和3g檸檬酸組成。YEG培養(yǎng)基每升由20g右旋糖(dextrose)和5g酵母提取物組成。實(shí)施例1嗜熱毀絲霉CBS202.75基因組DNA提取將嗜熱毀絲霉CBS202.75在帶擋板的搖瓶中的100mlYEG培養(yǎng)基中于45°C和200rpm培養(yǎng)2天。使用MIRACLOTH(Calbiochem,LaJolla,CA，USA)通過(guò)過(guò)濾收集菌絲體，在去離子水中洗滌兩次，并在液氮中冷凍。將冷凍的菌絲體通過(guò)研缽和杵磨成細(xì)粉，并使用DNEASYPlantMaxiKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)分離總DNA。實(shí)施例2從嗜熱毀絲霉CBS202.75分離全長(zhǎng)家族6纖維二糖水解酶基因(cel6a)使用GEN0MEWALKERUniversalKit(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)按照制造商的說(shuō)明書(shū)從嗜熱毀絲霉CBS202.75分離全長(zhǎng)家族6纖維二糖水解酶基因(cel6a)。簡(jiǎn)言之，用四種不同的產(chǎn)生平末端的限制酶(DraI、EcoRV、PvuII和StuI)分別消化來(lái)自嗜熱毀絲霉CBS202.75的全基因組DNA。然后將各個(gè)批次消化的基因組DNA分別連接到GEN0MEWALKERAdaptor(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)以創(chuàng)建四種文庫(kù)。然后將這些文庫(kù)用作PCR反應(yīng)中的模板，所述PCR反應(yīng)使用下文所示的兩種基因特異性引物，一種用于首次PCR，一種用于二次PCR。所述引物是根據(jù)來(lái)自嗜熱毀絲霉的部分家族6纖維二糖水解酶基因(cel6a)序列(W02004/056981)設(shè)計(jì)的。引物MtCel6a_R45'-ATTGGCAGCCCGGATCTGGGACAGAGTCTG-3'(SEQIDNO3)引物MtCel6a_R55'-CCGGTCATGCTAGGAATGGCGAGATTGTGG-3'(SEQIDNO4)首次擴(kuò)增由1Pi(約6ng)的各文庫(kù)作為模板,0.4mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP中的每一種，lOpmolAdaptor弓|物1(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA)，lOpmol引物MtCel6a-R4，2u1IXADVANTAGEGC-MeltLA緩沖液(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)和1.25單位的ADVANTAGEGC基因組聚合酶混合物(GenomicPolymeraseMix)(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA)組成，終體積為25yl。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333(EppendorfScientific,Inc.,ffestbury,NY,USA)進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)?4°C預(yù)變性1分鐘；7個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94°C的變性溫度30秒；在72°C退火和延伸5分鐘；和32個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在67°C5分鐘。二次擴(kuò)增由1Pi的各首次PCR產(chǎn)物作為模板，0.4mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP中的*—禾中，lOpmolAdaptor弓|2(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA),lOpmol弓丨物MtCel6a_R5，IXADVANTAGEGC-MeltLABuffer和l.25單位的ADVANTAGEGC基因組聚合酶混合物組成，終體積為25yl。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)?4°C預(yù)變性1分鐘；5個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94°c的變性溫度30秒；在72°C退火和延伸5分鐘；和20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在67°C5分鐘。通過(guò)使用40mMTris堿-20mM乙酸鈉-lmMEDTA二鈉(TAE)緩沖液的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物，其中將來(lái)自EcoRV文庫(kù)的3.5kb產(chǎn)物條帶從凝膠切下，使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA，USA)按照制造商的說(shuō)明書(shū)純化，并測(cè)序。實(shí)施例3編碼家族6纖維二糖水解酶的嗜熱毀絲霉基因組序列的表征對(duì)3.5kbPCR片段的DNA測(cè)序使用染料終止物化學(xué)(Giesecke等，1992，JournalofVirologyMethods38:47_60)和引物步移策略以Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems,Inc.，F(xiàn)osterCity,CA,USA)進(jìn)行。使用了以下基因特異性引物進(jìn)行測(cè)序MtCel6a-F25，-GCTGTAAACTGCGAATGGGTTCAG-3‘(SEQIDNO5)MtCel6a-F35，-GGGTCCCACATGCTGCGCCT-3，(SEQIDNO6)MtCel6a-R85，-AAAATTCACGAGACGCCGGG-3，(SEQIDNO7)仔細(xì)檢查核苷酸序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量并且在PHRED/PHRAP軟件(UniversityofWashington,Seattle,WA，USA)的輔助下將全部序列相互比較。將3.5kb序列與來(lái)自嗜熱毀絲霉的部分家族6纖維二糖水解酶基因(cel6a)序列(W02004/056981)比較并比對(duì)。根據(jù)編碼的蛋白質(zhì)與來(lái)自土生梭孢霉、嗜熱毛殼、特異腐質(zhì)霉和里氏木霉的同源糖苷水解酶家族6蛋白的相似性構(gòu)建了用于嗜熱毀絲霉序列的基因模型。所述核苷酸序列(SEQIDNO1)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO2)示于圖1A和1B。該基因組片段編碼482個(gè)氨基酸的多肽，其被96、87、和180bp的3個(gè)內(nèi)含子中斷。所述基因和成熟編碼序列的％6+(含量分別為61.6%和64%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineeringlO:1_6)，預(yù)測(cè)了17個(gè)殘基的信號(hào)肽。預(yù)測(cè)的成熟蛋白含有465個(gè)氨基酸，具有49.3kDa的分子量。使用如EMBOSS的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443_453)，以缺口產(chǎn)生罰分10、缺口延伸罰分0.5和EBL0SUM62矩陣確定了氨基酸序列的比較型配對(duì)全局比對(duì)。所述比對(duì)顯示，編碼具有纖維二糖水解酶活性的CEL6A成熟多肽的嗜熱毀絲霉基因的推導(dǎo)氨基酸序列分別與來(lái)自嗜熱毛殼和特異腐質(zhì)霉的兩種糖苷水解酶家族6蛋白的推導(dǎo)氨基酸序列(GeneSeqP登錄號(hào)分別為ADP84824和AAW44853)共享78.6%和77.6%同一性(不包括缺口)。實(shí)施例4嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶基因(cel6a)的克隆和米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)了下文所示的兩種合成寡核苷酸引物以從實(shí)施例1中制備的基因組DNAPCR擴(kuò)增嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶基因。使用InFusion克隆試劑盒(BDBiosciences,PaloAlto,CA，USA)直接將所述片段克隆到表達(dá)載體PAlLo2(W02004/099228)中，無(wú)需限制酶消化和連接。MtCel6a-F45，-ACTGGATTTACCATGGCCAAGAAGCTTTTCATCACC-3，(SEQIDNO8)MtCel6a-R95，-TACCCTCTAGTTAATTAATTAGAAGGGCGGGTTGGCGT-3，(SEQIDNO9)粗體字代表編碼序列。余下的序列與PAlLo2的插入位點(diǎn)同源。將50皮摩爾的以上各種引物用于PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)由lOOng嗜熱毀絲霉基因組DNA，2u1IXADVANTAGEGC-MeltLA緩沖液，0.4mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP中的每一種，和l.25單位的ADVANTAGEGC基因組聚合酶混合物組成，終體積為25iil。所述擴(kuò)增使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333進(jìn)行，程序?yàn)?個(gè)循環(huán)的94°c1分鐘；和30個(gè)循環(huán)，每個(gè)在94°C30秒，62°C30秒，和72°C2分鐘。然后使加熱塊(heatblock)轉(zhuǎn)到4°C浸漬循環(huán)(soakcycle)。將反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)使用TAE緩沖液的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，其中將1842bp的產(chǎn)物條帶從凝膠切下，并使用qiAQUICK凝膠提取試劑盒按照制造商的說(shuō)明書(shū)純化。將質(zhì)粒pAlLo2(W02004/099228)用NcoI和PacI消化，通過(guò)使用TAE緩沖液的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用qiAQUICK凝膠提取試劑盒按照制造商的說(shuō)明書(shū)純化。將所述基因片段和消化的載體使用Infusion克隆試劑盒連接在一起得到pSMail80(圖2)，在pSMail80中纖維二糖水解酶基因的轉(zhuǎn)錄在來(lái)自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子雜合體(NA2_tpi啟動(dòng)子)的控制下。連接反應(yīng)(50u1)由IXInFusion緩沖液(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)、IXBSA(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)>1U1Infusiong|(110##)(BDBiosciences,PaloAlto，CA，USA)、100ng用NcoI和PacI消化的pAlLo2和50ng嗜熱毀絲霉cel6a純化的PCR產(chǎn)物組成。將所述反應(yīng)在室溫培育30分鐘。使用1yl的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10SOLOPACKGold超感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene，LaJolla，CA，USA)。通過(guò)限制酶消化檢測(cè)到了含有pSMail80的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并使用BIOROBOT9600(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)制備了質(zhì)粒DNA。通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)了pSMail80中的嗜熱毀絲霉cel6a插入物。使用T0P0TACLONING試劑盒將同一1842bpPCR片段克隆到pCR2.1-T0P0載體(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中，以產(chǎn)生pSMail82(圖2)。通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)了pSMail82中的嗜熱毀絲霉ce16a插入物。將大腸桿菌pSMail82于2007年9月6日保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專(zhuān)利培養(yǎng)物保藏中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection)，北區(qū)石if究中心(NorthernRegionalResearchCenter),Peoria,IL,USA。實(shí)施例6嗜熱毀絲霉家族6纖維二糖水解酶cel6a基因在米曲霉JaL355中的表達(dá)根據(jù)Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419_1422的方法制備了米曲霉JaL355(W02002/40694)原生質(zhì)體。使用3iigpSMail80轉(zhuǎn)化米曲霉JaL355。用pSMail80轉(zhuǎn)化米曲霉JaL355生成了約50個(gè)轉(zhuǎn)化體。將20個(gè)轉(zhuǎn)化體分離至單獨(dú)的基本培養(yǎng)基平板。用5ml0.01%TWEEN20洗滌20個(gè)轉(zhuǎn)化體的匯合的基本培養(yǎng)基平板，再分別接種至125ml玻璃搖瓶中的25mlMDU2BP培養(yǎng)基中，并在34°C、250rpm培育。培育5天之后，將來(lái)自各個(gè)培養(yǎng)物的5u1上清液在帶有CRITERIONCell(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)的CRITERIONTris-HCl凝膠上(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)按照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行分析。所得凝膠用BI0-SAFE考馬斯染料(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)來(lái)染色。培養(yǎng)物的SDS-PAGE譜顯示大部分轉(zhuǎn)化體具有約70kDa的主帶。將指名為轉(zhuǎn)化體14的一個(gè)轉(zhuǎn)化體的匯合平板用10ml0.01%TWEEN20洗滌并接種到含有500mlMDU2BP培養(yǎng)基的2升Fernbach中以產(chǎn)生用于表征酶的培養(yǎng)液。在第5天收獲培養(yǎng)物并使用0.22iimEXPRESSTMPlus膜(Millipore，Bedford,MA,USA)過(guò)濾。實(shí)施例7嗜熱毀絲霉CEL6A纖維二糖水解酶的表征在美國(guó)能源部國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(U.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory)(NREL)，Boulder，C0，USA使用稀硫酸預(yù)處理玉米秸稈。使用以下條件進(jìn)行預(yù)處理在190°C和25%w/w干固體條件下，每克干生物質(zhì)0.048g硫酸，進(jìn)行大約1分鐘。經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(PCS)中的水不溶性固體含有53.2%纖維素、3.6%半纖維素和29.8%木質(zhì)素。使用NREL標(biāo)準(zhǔn)分析規(guī)程#002通過(guò)兩階段硫酸水解和后續(xù)的通過(guò)高效液相層析進(jìn)行的糖類(lèi)分析測(cè)定了纖維素和半纖維素。使用NREL標(biāo)準(zhǔn)分析規(guī)程#003在用硫酸水解纖維素和半纖維素級(jí)分之后以重量分析測(cè)定了木質(zhì)素。在酶水解之前，用大量蒸餾水洗滌PCS直到pH高于4.0，然后從100目的篩子篩過(guò)，并最終在121°C高壓滅菌30分鐘。發(fā)現(xiàn)經(jīng)洗滌并過(guò)篩的PCS的干內(nèi)容物為6.54%。使用EC0N0-PAC10DG柱(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)對(duì)如實(shí)施例6中所述制備的嗜熱毀絲霉CEL6A纖維二糖水解酶的搖瓶培養(yǎng)液進(jìn)行脫鹽。使用微量板BCA蛋白測(cè)定試劑盒(MicroplateBCAProteinAssayKit)(Pierce,Rockford,IL,USA)測(cè)定了蛋白濃度?？寺±锸夏久笴EL7B內(nèi)切葡聚糖酶I并在米曲霉JaL250中表達(dá)，如TO2005/067531中所述。使用微量板BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定了蛋白濃度。使用HIPREP26/10脫鹽柱(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)按照制造商的說(shuō)明書(shū)將里氏木霉CEL7B內(nèi)切葡聚糖酶I脫鹽并緩沖液交換至150mMNaCl-20mM乙酸鈉pH5.0。如W02004/099228中所述重組制備了米曲霉Cel3A0-葡糖苷酶，并且如Langston等，2006，Biochim-Biophys.ActaProteinsProteomics1764:972_978所述進(jìn)行了純化。使用微量板BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定了蛋白質(zhì)濃度。重組產(chǎn)生了巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT20888Cel3A3-葡糖苷酶并且使用HIPREP26/10脫鹽柱如上進(jìn)行脫鹽，并使用AKTAFPLC系統(tǒng)(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)按照制造商的說(shuō)明書(shū)以Mono柱進(jìn)一步純化。如W02005/056772中所述從里氏木霉RutC30分離了里氏木霉CEL6A纖維二糖水解酶基因。根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20060156437中所述步驟使用pEJG61作為表達(dá)載體在鑲片鐮孢中表達(dá)了所述里氏木霉CEL6A纖維二糖水解酶基因。如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20060156437中所述進(jìn)行發(fā)酵。使用微量板BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定了蛋白質(zhì)濃度。使用HIPREP26/10脫鹽柱按照制造商的說(shuō)明書(shū)對(duì)里氏木霉CEL6A纖維二糖水解酶進(jìn)行脫鹽并緩沖液交換至20mM乙酸鈉-150mMNaClpH5.0。PCS的水解在用平板密封物(ALPS-300，Abgene，Epsom,UK)密封的96深孔板(AxygenScientific,UnionCity，CA，USA)中進(jìn)行，總反應(yīng)體積為1.0ml。為了測(cè)試嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶的活性，以lmg纖維二糖水解酶每克纖維素連同0.5mg米曲霉葡糖苷酶每克纖維素加樣PCS。使用里氏木霉CEL6A纖維二糖水解酶(lmg每克纖維素)連同米曲霉0-葡糖苷酶(0.5mg每克纖維素)作為對(duì)照用于與嗜熱毀絲霉CEL6A纖維二糖水解酶比較。在TS自流C02夾套式溫箱(TSAutoflowC02JacketedIncubator)(FisherScientific,Pittsburgh,PA,USA)中在pH5.0，50°C進(jìn)行PCS水解。反應(yīng)以一式三份進(jìn)行，并在水解過(guò)程期間取得等分試樣。通過(guò)將每種水解物的20u1等分試樣與180u10.1MNaOH(終止試劑)混合來(lái)終止PCS水解反應(yīng)。為每種樣品生成適當(dāng)?shù)南盗邢♂屛?，并使用適于96孔微量板形式的對(duì)羥基苯甲酸酰胼(para-hydroxybenzoicacidhydrazide)(PHBAH,Sigma,St.Louis,M0,USA)測(cè)定法測(cè)定了還原糖含量。將適當(dāng)稀釋的樣品的100yl等分試樣置于96孔錐底微量板中。通過(guò)向各孔加入50iU2%NaOH中的1.5%(w/v)PHBAH來(lái)起始反應(yīng)。將平板在95°C不加蓋加熱10分鐘，其后向各孔加入50yl蒸餾水。將來(lái)自各孔的100u1等分試樣轉(zhuǎn)移至平底96孔板，并使用SPECTRAMAX.微量板讀數(shù)器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA)測(cè)量410nm的吸光度。使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(0.1-0.0125mg/ml，用0.4%氫氧化鈉稀釋)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以將獲得的A41(lnm值轉(zhuǎn)換成葡萄糖當(dāng)量。使用得到的當(dāng)量計(jì)算每個(gè)反應(yīng)的PCS纖維素轉(zhuǎn)化的百分比。纖維素轉(zhuǎn)化成還原糖的程度(％轉(zhuǎn)化率)使用以下方程式計(jì)算%轉(zhuǎn)化率=RS(mg/ml)x100x162/(纖維素(mg/ml)X180)==RS(fflg/ffll)x100/(纖維素(mgM)X1.Ill)在這個(gè)方程式中，RS是以葡萄糖當(dāng)量(mg/ml)測(cè)量的溶液中的還原糖濃度，而因子1.111反映了纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的重量增加。結(jié)果歸納在表1中。在米曲霉葡糖苷酶的存在下嗜熱毀絲霉CEL6A纖維二糖水解酶與里氏木霉CEL6A纖維二糖水解酶相比對(duì)PCS具有相似的或稍高的活性。表1.由嗜熱毀絲霉CEL6A纖維二糖水解酶或里氏木霉CEL6A纖維二糖水解酶加米曲霉葡糖苷酶進(jìn)行的纖維素轉(zhuǎn)化使用AKTAFPLC系統(tǒng)通過(guò)PHENYLSUPEROSEHR16/10柱(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)將脫鹽的嗜熱毀絲霉Cel6A進(jìn)一步純化。樣品的SDS-PAGE顯示其為至少90%純的。下面使用的其它酶也如上使用AKTAFPLC系統(tǒng)進(jìn)一步純化，其純度高于90%。PCS(反應(yīng)中40g/L)的水解在96深孔板中進(jìn)行并如上所述密封，其中總反應(yīng)體積為1.0ml。在使用人工酶混合物于pH5，50和55°C(TS自流C02夾套式溫箱)進(jìn)行的PCS水解中測(cè)試了嗜熱毀絲霉Cel6A纖維二糖水解酶(與里氏木霉Cel6A纖維二糖水解酶相比)。所述酶混合物由里氏木霉Cel7B內(nèi)切葡聚糖酶(2mg/g纖維素)、巴西青霉GH3A0-葡糖苷酶(0.3mg/g纖維素)以及或者嗜熱毀絲霉Cel6A纖維二糖水解酶或者里氏木霉Cel6A纖維二糖水解酶(2mg/g纖維素)組成。通過(guò)將每種水解物的20u1等分試樣與180u10.1MNaOH(終止試劑)混合來(lái)終止PCS水解反應(yīng)。水解反應(yīng)分析和計(jì)算如上所述進(jìn)行。纖維素轉(zhuǎn)化結(jié)果歸納在表2中。表2.由里氏木霉Cel7B內(nèi)切葡聚糖酶(2mg/g纖維素)、巴西青霉GH3A0-葡糖苷酶(0.3mg/g纖維素)以及或者嗜熱毀絲霉Cel6A或者里氏木霉Cel6A纖維二糖水解酶(2mg/g纖維素)在pH5，50和55°C進(jìn)行的纖維素轉(zhuǎn)化表1顯示了嗜熱毀絲霉6A纖維二糖水解酶在50和55°C的PCS水解中的表現(xiàn)都超過(guò)里氏木霉6A纖維二糖水解酶，并且特別是在55°C。生物材料的保藏依據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款，下述的生物材料已經(jīng)保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專(zhuān)利培養(yǎng)^UM^^^fe^lkff(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection)，北區(qū)石if究中心(NorthernRegionalResearchCenter),1815UniversityStreet,Peoria,Illinois，61604，并給予下述的登錄號(hào)保藏物登錄號(hào)保藏日期大腸桿菌pSMail82NRRLB-500592007年9月6日所述菌株已于下述條件下保藏確保在本專(zhuān)利申請(qǐng)未決期間，由外國(guó)專(zhuān)利法律決定授權(quán)的人能夠獲得所述培養(yǎng)物。所述保藏物為所保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了題述申請(qǐng)的副本，或其后續(xù)文本的國(guó)家，依據(jù)該外國(guó)專(zhuān)利法律的要求，可以獲得所述保藏物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的獲得并不構(gòu)成對(duì)實(shí)施題述發(fā)明的許可，實(shí)施題述發(fā)明是對(duì)政府行為所授予的專(zhuān)利權(quán)的侵犯。本文描述和要求保護(hù)的發(fā)明并不受限于本文所公開(kāi)的具體方面的范圍，因?yàn)檫@些方面意欲作為本發(fā)明幾個(gè)方面的說(shuō)明。任何等同的方面意欲在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)際上，從前面的說(shuō)明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。這些修改也意欲落入所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開(kāi)為準(zhǔn)。權(quán)利要求具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，甚至更優(yōu)選至少90％，并且最優(yōu)選至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，甚至更優(yōu)選至少90％，并且最優(yōu)選至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的核苷酸序列；和(d)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽。2.權(quán)利要求1的多肽，其包含或其組成為SEQIDNO2的氨基酸序列；或其具有纖維二糖水解酶活性的片段。3.權(quán)利要求1的多肽，其由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或其組成為SEQIDNO1的核苷酸序列；或其編碼具有纖維二糖水解酶活性的片段的亞序列。4.權(quán)利要求1的多肽，其由大腸桿菌NRRLB-50059中所含質(zhì)粒pSMail82中含有的多核苷酸編碼。5.分離的多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。6.核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求5的多核苷酸，該多核苷酸與指導(dǎo)所述多肽在表達(dá)宿主中產(chǎn)生的一種或多種調(diào)控序列可操作地連接。7.重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建體。8.產(chǎn)生權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽的方法，包括(a)在用于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。9.產(chǎn)生權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。10.產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，包括破壞或缺失編碼權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列，這導(dǎo)致所述突變體產(chǎn)生的所述多肽少于親本細(xì)胞。11.產(chǎn)生權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。12.用編碼權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞。13.雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含權(quán)利要求5的多核苷酸的亞序列，其中任選地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。14.抑制細(xì)胞中多肽表達(dá)的方法，包括向所述細(xì)胞施用或在所述細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求13的雙鏈RNA(dsRNA)分子。15.核酸構(gòu)建體，其包含編碼蛋白質(zhì)的基因，該基因與編碼信號(hào)肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號(hào)肽包含SEQIDNO2的氨基酸1-16或由SEQIDNO2的氨基酸1_16組成，其中所述基因?qū)τ谒龊塑账嵝蛄惺峭庠吹摹?6.重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體。17.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求16的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。18.用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在有效量的權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的具有纖維二糖水解酶活性的多肽存在下，用有效量的包含一種或多種纖維素分解蛋白的組合物處理所述纖維素材料，其中所述具有纖維二糖水解酶活性的多肽的存在使纖維素材料的降解與不存在所述具有纖維二糖水解酶活性的多肽時(shí)相比增加。19.權(quán)利要求18的方法，還包括回收降解的纖維素材料。20.用于產(chǎn)生物質(zhì)的方法，包括(a)在有效量的權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的具有纖維二糖水解酶活性的多肽存在下，用有效量的包含一種或多種纖維素分解蛋白的組合物糖化纖維素材料，其中所述具有纖維二糖水解酶活性的多肽的存在使纖維素材料的降解與不存在所述具有纖維二糖水解酶活性的多肽時(shí)相比增加；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟(a)的糖化的纖維素材料；和(c)從所述發(fā)酵回收物質(zhì)。21.洗滌劑組合物，包含表面活性劑和權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的具有纖維二糖水解酶活性的多肽。全文摘要本發(fā)明涉及具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。文檔編號(hào)C12N5/10GK101874109SQ200880117634公開(kāi)日2010年10月27日申請(qǐng)日期2008年9月26日優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日發(fā)明者丁晗澍,保羅·哈里斯,蘇欽德拉·梅尤蘭,金伯利·布朗申請(qǐng)人:諾維信公司