專利名稱：運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌果聚糖蔗糖酶基因突變的工程菌及其構(gòu)建和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌果聚糖蔗糖酶基因突變的工程菌；本發(fā)明還涉及此工程菌的構(gòu)建方法以及其在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的用途。
背景技術(shù)：
運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一一株通過脫氧酮糖酸(Entner-Doudoroff，E-D)途徑利用葡萄糖、果糖和蔗糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的革蘭氏陰性的兼性厭氧細(xì)菌。
運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌有三種蔗糖水解酶胞內(nèi)蔗糖水解酶SacA(intracellularsucrose-hydrolyzing enzymes)和胞外蔗糖水解酶SacC(extracellularsucrose-hydrolyzing enzymes)及胞外果聚糖蔗糖酶SacB(extracellularlevansucrase)。由于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的細(xì)胞膜上沒有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶系，所以胞內(nèi)蔗糖水解酶SacA在蔗糖水解和發(fā)酵中實(shí)際上不發(fā)揮作用。SacC能夠水解蔗糖生成單糖(葡萄糖和果糖)，生成的單糖繼而通過E-D代謝途徑生成乙醇。
SacB不僅具有蔗糖水解活性，同時(shí)又具有果聚糖形成活性。即其水解蔗糖的產(chǎn)物是葡萄糖和果聚糖。只有葡萄糖可以進(jìn)一步通過E-D代謝途徑生成乙醇。因此當(dāng)需要采用蔗糖作為發(fā)酵碳源制備乙醇時(shí)，由于副產(chǎn)物果聚糖的生成，影響了乙醇的產(chǎn)量。
已知SacB的蔗糖水解活性是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌總的蔗糖水解活性的1/3，所以，如果在利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌進(jìn)行蔗糖水解的過程中控制果聚糖的形成，則可以提高乙醇的收率。這是一個(gè)待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備一種新型運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌工程菌，使其在用蔗糖作為底物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的過程中減少副產(chǎn)物果聚糖的形成，以提高乙醇的產(chǎn)率。
本發(fā)明的技術(shù)方案是1.SacB基因改造將四環(huán)素抗性基因插入到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因(SacB)中，這些基因包括GeneBank L33402、AF081588、AF313764等；2.構(gòu)建含有經(jīng)改造的SacB基因的重組質(zhì)粒將上述插入四環(huán)素抗性基因的SacB基因連接到克隆載體上，用內(nèi)切酶消化，然后插入到自殺性質(zhì)粒中；3.構(gòu)建將四環(huán)素抗性基因插入到果聚糖蔗糖酶基因的工程菌將得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌后，篩選具有四環(huán)素抗性的突變菌株。該突變株即為將四環(huán)素抗性基因插入到果聚糖蔗糖酶基因中的目標(biāo)菌株。
所述運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌包括運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌XW101，及其它與其親緣關(guān)系相近的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株；所述克隆載體包括pGEM-T、pUC19、pBS、pACYC184等載體；所述自殺性質(zhì)粒包括質(zhì)粒pSUP202、pPHU281和pSZ21等。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.本發(fā)明得到的上述運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌工程菌具有四環(huán)素抗性，使果聚糖蔗糖酶基因失活，不能將發(fā)酵底物蔗糖轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物果聚糖，從而提高了將底物轉(zhuǎn)化為乙醇的效率。
經(jīng)測(cè)試，使用本發(fā)明得到工程菌，在以15％的蔗糖為發(fā)酵底物時(shí)，在30攝氏度靜置培養(yǎng)經(jīng)過70小時(shí)的發(fā)酵，可以明顯提高蔗糖轉(zhuǎn)化為乙醇(從37.2g/l到44.3g/l)的效率，即乙醇的產(chǎn)量提高了19％。
2.本發(fā)明采取同源重組雙交換的方法使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因突變失活，同時(shí)插入標(biāo)記基因-四環(huán)素抗性基因，為突變后目標(biāo)基因的篩選提供了方便。
具體實(shí)施例方式
以下以運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌XW101為例，詳細(xì)說明本發(fā)明的內(nèi)容。但本發(fā)明的范圍并不局限于此。應(yīng)該說，本領(lǐng)域的技術(shù)人員用本發(fā)明的思路和方法可在任何運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的。
在以下的實(shí)施例中，制備的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌工程菌是在野生型菌株的果聚糖蔗糖酶SacB基因(GeneBank L33402)的955bp處插入1950bp四環(huán)素抗性基因的目標(biāo)菌株。利用SacB-F和SacB-R作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得3.685kb的產(chǎn)物。上述運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌XW101的果聚糖蔗糖酶基因是通過PCR克隆得到的，在進(jìn)行擴(kuò)增運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因時(shí)所用引物序列如SacB-F及SacB-R所示。
實(shí)施例1運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌工程菌的制備A、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的培養(yǎng)及DNA的提取運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在培養(yǎng)基RM(葡萄糖20g/l、酵母浸膏10g/l、磷酸二氫鉀2g/l、pH6.0)中30攝氏度培養(yǎng)48小時(shí)后，采用CTAB法提取總DNA用于以后的遺傳操作。
CTAB法提取細(xì)菌總DNA1)取單菌落接種于5ml相應(yīng)的培養(yǎng)基中，在合適的溫度下培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)菌的生長(zhǎng)率不同培養(yǎng)時(shí)間可由幾小時(shí)到幾天不等。
2)取1.0ml菌液于1.5ml離心管中，13,000rpm離心2min，棄上清。
3)沉淀重懸于1.0ml 0.85％NaCl中。
4)室溫13,000rpm離心2min，棄上清。
5)沉淀重懸于550μl 1×TE中。
6)加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃溫育30min。
7)加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37℃溫育30min。
8)加30μl 10％SDS，37℃溫育30min。
9)加100μl 5M NaCl充分混勻。
10)加80μl CTAB/NaCl溶液，混勻，65℃水浴10min。
11)加等體積(0.7～0.8ml)氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕振蕩混勻。
12)室溫，13,000rpm離心10min。
13)將上清液轉(zhuǎn)移到一新1.5ml離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)輕輕振蕩混勻。
14)重復(fù)第12)步。
15)將上清液轉(zhuǎn)移到一新1.5ml離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)輕輕振蕩混勻。
16)重復(fù)第12)步。
17)將上清液轉(zhuǎn)移到一新1.5ml離心管中，加入0.6體積異丙醇，混勻后室溫靜置60min。
18)20℃13,000rpm離心20min。
19)棄上清，加500μl 70％乙醇，輕輕顛倒數(shù)次(洗鹽)。
20)4℃15,000rpm離心20min。
21)重復(fù)洗鹽兩次。
22)倒置離心管，干燥DNA沉淀10～15min。
DNA沉淀溶于20μl無菌水，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> B、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌XW101果聚糖蔗糖酶基因的克隆以SacB-F5’-GCATGCGAGATTTATATGGTTGC-3’和SacB-R5’-GTCGACGGAATAGGAAGGGTGTC-3’為引物，擴(kuò)增運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因。得到XW101果聚糖蔗糖酶基因的PCR產(chǎn)物，其大小為1735bp，并重組到pGEM-T載體上，該重組質(zhì)粒命名為pGS，經(jīng)測(cè)序分析后，與已報(bào)道的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌果聚糖蔗糖酶基因的同源性為98％。
PCR反應(yīng)體系10×PCR buffer 2μl2.5mMdNTP 2μl50μM SacB-F 0.5μl50M SacB-R 0.5μl模板DNA2μl5U/μlTaq酶0.5μl加無菌水至20μlPCR反應(yīng)條件1、94℃預(yù)變性 5min2、94℃30s53℃ 1min72℃ 2min(25個(gè)循環(huán))3、72℃10min連接體系與連接反應(yīng)2×buffer 5μlpGEM-T 0.5μlPCR產(chǎn)物3.5μlT4連接酶(3U/μl) 1μl4℃過夜連接。
c、將四環(huán)素抗性基因插入到所克隆的果聚糖蔗糖酶基因中。
通過分析，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pGS的插入片段中在955bp處有唯一的Nde I酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切后，將四環(huán)素抗性基因插入到該位點(diǎn)，構(gòu)建成果聚糖蔗糖酶基因中插入有四環(huán)素抗性基因的重組質(zhì)粒pGST限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)體系與酶切反應(yīng)10×buffer5μlDNA樣品 3μl限制性內(nèi)切酶 0.5μl加無菌水至20μl37℃過夜酶切D、果聚糖蔗糖酶基因突變菌株的構(gòu)建用SalI和SphI完全酶切重組質(zhì)粒pGST后，將得到的含有四環(huán)素抗性基因插入片斷的果聚糖蔗糖酶基因與經(jīng)SalI和SphI完全酶切的pSUP202自殺性質(zhì)粒重組，得重組質(zhì)粒pSST，在pRK2013幫助下通過三親接合導(dǎo)入到野生型運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌XW101中，在含有四環(huán)素(20μg/ml)和氨芐青霉素(100μg/ml)的RM培養(yǎng)基上篩選突變菌株。得到工程菌株XW101(pSST)。
E、四環(huán)素抗性基因插入位點(diǎn)的驗(yàn)證采用B中的引物，以工程菌株XW101(pSST)的總DNA為模板(反應(yīng)條件和反應(yīng)體系如B中所述)，可擴(kuò)增到大小約為3.685kb的條帶，說明四環(huán)素抗性基因經(jīng)過同源重組雙交換，已成功的插入到目標(biāo)基因果聚糖蔗糖酶基因中間。
實(shí)施例2工程菌株XW101(pSST)利用蔗糖發(fā)酵乙醇1.培養(yǎng)條件1.1培養(yǎng)基成分蔗糖15％、酵母浸膏1％、磷酸二氫鉀0.2％、pH6.01.2培養(yǎng)條件30攝氏度靜置培養(yǎng)70小時(shí)2.乙醇的測(cè)定2.1色譜條件2.1.1色譜柱長(zhǎng)2m，內(nèi)徑4mm。
2.1.2固定相GDX-102，60-80目2.1.3溫度氣化室190度，檢測(cè)器190度，柱溫170度。
2.1.4氣體流速載氣(N2)40ml/min。
2.2進(jìn)樣量5.0ul。
2.3定性以乙醇標(biāo)準(zhǔn)出峰時(shí)間定性。乙醇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和樣品測(cè)定液各進(jìn)樣5.0ul，分別測(cè)定保留時(shí)間，樣品與標(biāo)準(zhǔn)出峰時(shí)間對(duì)照而定性。
2.4定量2.4.1樣品測(cè)定液中乙醇含量測(cè)定取樣品測(cè)定液5.0ul進(jìn)樣，測(cè)出乙醇峰高或峰面積，依據(jù)工作曲線或回歸方程計(jì)算測(cè)定液中乙醇含量(％)。
3.4.2工作曲線制作取20±0.5度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液適量用20±0.5度純水稀釋成乙醇含量(V/V)分別為0.20％、0.40％、0.60％、0.80％、1.00％的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度。分別取上述乙醇標(biāo)準(zhǔn)系列濃度5.0ul進(jìn)樣，測(cè)得乙醇的峰高或峰面積。以乙醇的含量百分濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的峰高或峰面積為縱坐標(biāo)，制作工作曲線，或用最小二乘法計(jì)算其回歸方程。
2.4.3計(jì)算樣品中乙醇含量乙醇含量(C2H5OH，％，V/V)＝樣品測(cè)定液中乙醇含量×ff一稀釋倍數(shù)(1，50或100)。
6.試驗(yàn)結(jié)果以15％的蔗糖為發(fā)酵底物，在30攝氏度的發(fā)酵條件下，經(jīng)過70小時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中乙醇的量，發(fā)現(xiàn)突變菌株(44.3g/l)與野生菌XW101(37.2g/l)相比乙醇的產(chǎn)量得到明顯提高。
權(quán)利要求
1.一種重組質(zhì)粒，特征是含有插入了四環(huán)素抗性基因的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因。
2.權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，是權(quán)利要求1所述的果聚糖蔗糖酶基因與克隆載體連接、被內(nèi)切酶消化后插入在自殺性質(zhì)粒中的。
3.權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒，其中運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌XW101。
4.權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒的制備方法，是將權(quán)利要求1所述的果聚糖蔗糖酶基因連接到克隆載體上，用內(nèi)切酶消化，并將其插入到自殺性質(zhì)粒中。
5.權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒的制備方法，所述克隆載體包括pGEM-T、pUC19、pBS、pACYC184。
6.權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒的制備方法、所述自殺性質(zhì)粒包括質(zhì)粒pSUP202、pPHU281和pSZ21。
7.一種用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工程菌，特征是含有權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒。
8.權(quán)利要求7所述的工程菌，特征是含有權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒。
9.權(quán)利要求7或8所述的工程菌的構(gòu)建方法，特征是將權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒導(dǎo)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌后，篩選具有四環(huán)素抗性的突變菌株。
10.權(quán)利要求7或8所述的工程菌的用途，是用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌果聚糖蔗糖酶基因突變的工程菌及其構(gòu)建和用途。本發(fā)明將四環(huán)素抗性基因插入到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因中，并將得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌后，篩選具有四環(huán)素抗性的突變菌株即為目標(biāo)工程菌。本發(fā)明得到的上述工程菌具有四環(huán)素抗性，使果聚糖蔗糖酶基因失活，不能將發(fā)酵底物蔗糖轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物果聚糖，從而提高了將底物轉(zhuǎn)化為乙醇的效率。
文檔編號(hào)C12N9/24GK1746311SQ20041000954
公開日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月10日
發(fā)明者徐玉泉, 李淑英, 林敏 , 陳明 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所