專利名稱：編碼黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的d－赤糖酸4－磷酸－脫氫酶pdxr的dna和維生素b的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種來源于苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium melioti)的、編碼與維生素B6的生物合成相關的新的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴的D-赤糖酸4-磷酸(EN4P)(flavin adenine dinucleotide-dependent D-erythronate4-phosphate)脫氫酶的DNA，和一種用含有該DNA的載體轉化的重組微生物。還涉及利用該重組微生物生產維生素B6的方法。
本發(fā)明中使用的“維生素B6”包括吡哆醇(PN)、吡哆醛和吡哆胺。維生素B6是人類或其他動物所必不可缺的維生素，被用作藥物的原料或食物添加劑。
使用中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)[又稱根瘤菌屬(Rhizobium)DeLajudie et al.，Int.J.Syst.Bacteriol.44715-733(1994)]的苜蓿中華根瘤菌進行維生素B6的發(fā)酵生產已有記載(EP 765,938)。但是在利用微生物制備維生素B6的過程中維生素B6的生產效率不夠高，需要構建具有更高的維生素B6生產能力的新微生物。
在大腸桿菌中的4-PHT途徑如下4-PHT合成起始于D-赤蘚糖4-磷酸(E4P)，由E4P脫氫酶將其氧化為EN4P，進一步由EN4P脫氫酶氧化為2-酮基-EN4P，由轉氨酶轉氨形成4-PHT。這三個酶，E4P脫氫酶、EN4P脫氫酶和氨基轉移酶，由三個基因編碼，分別名為epd、pdxB和serC，對需要NAD+作為輔酶進行酶反應的大腸桿菌EN4P脫氫酶僅有一篇報導[Zhao etal.，J.Bacteriol.1772804-2812(1995)]。
另一方面，在苜蓿中華根瘤菌中4-PHT是從甘氨酸和羥基乙醛合成的。但是與這個反應相關的基因仍然沒有被鑒定出來。為了鑒定這一基因，我們獲得了一個在形成4-PHT方面有缺陷的維生素B6缺陷突變株苜蓿中華根瘤菌IFO 14782。并且我們獲得了一個基因，命名為pdxR，其能補足該維生素B6缺陷突變株，我們發(fā)現pdxR編碼一個新的FAD依賴的EN4P脫氫酶。
根據本發(fā)明，通過利用具有包括含有pdxR的載體的重組質粒的中華根瘤菌屬微生物進行發(fā)酵，有可能極大地提高維生素B6的生產效率。通過培養(yǎng)所述微生物可以方便地在培養(yǎng)液中生產維生素B6，并能以期望的純度回收維生素B6。
本發(fā)明提供了編碼來源于中華根瘤菌屬的FAD依賴的EN4P脫氫酶的DNA；攜帶含有編碼該EN4P脫氫酶的DNA的DNA的表達載體；攜帶該表達載體的轉化的宿主細胞；在該宿主細胞中產生的具有FAD依賴的EN4P脫氫酶活性的多肽；和利用該宿主細胞生產維生素B6的過程。
除非另作說明，本發(fā)明中所使用的全部科學和技術術語都具有本領域通用的含義。
本發(fā)明是以定名為pdxR的基因的發(fā)現以及利用該基因改善維生素B6的生產為基礎的，pdxR基因編碼FAD依賴的EN4P脫氫酶，該FAD依賴的EN4P脫氫酶與苜蓿中華根瘤菌的維生素B6生物合成有關。
在本發(fā)明的驗證過程中，我們發(fā)現了一個基因，名為pdxR，其補足了維生素B6缺陷突變株苜蓿中華根瘤菌IFO 14782(DSM 10226)，該突變株的生長需要4-羥基-L-蘇氨酸(在下文中稱為4-HT)或維生素B6。pdxR與任何已公開的與大腸桿菌的維生素B6生物合成有關的基因都沒有同源性。
通過對苜蓿中華根瘤菌菌株1021[Galibert et al.，Science293668-672(2001)]的基因組數據庫的檢索，pdxR的推測的氨基酸序列暗示PdxR是一種諸如脫氫酶、還原酶和氧化酶的氧化還原酶。但是很難預測PdxR的底物。已發(fā)現的是pdxR基因不僅能補足維生素B6缺陷突變株苜蓿中華根瘤菌IFO 14782，還能補足缺乏EN4P脫氫酶的大腸桿菌pdxB-突變株。這些發(fā)現表明PdxR與苜蓿中華根瘤菌中維生素B6生物合成的4-PHT途徑有關，并且pdxR編碼催化EN4P氧化成2-酮基-EN4P的氧化還原酶。
通過進一步的實驗，發(fā)現本發(fā)明中苜蓿中華根瘤菌的pdxR基因編碼的基因產物包含FAD并且利用電子受體催化EN4P的氧化，這些電子受體諸如細胞色素c、2，6-二氯酚吲哚酚(2，6-dichlorophenolindophenol)(DCIP)、或鐵氰化物，但不是O2，NAD+或NADP+。證據表明pdxR基因產物是一種有電子受體的脫氫酶而不是氧化酶，并且與大腸桿菌的有NAD+的EN4P脫氫酶完全不同。
本發(fā)明涉及包括編碼PdxR的DNA序列的DNA序列，其中PdxR是一種與維生素B6的合成有關的FAD依賴的EN4P脫氫酶，編碼PdxR的DNA序列公開于序列表中，還涉及它們的互補鏈，或包括這些序列的DNA序列，與這些序列及其片段雜交、優(yōu)選的在標準條件下雜交的DNA序列，和由于遺傳密碼的簡并性、在標準條件下不與這些序列雜交但編碼具有完全相同的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
雜交的“標準條件”在本文中是指本領域的技術人員通常使用的、用以檢測特定的雜交信號的條件，或優(yōu)選的是指所謂的嚴緊雜交和非嚴緊洗脫條件，或更加優(yōu)選的是指所謂的中度嚴緊條件，或進一步優(yōu)選的是指所謂的嚴緊雜交和嚴緊洗脫條件。例如，2×SSC和0.5％ SDS在45℃雜交1小時、0.1×SSC和0.5％ SDS在60℃洗脫1小時的條件。
本發(fā)明還包括與SED ID NO1的DNA序列或其片段具有至少80％到85％，優(yōu)選的至少86％到90％，更優(yōu)選的至少91％到95％，特別優(yōu)選的超過95％的同一性的DNA序列。
本發(fā)明還涉及具有FAD依賴的EN4P脫氫酶活性的多肽，其是本案的多肽的功能性衍生物。這種功能性衍生物定義為根據本發(fā)明的氨基酸序列，通過添加、插入、刪除和/或替換所述序列的一個或多個氨基酸殘基，同時仍然具有所述FAD依賴的EN4P脫氫酶的活性的衍生物。這種功能性衍生物既可以通過已知的化學合成多肽法，也可以通過目前已知的方法、根據本發(fā)明公開的DNA序列通過重組法合成。目前已知許多通常不會改變分子活性的蛋白質和多肽中的氨基酸變換。最常發(fā)生的變換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly，以及它們的反向變換。
此外，根據本發(fā)明的多肽包括根據SEQ ID NO2的多肽，特別是那些具有FAD依賴的EN4P脫氫酶的活性的多肽，以及那些與SEQ ID NO2的多肽具有至少80％到85％，優(yōu)選的至少86％到90％，更優(yōu)選的至少91％到95％，特別優(yōu)選的超過95％的同一性，并具有所提及的活性的多肽。
為了高效的表達pdxR或編碼FAD依賴的EN4P脫氫酶的DNA序列，可以使用多種啟動子；例如，存在于pdxR基因上游的原始啟動子，抗性基因例如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的啟動子(lac)，苜蓿中華根瘤菌的核糖體小亞基的啟動子(pS1)，trp啟動子，tac啟動子，trc啟動子，和任何能在包括諸如大腸桿菌和苜蓿中華根瘤菌的細菌的微生物宿主體內具有功能的啟動子。
為了達到前述的目標，可以向編碼序列中導入在宿主細胞中可操作的其他調控元件，例如Shine-Dalgamo(SD)序列(例如，AGGAGG等，包括在宿主體內可操作的自然的和合成的序列)和轉錄終止子(反向重復結構包括任何在宿主細胞中可操作的自然的和合成的序列)，與上述啟動子共同使用。
可以使用各式各樣的宿主/克隆載體組合來克隆該雙鏈DNA?？寺≥d體通常是質粒或噬菌體，其包含復制起點、調控元件、包括多克隆位點的克隆位點和選擇性標記，例如抗生素抗性基因，包括氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、鏈霉素、慶大霉素、壯觀霉素(在下文中分別稱為Ap、Tc、Cm、Km、Nm、Sm、Gm、Sp)等。
用于在大腸桿菌中表達目的基因的優(yōu)選的載體選自任何常用于大腸桿菌的載體，例如pBR322或它的衍生物包括pKK223-3、pUC18和pBluescriptII，pACYC184或它的衍生物，和來源于寬宿主范圍質粒的載體例如RK2和RSF1010。用于在苜蓿中華根瘤菌中表達目的基因的優(yōu)選的載體選自任何可以在這些微生物以及優(yōu)選的克隆微生物例如大腸桿菌中復制的載體。優(yōu)選的載體是寬宿主范圍載體，例如pVK100、pRK290，pLAFR1，和RSF1010，或包含了在苜蓿中華根瘤菌中的復制起點功能以及在大腸桿菌中另一個起點功能的載體。
為了構建攜帶表達載體的宿主細胞，可以使用各種DNA轉移方法，包括轉化、轉導和接合(conjugal mating)。構建轉化的宿主細胞的方法可以選自分子生物學領域中公知的方法。通常的轉化和轉導系統(tǒng)可用于大腸桿菌。接合系統(tǒng)可廣泛地用于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，包括大腸桿菌和苜蓿中華根瘤菌。
在4-PHT途徑中具有突變點的維生素B6缺陷突變株可以通過轉座子誘變來構建。
轉座子是一種獨特的DNA片段，其具有移動到基因組中的能力。轉座子之一的Tn5是一個5,818bp的復合轉座子，包括兩個反向重復和三個帶來抗生素抗性的基因。Tn5具有低的插入特異性從而可以完成Tn5誘變[Meadeet al.，J.Bacteriol.149114-122(1982)]。攜帶來源于假單胞菌屬的Tn5并且不在苜蓿中華根瘤菌中復制的自殺載體pSUP2021，可用于介導Tn5插入到苜蓿中華根瘤菌的基因組中[Simon et al.，BIO/TECHNOLOGY 1784(1983)]。幫助不動質粒轉移到其他微生物內的輔助質粒，例如pRK2013(ATCC37159)，可以被使用。
自殺載體上的Tn5可以通過三親接合法(tri-parental conjugal mating)按下述方式導入苜蓿中華根瘤菌IFO 14782。以苜蓿中華根瘤菌作為受體菌株，攜帶輔助質粒的大腸桿菌作為輔助菌株，以及攜帶供體質粒的大腸桿菌作為供體菌株，分別培養(yǎng)并混合在一起。在平板上混合培養(yǎng)之后，具有Tn5的苜蓿中華根瘤菌已將Tn5整合到其基因組中，其可以在包含適當抗生素的瓊脂平板上選擇出來。在這些抗生素抗性的突變株中，那些很少產生或不產生維生素B6的突變株可以利用維生素B6檢測平板檢測它們產生的維生素B6的量而被選擇出來。很少產生或不產生維生素B6的突變株也可以通過維生素B6途徑中對中間物的需求來檢查。通過這些補充實驗，可以提供在途徑中的突變點。
補足維生素B6缺陷突變株的DNA片段可以從苜蓿中華根瘤菌的基因庫中篩選出來?；驇煊纱罅窟B接到裝配型質粒中的部分消化的染色體DNA組成，并轉入維生素B6缺陷突變株。目標DNA片段補足的轉結合子可以通過使其在無維生素B6的平板上生長來獲得。該片段的DNA序列可以通過本領域目前已知的方法來測定。
過量表達PdxR來研究其在宿主細胞中的產物的功能。在準備PdxR的過量表達時，聚合酶鏈式反應(PCR)適用于添加限制酶識別位點以使pdxR處于一個強啟動子的控制之下。PCR引物按照pdxR和側翼區(qū)的DNA序列來合成，一個引物在其5′端包含限制酶識別序列。包含pdxR的DNA片段可以利用引物和苜蓿中華根瘤菌的染色體DNA通過PCR法擴增。擴增的DNA可以按照期望的結構連接到如上所述的可在大腸桿菌中復制的載體中。擴增的DNA所插入的質?？梢酝ㄟ^目前已知的方法來選擇，擴增區(qū)域的序列也可通過目前已知的方法來確定。
為了從培養(yǎng)獲得的細胞中制備無細胞提取物，可以使用一般的方法，如超聲處理、玻璃珠細胞破碎，或French壓力勻漿機。如果需要，也可以在用上述方法進行裂解之前使用水解酶例如溶菌酶或消解酶在15℃-45℃，優(yōu)選的在20℃-40℃處理1-3小時。例如，在培養(yǎng)液進行離心之后，所獲得的細胞使用0.85％(w/v)的鹽水洗滌，懸浮于緩沖液中，例如pH7.5的Tris-HCl緩沖液。在細胞破碎之后，對所得溶液進行離心以分離細胞碎片，其懸浮物用作無細胞提取物。
蛋白質濃度通過Lowry法確定。
當本發(fā)明的EN4P脫氫酶與電子受體同時存在于適當的溶液中時，有電子受體的EN4P脫氫酶活性可以通過觀察或測量由電子受體例如細胞色素c、DCIP或鐵氰化物從氧化形式變?yōu)檫€原形式所產生的光度計顏色變化來驗證。
本發(fā)明中獲得的轉化的宿主細胞培養(yǎng)在包含可同化的碳源、可消化的氮源、無機鹽和其他生長所必須的營養(yǎng)的培養(yǎng)基中。關于碳源，可以使用例如葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、半乳糖、蔗糖、淀粉、糊精或甘油。關于氮源，可以使用例如蛋白胨、玉米漿、大豆粉末、酵母抽提物、肉膏、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、尿素或它們的混合物。進一步的，關于微量元素，可以使用鈣、鎂、鋅、錳、鈷和鐵的硫酸鹽、鹽酸鹽、或硫酸鹽。必要時，也可以將常規(guī)的營養(yǎng)因子、磷酸鹽離子的俘獲劑，或防泡劑例如碳酸鎂、氧化鋁、鋁英石、動物油、植物油或礦物油補充添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基的pH值可以是約5.0至約9.0，優(yōu)選的約6.5至約7.5。培養(yǎng)溫度可以是約10℃至約40℃，優(yōu)選的約25℃至約35℃。培養(yǎng)時間可以是約1天至約15天，優(yōu)選的約2天至約9天。在培養(yǎng)過程中，通風和攪動通常會帶來有利結果。
在培養(yǎng)之后，產生的維生素B6也可以從培養(yǎng)液中分離和純化。為了這個目的，利用維生素B6的各種性質，可以使用通常的用于從培養(yǎng)液提取某產品的過程。如此，例如從培養(yǎng)液中除去細胞，使懸浮物中目標物質吸附在活性炭上，然后進一步用離子交換樹脂洗提和純化?；蛘?，將培養(yǎng)物濾液直接加到離子交換樹脂上，在洗提之后，從酒精和水的混合物中將目標產物重結晶。
通過對Tn5插入誘變的篩選從苜蓿中華根瘤菌IFO 14782(DSM 10226)中獲得了維生素B6缺陷突變株苜蓿中華根瘤菌16C18。這個具有4-PHT途徑上的突變點的突變株對于分離編碼EN4P脫氫酶的pdxR基因是必不可少的，根據布達佩斯條約于2002年9月17日將其保藏在位于哥廷根(德國)的DSMZ(德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏公司)，登記入冊號DSM 15210。
以下借助幾個實施例更詳細的解釋本發(fā)明。下文是用來簡要地說明所使用的材料和方法并用實驗性的例子和比較性的例子來支持本發(fā)明，但是本發(fā)明不能被理解為是僅限于此的。
實施例1[A]維生素B6缺陷的Tn5插入突變株苜蓿中華根瘤菌16C18的分離維生素B6缺陷突變株是從具有天然的維生素B6高產量的苜蓿中華根瘤菌IFO 14782的Tn5插入突變株中篩選出來的。Tn5通過下述的三親接合法導入苜蓿中華根瘤菌IFO 14782。苜蓿中華根瘤菌IFO 14782作為受體菌株接種在5ml由1％胰化蛋白胨(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)、0.5％ Bacto酵母抽提物(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)、0.5％ NaCl、0.061％ MgSO4·7H2O和0.036％ CaCl2·2H2O組成的液體LBMC培養(yǎng)基中，在30℃、140rpm搖動孵育16小時。將培養(yǎng)物(400μl)轉移到新鮮培養(yǎng)基中再孵育6小時。攜帶pRK2013(ATCC 37159)的大腸桿菌HB101作為輔助菌株，接種在5ml由1％胰化蛋白胨、0.5％ Bacto酵母抽提物和0.5％ NaCl組成的、包含50μg/ml Km的液體LB培養(yǎng)基中，在37℃、140rpm搖動孵育16小時。將培養(yǎng)物(100μl)轉移到新鮮培養(yǎng)基中再孵育6小時。攜帶pSUP2021的大腸桿菌HB101作為Tn5供體菌株，接種在5ml包括50μg/ml Km的液體LB培養(yǎng)基中，在37℃、140rpm搖動孵育16小時。將培養(yǎng)物(100μl)轉移到新鮮培養(yǎng)基中再孵育6小時。收獲每一種菌株，將細胞以1∶1∶4(v/v/v)的比例混合。將混合物放在鋪于LBMC瓊脂平板上的硝化纖維濾紙上。平板在30℃孵育20小時之后，刮下濾紙上的細胞懸浮于0.85％無菌生理鹽水中。適當稀釋懸浮液，涂布在包含20μg/ml Nal(用于選擇苜蓿中華根瘤菌IFO 14782)和50μg/ml Nm(用于選擇Tn5)的LBMC平板上。將平板在30℃孵育4天后，在平板上出現了約10,000個菌落。Nm抗性菌落的頻率為4.2×10-8/受體。
將這些菌落在含有一些抗生素的LBMC平板上劃線并在30℃孵育2天。將在平板上生長的細胞接種到包含作為維生素B6指示菌的卡爾斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)ATCC 9080的維生素B6檢驗平板(表1)上。30℃孵育2天后，獲得了一個沒有卡爾斯伯糖酵母ATCC 9080暈輪的菌落。該菌株被命名為苜蓿中華根瘤菌16C18。16C18菌株不能在EMM平板(表1)上生長，而親本菌株苜蓿中華根瘤菌IFO 14782能生長。進一步發(fā)現，苜蓿中華根瘤菌16C18能在補充了4mg/L的4-HT或400μg/L的PN的EMM平板上生長。這一結果表明，苜蓿中華根瘤菌16C18是一個在4-PHT途徑中具有突變點的維生素B6缺陷突變株。
表1培養(yǎng)基成分(維生素B6檢測平板和EMM平板) 補足苜蓿中華根瘤菌16C18在EMM平板上生長的DNA片段的分離構建苜蓿中華根瘤菌IFO 14782的基因庫作為獲得能使苜蓿中華根瘤菌16C18在無4-HT或PN的EMM平板上生長的DNA片段的工具。利用QIAGEN基因組工具(QIAGEN，GmbH，Germany)制備苜蓿中華根瘤菌IFO14782的染色體DNA。使用EcoR I消化染色體DNA。部分消化的DNA在0.6％凝膠上進行瓊脂糖凝膠電泳。剪下包含15kb-35kb DNA片段的凝膠塊，利用電泳將DNA片段從凝膠上洗脫下來。洗脫的DNA片段用乙醇沉淀并通過離心回收。同時，400ng的pVK100質粒用EcoR I完全消化，并用堿性磷酸酶脫去磷酸。處理過的pVK100利用連接試劑盒(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)與上述苜蓿中華根瘤菌IFO 14782的染色體DNA片段(1μg)進行連接。對這些DNA進行噬菌體(Amersham Biosciences Crop.，NJ，USA)的體外包裝。然后，使用包含苜蓿中華根瘤菌IFO 14782的多個DNA片段的噬菌體，感染在指數生長期收獲的大腸桿菌ED8767[Murray et al.，Mol.Gen.Genet.15053-61(1977)]。將感染的大腸桿菌涂在包含10μg/l Tc的LB培養(yǎng)基上。在37℃孵育17小時之后，在平板上出現約10,000個菌落。將這些菌落同時刮下，在LB液體培養(yǎng)基中37℃孵育1小時，分配到帶蓋的小試管中，在-120℃保存。在大腸桿菌ED8767中的基因庫通過下述三親接合法導入苜蓿中華根瘤菌16C18用于篩選能在無PN的EMM平板上生長的轉結合子。
苜蓿中華根瘤菌16C18作為受體菌株，接種到液體LBMC培養(yǎng)基中，在30℃、140rpm搖動孵育16小時。將培養(yǎng)物(400μl)轉移到新鮮的相同培養(yǎng)基中再孵育6小時。攜帶pRK2013的大腸桿菌HB101作為輔助菌株，接種到包含50μg/ml Km的液體LB培養(yǎng)基中，在37℃、140rpm搖動孵育16小時。將培養(yǎng)物(100μl)轉移到新鮮的培養(yǎng)基中再孵育6小時。冷凍保藏的攜帶苜蓿中華根瘤菌IFO 14782基因庫的大腸桿菌ED8767作為供體菌株，接種到包含10μg/ml Tc的液體LB培養(yǎng)基中，在30℃、140rpm孵育2小時。在收獲每一菌株之后，以1∶1∶1的比例混合，混合的細胞放在鋪于LBMC瓊脂平板上的硝化纖維濾紙上。在30℃孵育20小時后，刮下濾紙上的細胞懸浮于0.85％無菌生理鹽水中。稀釋懸浮液，涂布在包含20μg/ml Nal(用于選擇苜蓿中華根瘤菌)和10μg/ml Tc(用于選擇質粒)的EMM平板上。在30℃孵育8天后，出現了4個菌落。制備這些菌落中的質粒，用限制酶消化并在瓊脂糖凝膠上進行分析。在這些質粒中，將一個具有23.0kb的插入物的質粒定為pSHT09。通過用EcoR I裂解pSHT09產生一個2.5kb的DNA片段，將該片段連接到在EcoR I位點打開的pVK100中，將連接混合物轉化到大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)。制備出現的菌落中的質粒，用限制酶消化并在瓊脂糖凝膠上進行分析。一個包含2.5kb插入物的質粒被命名為pVK-HTS1。通過如上所述的三親接合法將該質粒轉入苜蓿中華根瘤菌16C18。攜帶pVK-HTS1的苜蓿中華根瘤菌16C18(苜蓿中華根瘤菌16C18/pVK-HTS1)能在無PN或4-HT的EMM平板上生長。這表明在2.5kb DNA片段中有一個能補足苜蓿中華根瘤菌16C18的生長的基因。補足基因的詳述在實施例1[B]中獲得的2.5kb片段的DNA序列使用ALFred DNA測序儀(Amersham Biosciences Crop.，NJ，US)測序。在這個序列中，有一個開放閱讀框(下文稱為ORF)，其長度為1491bp(SEQ ID NO1)。ORF的序列與登記入冊號為NC 003047的SMc00985(951316-952806，互補體(complement))的CDS區(qū)相同。CDS的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO2)被預測是一推定的氧化還原酶，但是還沒有鑒定出它的底物。將該ORF命名為pdxR。攜帶pdxR的重組質粒按如下方法構建。使用優(yōu)勢-HF PCR試劑盒(ClontechLaboratories，Inc.CA，USA)，用10pmol的兩個引物SEQ ID NO3和4，從100ng苜蓿中華根瘤菌IFO 14782的染色體DNA中擴增出包含pdxR和側翼區(qū)的DNA片段。用于氨基末端的引物被設計為包含緊跟在EcoR I位點之后的起始密碼子。反應條件如下在94℃保持15秒后，以94℃ 15秒、50℃15秒、68℃三分鐘進行25個循環(huán)。將合成的2.2kb PCR產物使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Japan K.K.，Japan)插入到pCRII-TOPO載體中。確定擴增區(qū)中的pdxR序列與登記入冊號為NC 003047的SMc00985的相應CDS區(qū)(951316-952806，互補體)相同。用EcoR I切下相應于擴增區(qū)的1.7kb DNA片段，該片段使用QIAEXII(QIAGEN，GmbH，Germany)從瓊脂糖凝膠中回收。將1.7kb片段連接到用EcoR I打開并用堿性磷酸酶脫去磷酸的pKK223-3表達載體(Amersham Biosciences Corp.，NJ，USA)。在用連接混合物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞(Takara Bio.Inc.，Shiga，Japan)之后，制備轉化細胞中的質粒，用限制酶消化并在瓊脂糖凝膠上分析。獲得了一個重組質粒pKK-pdxR，其中pdxR基因被插入到pKK223-3的EcoR I位點并與載體上tac啟動子處于相同的方向。使用QIAGEN Midi試劑盒(QIAGEN GmbH，Germany)利用大腸桿菌JM109/pKK-pdxR制備pKK-pdxR質粒。獲得的pKK-pdxR質粒用BamH I消化。產生的包含tac啟動子和pdxR的2kb片段從瓊脂糖凝膠中提純。將2kb片段連接到用BglII打開并用堿性磷酸酶脫去磷酸的pVK100上。用連接混合物轉化大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞(TakaraBio Inc.，Shiga，Japan)，制備轉化細胞中的質粒，用限制酶消化并在瓊脂糖凝膠上分析。獲得了一個重組質粒pVK-PdxR，其中tac啟動子和pdxR基因被插入到pVK100的BglII位點并與Km抗性基因反向。
通過如實施例1[B]所述的三親接合法將獲得的pVK-pdxR導入苜蓿中華根瘤菌16C18，但其中選擇平板是包含20mg/L Nal和10mg/L Tc的LBMC平板。獲得了在選擇平板上生長的轉結合子，查實了轉結合子中的質粒具有pVK-pdxR相同的結構。然后，將轉結合子在包含50mg/L Nm和10mg/L Tc的EMM平板上劃線。在30℃孵育后，所有檢驗過的轉結合子都能在平板上生長，而苜蓿中華根瘤菌16C18/pVK100不能生長。這表明處在tac啟動子下的擴增的pdxR能夠補足苜蓿中華根瘤菌16C18。
實施例2pdxR基因產物的酶功能和特點[A]pdxR基因對大腸桿菌PdxB-突變株的補足將實施例1[C]中獲得的pKK-pdxR轉入大腸桿菌WG1012，大腸桿菌WG1012是PdxB-突變株(Dempsey，W.B.，J.Bacteriol.，vol.100，p.295，1969)。將生成的轉化細胞和親本菌株大腸桿菌WG1012分別在含有和不含PN的EMM平板上劃線。在37℃孵育16小時后，所有測試的轉化細胞都可以在無PN的EMM平板上生長，而大腸桿菌WG1012不能生長。這表明苜蓿中華根瘤菌的pdxR基因產物具有大腸桿菌中pdxB基因產物相同的功能，pdxB基因產物能將EN4P轉化為2-酮基-EN4P。EN4P氧化還原酶的酶反應系統(tǒng)(1)產生pdxR基因產物的微生物的構建和無細胞提取物的制備通過實施例1[C]所述的方法將pVK-pdxR導入苜蓿中華根瘤菌16C18獲得了一個轉結合子克隆苜蓿中華根瘤菌16C18/pVK-pdxR，使苜蓿中華根瘤菌16C18和苜蓿中華根瘤菌16C18/pVK-pdxR在包含6ml種子培養(yǎng)基(seed medium)的試管中于28℃生長17小時，該種子培養(yǎng)基由1％葡萄糖、0.5％ Polypepton(Nihon Pharmaceutical Co.，Osaka，Japan)、0.2％ Bacto酵母抽提物、0.1％ KH2PO4、0.05％ MgSO4·7H2O、0.001％ MnSO4·5H2O和0.001％FeSO4·7H2O組成。
將種子培養(yǎng)基(每個4ml)轉移到包含200ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml燒瓶中，該發(fā)酵培養(yǎng)基由4％葡萄糖、4％ Polypepton S(Nihon Pharmaceutical Co.，Osaka，Japan)、0.8％ Bacto酵母抽提物、0.05％ MgSO4·7H2O、0.05％MnSO4·5H2O、0.001％ FeSO4·7H2O和一滴Actocol(Takeda Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)組成。燒瓶在旋轉搖動器(180rpm)中于28℃搖動。在培養(yǎng)72小時后，通過10,400×g離心10分鐘，分別從2升培養(yǎng)液中獲得了35.3g苜蓿中華根瘤菌16C18和35.5g苜蓿中華根瘤菌16C18/pVK-pdxR濕細胞，用200ml 0.85％NaCl溶液洗滌2次，保存在-30℃?zhèn)溆谩?br> 慢慢地解凍凍結的細胞，用200ml 10mM pH7.5 Tris-HCl緩沖液懸浮。使懸浮液以800kg/cm2的壓力通過French壓力篩。將勻漿以37,000×g離心90分鐘除去細胞碎片，每個165ml的上清液被用作無細胞提取物(CFE)，苜蓿中華根瘤菌16C18和苜蓿中華根瘤菌16C18/pVK-pdxR中的蛋白質含量分別是5,030mg和5,042mg。
為了證實PdxR的表達，每個CFE(5ml)以4升10mM pH7.5 Tris-HCl緩沖液進行透析一整夜，在10％(w/v)凝膠上進行SDS-PAGE并用考馬斯亮藍(Rapid Stain CBB Kit，nacalai tesque Japan)著色。在苜蓿中華根瘤菌16C18/pVK-pdxR中檢測到一個期待的分子大小(53.0kDa)的多肽的過表達，而在苜蓿中華根瘤菌16C18中沒有檢出。因此，將CFE用于進一步的研究。
(2)無細胞提取物的EN4P氧化還原酶活性根據Horecker的方法[Methods in Enzymology 3172-174(1957)]通過溴的氧化從E4P(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO.，USA)制備EN4P。產物通過負快原子轟擊質譜分析(Jeol SX-102/102質譜儀)確定為m/z 215(M-H)-，產物的色譜性質與用Zhao等人的方法[J.Bacteriol.1772804-2812(1995)]制備的物質的色譜性質相同。
利用實施例2[B](1)中制備的CFE來研究PdxR的酶反應系統(tǒng)。如下述，利用Inouye等人用來分析肌氨酸氧化酶的、改進的4-氨基安替比林過氧化物酶系統(tǒng)，通過觀測過氧化氫的形成所導致的顏色變化(從無色的到帶粉紅色的)，來檢測CFE中用氧的EN4P氧化酶活性。反應混合物(150μl)包含50mM pH7.0的磷酸鉀緩沖液、2.3mM EN4P、0.47mM 4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)(Wako Pure chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)、2mM苯酚(Wako Pure chemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)、19U馬辣根過氧化酶(Sigma Chemical Co.)和CFE(0.16mg蛋白質)，在室溫(21℃)或在37℃觀察反應混合物的顏色變化。但是，10分鐘之后，從苜蓿中華根瘤菌16C18或苜蓿中華根瘤菌16C18/pVK-pdxR制備的CFE的反應混合物在兩種溫度都沒有發(fā)生顏色變化，而過氧化氫標準溶液產生相應于其濃度的粉紅色。根據這個結果，確定了兩種CFE在有氧的情況下都沒有EN4P氧化酶活性。
通過NADH或NADPH的形成來檢測含NAD+或NADP+的CFE中的EN4P脫氫酶活性，NADH或NADPH的吸收峰在340nm。用于分析EN4P脫氫酶活性的反應混合物(150μl)包含33mM pH7.0的磷酸鉀緩沖液、2.3mMEN4P、1mM NAD+或NADP+和從苜蓿中華根瘤菌16C18或苜蓿中華根瘤菌16C18/pVK-pdxR制備的CFE(各0.16mg蛋白質)。在UV-VIS記錄式分光光度計UV 2200(Shimadzu Instruments，Inc.，Kyoto，Japan)中，在室溫監(jiān)測一分鐘內A340的升高，但是在任何CFE的酶反應混合物中都沒有觀測到A340的升高。因此，確定兩種CFE都不具有NAD+或NADp+依賴的EN4P脫氫酶活性。
通過電子受體從氧化形式形成還原形式導致的顏色變化，在室溫(21℃)檢測有電子受體存在的CFE中的EN4P脫氫酶活性。反應混合物(150μl)包含33mM pH7.0磷酸鉀緩沖液、2.3mM EN4P、CFE(0.16mg蛋白質)和例如2，6-二氯酚吲哚酚(0.091mM)(Wako Pure chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)(在下文中稱為DCIP)或鐵氰化物(1.3mM)(Wako Pure chemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)的電子受體。從苜蓿中華根瘤菌16C18/pVK-pdxR的細胞制備的CFE用于包含EN4P的酶反應系統(tǒng)時，DCIP和鐵氰化物分別在30秒和1分鐘的時間內發(fā)生了變色，但是當酶反應系統(tǒng)中存在苜蓿中華根瘤菌16C18/pVK-pdxR的CFE但不存在EN4P時，或酶反應系統(tǒng)存在苜蓿中華根瘤菌16C18的CFE、存在或不存在EN4P時，兩種電子受體都不會發(fā)生變色(表2)。這些結果表明pdxR基因產物利用例如DCIP或鐵氰化物的電子受體氧化EN4P。
表2反應混合物中電子受體的顏色變化
DCIP1)2，6-二氯酚吲哚酚，EN4P2)D-赤糖酸4-磷酸。
此外，在室溫(21℃)通過測量細胞色素c從氧化形式形成還原形式所導致的400-600nm光譜區(qū)的吸收光譜的變化，檢測了在上述有電子受體的EN4P脫氫酶酶反應系統(tǒng)中，用細胞色素c來代替DCIP或鐵氰化物所可能出現的情況。反應混合物(150μl)包含33mM pH7.0的磷酸鉀緩沖液、2.3mMEN4P、作為電子受體的80μM細胞色素c的氧化形式(來自馬心臟，SigmaChemical Co.)和CFE(0.16mg蛋白質)。使用UV-VIS記錄式分光光度計UV2200在室溫(21℃)監(jiān)測零時間和之后2、5、10、15和20分鐘的反應混合物的吸收光譜。零時間的吸收光譜在525nm僅僅有一個寬峰，但是2分鐘后的光譜在相應于還原形式的細胞色素c的550nm處出現了新的峰，并且550nm區(qū)的吸收在5、10、15和20分鐘后隨時間的增加而增加。這個結果表明在EN4P脫氫酶的酶反應系統(tǒng)中細胞色素c也充當電子受體。EN4P脫氫酶的性質(1)有電子受體的EN4P脫氫酶的提純在CFE中具有有電子受體的EN4P脫氫酶活性的pdxR基因產物用下述層析法提純。
(Q Sepharose HP層析法)將在實施例2[B](1)中獲得的苜蓿中華根瘤菌16C18/pVK-pdxR的CFE(3,055mg蛋白質)上樣至用10mM pH7.5的Tris-HCl緩沖液平衡的Qsepharose HP柱(直徑44mm、高12.5cm；Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。在用100ml包含0.1M KCl的10mM pH7.5 Tris-HCl緩沖液沖洗之后，以KCl 0.1到0.4M的線性梯度進行層析(總量，800ml)。在對每一分級流出物的一小部分用10mM pH7.5的Tris-HCl緩沖液進行透析一整夜后，通過在室溫(21℃)在600nm處測量由還原的DCIP形成所導致的吸光率下降，來監(jiān)測酶活性。分析混合物(150μl)包含33mM pH7.0磷酸鉀緩沖液、2.3mMEN4P、0.091mM DCIP和2μl透析樣品?；钚约壏衷?.37M的KCl濃度時被洗脫下來，以10mM pH7.5 Tris-HCl緩沖液進行收集和透析。
(Resource Q層析法)在Q sepharose HP層析法中獲得的透析的活性級分(58mg蛋白質)用10mM pH7.5 Tris-HCl緩沖液平衡的Resource Q柱6ml柱(AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)進行層析。用70ml包含0.1M KCl的10mM pH7.5 Tris-HCl緩沖液沖洗后，以KCl 0.1到0.4M的線性梯度進行層析。在用10mM pH7.5 Tris-HCl緩沖液對每個流出物進行透析之后，用與Qsepharose HP層析法中相同的方法測量酶活性?；钚约壏衷?.22M的KCl濃度時被洗脫下來，以10mM pH7.5 Tris-HCl緩沖液進行收集和透析。
(HiPrep 16/60聚丙烯酰胺葡聚糖S-200HR層析法)從之前步驟中獲得的透析樣品利用超濾作用(Centriplus YM-10以及Microcon YM-10濃縮器，Amicon Inc.，Beverly，Mass.，USA)濃縮到300μl。將樣品(21.6mg蛋白質)上樣至用50mM包含150mM KCl的Tris-HCl緩沖液平衡的HiPrep 16/60 sephacryl S-200HR柱(直徑16mm、高60cm；AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)上。在用10mM pH7.5 Tris-HCl緩沖液對每個流出物進行透析之后，用與Q sepharose HP層析法中相同的方法測量酶活性。活性級分在10％(w/v)凝膠上進行SDS-PAGE，用考馬斯亮藍著色。分析表明活性的級分是幾乎同質的，有一分子量為53kDa的多肽，其符合根據pdxR的DNA序列推測的基因產物的分子量。
(2)與PdxR蛋白質結合的黃素的表征為了表征與PdxR蛋白質結合的黃素，根據Cammack的方法[Biochem.J.10945-46(1968)]將硫酸銨分級分離法應用于實施例2[C](1)中最終純化的酶溶液。用1升80％(w/v)硫酸銨溶液對酶溶液(1ml，包含4.74mg蛋白質)進行透析一整夜，以34,800×g離心30分鐘收集在透析膜中生成的沉淀，溶于0.5ml的10mM pH 7.5 Tris-HCI緩沖液中，并用4升同樣的緩沖液透析一整夜。用10mM pH 7.5 Tris-HCI將透析的酶溶液的體積補充到1ml。
在室溫(21℃)觀察酶反應混合物中DCIP的變色，酶反應混合物包含33mM pH 7.0磷酸鉀緩沖液、2.3mM EN4P、用硫酸銨處理純化的PdxR(2.37μg蛋白質)、0.091mM 2，6-二氯酚吲哚酚和不同濃度的黃素單核苷酸(FMN)(Sigma Chemical Co.)或FAD(Sigma Chemical Co.)。在3分鐘時鑒定變色程度。
試驗得知，在反應混合物中FAD濃度大于0.014μM時發(fā)生DCIP的變色，但是在不存在黃素以及在任何濃度的FMN下都不發(fā)生變色，如表3所示。這些結果表明FAD是苜蓿中華根瘤菌的PdxR EN4P脫氫酶的輔酶。
表3黃素對反應混合物中DCIP變色的影響
(3)PdxR的底物特異性利用在實施例2[C](1)中制備的最終純化的酶溶液檢查PdxR的底物特異性。標準的酶活性測定按如下方式執(zhí)行基本的反應混合物(總容量150μl)包括33mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)、2.4μg蛋白質、0.091mM DCIP和加水至總體積144μl，在室溫(21℃)孵育1分鐘。然后，添加表4列出的6μl 57mM底物溶液使終濃度為2.28mM，將全部溶液在室溫孵育。用UV-VIS記錄式分光光度計UV 2200讀取并在21℃監(jiān)視1分鐘內EN4P脫氫酶的A600的減少。酶活性的一個單位定義為在上述分析系統(tǒng)中在EN4P脫氫酶的作用下1分鐘內還原1nmol DCIP所需酶的數量。試驗得知，PdxR僅僅氧化EN4P，不氧化其他測試的α-羥基酸。
表4PdxR的底物特異性
實施例3通過重組苜蓿中華根瘤菌生產維生素B6通過實施例1[C]中描述的三親接合法，將在實施例1[C]中獲得的pVK-pdxR導入苜蓿中華根瘤菌IFO 14782。獲得了在包含20mg/l Nal和10mg/L Tc的LBMC上生長的轉結合子。查實在轉結合子中的質粒與pVK-pdxR具有同樣的結構。這樣獲得的苜蓿中華根瘤菌IFO14782/pVK-pdxR和親本菌株苜蓿中華根瘤菌IFO 14782在LBMC瓊脂平板上30℃孵育48小時，將一接種環(huán)量的每個菌株接種到包含8ml種子培養(yǎng)基的試管中，然后使試管在往復振蕩機中在30℃以275rpm搖動，種子培養(yǎng)基由1％葡萄糖、1％玉米漿(corn steep liquor)(Nihon Syokuhin Kako Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)、0.2％ Bacto酵母抽提物、0.05％MgSO4·7H2O、0.001％MnSO4·5H2O、和0.001％FeSO4·7H2O組成，pH 7.0。
在搖動17小時后，將4ml的每種培養(yǎng)液轉入有兩個折流板的包含200ml生產培養(yǎng)基的500ml燒瓶，在旋轉振蕩機中在30℃以180rpm搖動，生產培養(yǎng)基由6％葡萄糖、4％玉米漿、0.8％ Bacto酵母抽提物、0.05％MgSO4·7H2O、0.05％MnSO4·5H2O、1％ Allophosite(Shinagawa Chemicals Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)、和0.025％ Actocol組成，pH 6.8。
在培養(yǎng)7天后，通過高壓液相色譜法(在下文中稱為HPLC)給每種培養(yǎng)液上清液中含有的維生素B6定量，用如下所述的4′-脫氧吡哆醇內標準法計算產生的維生素B6。為制備用于HPLC的樣品，200μl 500mg/l的4′-脫氧吡哆醇作為內部物質、50μl 60％高氯酸和500μl水，與500μl的吡哆醇標準溶液(0-100mg/L)或來自培養(yǎng)液的上清液混合。然后將混合物在冰上放置10分鐘。在18,000×g離心10分鐘后，混合物的一部分加載到下列柱上。分析條件如下柱，Capcell pak C18 SG120(4.6×250mm)(Shiseido Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)；流動相，0.1M高氯酸鈉，0.1M磷酸鉀和2％乙腈(pH 3.5)；柱溫度25-26℃；流速1.0ml/min；檢測器，紫外線(UV)(在292nm)。結果，苜蓿中華根瘤菌IFO 14782/pVK-pdxR每升產生76mg的吡哆醇，比親本苜蓿中華根瘤菌IFO 14782高約1.2倍(表5)。
表5苜蓿中華根瘤菌IFO 14782和苜蓿中華根瘤菌IFO 14782/pVK-pdxR的吡哆醇生產能力
實施例4從培養(yǎng)液中分離維生素B6從按實施例3描述的相同培養(yǎng)條件制備的苜蓿中華根瘤菌IFO14782/pVK-pdxR培養(yǎng)液中回收產生的維生素B6。每個提純步驟中的吡哆醇和它的濃度用如實施例3中描述的HPLC測定。
將兩升包含74mg/L維生素B6的培養(yǎng)了168小時的培養(yǎng)液在7,500rpm離心10分鐘。生成的上清液的pH值用1N HCl調節(jié)到3.1，然后將上清液上樣至塞滿350ml Amberlite CG 120(H+形式，100-200目，Rohm and HaasCompany，Philadelphia，Pennsylvania，USA)的柱(5.5×15cm)。用500ml去離子水洗柱，然后用5％氫氧化銨洗脫。減壓濃縮維生素B6級分。如此獲得的剩余物溶于10ml去離子水中，將該溶液充滿塞滿380ml Dowex 1×4(OH-形式，200-400目，Dow Chemical Co.，Ltd.，Midland，Michigan，USA)的柱(5.5×16cm)，用500ml去離子水洗滌。用0.1N HCl洗脫。將包含吡哆醇的級分減壓濃縮至小體積。將固體殘余溶于少量的熱乙醇后，使溶液在4℃保持過夜。生成的沉淀通過過濾收集，真空干燥得到119mg的粗結晶。從乙醇中重結晶得到熔點為160℃的91.6mg白色晶體。該產物的紅外吸收、紫外吸收和NMR光譜與那些真正的吡哆醇相符。
序列表<110>DSM IP資產公司(DSM IP ASSETS B.V.)<120>編碼黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的D-赤糖酸4-磷酸-脫氫酶PDXR的DNA和維生素B6的微生物生產<130>pdxR的序列(case19)<140>
<141>
<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1491<212>DNA<213>苜蓿中華根瘤菌<400>1atggccatcg gcacgcttga agcaaccacg ttgatccgag gcagggccat gaccaccgta 60cttccttctc ccgaactcat cgcctccttc gtcgatatcg tcgggcctgg caatgccctc 120accgcacccg ccgacacggc accctacctc gtcgagtccc gcgggctcta ccgcggcacg 180acgccgctcg tgctcaggcc cggctccgtc gaggaagttt cgctggtgat gcggcttgcg 240agtcagaccc gaacggcagt cgtgccgcag ggcggcaata ccggacatgt ggccggacag 300attccacgcg agggcaaagc cgacgtggtc ctttccctcg agcggctgaa ccgcatccgc 360gacatcgacc cggtcggcaa cgtgatcgtg gccgacgccg gctgtatcct ggcggacatc 420cagaaggccg ccgatgacgt cgaccggctt tttcccctgt cactcggctc ggaaggctct 480gcccggatcg gcggcaatct ttcgaccaat gccggcggca ctgccgtgct tgcctatggg 540aacatgcgcc agctctgcct ggggctggaa gtcgtgctcc cgaccgggga gatctgggat 600gggctcagac gcctcaggaa ggacaatacc ggctacgatc tgcgcgatct tttcatcggc 660gccgagggaa cgctcggcgt cataaccggc gccgttttga agctctttcc gaaaccgcgc 720ggccaccagg tggcctttgc cggcctcagg agcgtcgagg acgcacttac gcttttcgat 780cgggcaacaa gcgtctgcgg gccggccctg acgggcttcg aactgatgcc gcggctcggc 840atcgagttca ccacccggca catcgccggc gtcagagatc cgatggaaac gacgcatccg 900tggtacgcgc tgatcgatat ctccacctcg gataccgccg aaagcgcgga acggatggtg 960caagaccttc tcgaagccgt cattgccgac ggtctcgtcg aaaacgcggt catcgcccag 1020aacgaagcgc aacgcagagc gctctggcac atgcgagaaa gcatgtcgcc ggcacaaaag 1080cctgagggtg gctccatcaa gcatgacgtt tcggtcccgg tgtcgagcat tccggccttc 1140atgacggagg cggatgcgct ggtctccaag gccatccccg gcgcgcgcat ctgcgccttc 1200ggccatatgg gcgacggcaa tatccactac aacatctccc agcccgtcgg cgcggacaag 1260cagagctttc tcgatcggtg gcgcgagatc aatgcgatcg ttcacgccgt cgtgctcaaa 1320catgacggct cgatctctgc cgagcatggc atcggccagt tgaagcgaga cgaactcgcg 1380gcgatccgct cgccgatcga gatcgagctc atgcgacgga tcaagcacgc cttcgacccg 1440gcggggatca tgaaccccga taaggtgctg cgcgaggatc gaggcgagta a 1491<210>2<211>496<212>PRT<213>苜蓿中華根瘤菌<400>2Met Ala Ile Gly Thr Leu Glu Ala Thr Thr Leu Ile Arg Gly Arg Ala5 10 15Met Thr Thr Val Leu Pro Ser Pro Glu Leu Ile Ala Ser Phe Val Asp20 25 30Ile Val Gly Pro Gly Asn Ala Leu Thr Ala Pro Ala Asp Thr Ala Pro35 40 45Tyr Leu Val Glu Ser Arg Gly Leu Tyr Arg Gly Thr Thr Pro Leu Val50 55 60Leu Arg Pro Gly Ser Val Glu Glu Val Ser Leu Val Met Arg Leu Ala65 70 75 80
Ser Gln Thr Arg Thr Ala Val Val Pro Gln Gly Gly Ash Thr Gly His85 90 95Val Ala Gly Gln Ile Pro Arg Glu Gly Lys Ala Asp Val Val Leu Ser100 105 110Leu Glu Arg Leu Asn Arg Ile Arg Asp Ile Asp Pro Val Gly Asn Val115 120 125Ile Val Ala Asp Ala Gly Cys Ile Leu Ala Asp Ile Gln Lys Ala Ala130 135 140Asp Asp Val Asp Arg Leu Phe Pro Leu Ser Leu Gly Ser Glu Gly Ser145 150 155 160Ala Arg Ile Gly Gly Asn Leu Ser Thr Asn Ala Gly Gly Thr Ala Val165 170 175Leu Ala Tyr Gly Asn Met Arg Gln Leu Cys Leu Gly Leu Glu Val Val180 185 190Leu Pro Thr Gly Glu Ile Trp Asp Gly Leu Arg Arg Leu Arg Lys Asp195 200 205Asn Thr Gly Tyr Asp Leu Arg Asp Leu Phe Ile Gly Ala Glu Gly Thr210 215 220Leu Gly Val Ile Thr Gly Ala Val Leu Lys Leu Phe Pro Lys Pro Arg225 230 235 240Gly His Gln Val Ala Phe Ala Gly Leu Arg Ser Val Glu Asp Ala Leu245 250 255Thr Leu Phe Asp Arg Ala Thr Ser Val Cys Gly Pro Ala Leu Thr Gly260 265 270Phe Glu Leu Met Pro Arg Leu Gly Ile Glu Phe Thr Thr Arg His Ile275 280 285Ala Gly Val Arg Asp Pro Met Glu Thr Thr His Pro Trp Tyr Ala Leu290 295 300Ile Asp Ile Ser Thr Ser Asp Thr Ala Glu Ser Ala Glu Arg Met Val305 310 315 320Gln Asp Leu Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Gly Leu Val Glu Asn Ala325 330 335Val Ile Ala Gln Asn Glu Ala Gln Arg Arg Ala Leu Trp His Met Arg340 345 350Glu Ser Met Ser Pro Ala Gln Lys Pro Glu Gly Gly Ser Ile Lys His355 360 365Asp Val Ser Val Pro Val Ser Ser Ile Pro Ala Phe Met Thr Glu Ala370 375 380Asp Ala Leu Val Ser Lys Ala Ile Pro Gly Ala Arg Ile Cys Ala Phe385 390 395 400Gly His Met Gly Asp Gly Ash Ile His Tyr Asn Ile Ser Gln Pro Val405 410 415Gly Ala Asp Lys Gln Ser Phe Leu Asp Arg Trp Arg Glu Ile Asn Ala420 425 430Ile Val His Ala Val Val Leu Lys His Asp Gly Ser Ile Ser Ala Glu435 440 445His Gly Ile Gly Gln Leu Lys Arg Asp Glu Leu Ala Ala Ile Arg Ser450 455 460Pro Ile Glu Ile Glu Leu Met Arg Arg Ile Lys His Ala Phe Asp Pro465 470 475 480Ala Gly Ile Met Asn Pro Asp Lys Val Leu Arg Glu Asp Arg Gly Glu485 490 495<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>3gaattcatgg ccatcggca 19
<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>4ccacttccct tgtagtacga gct 2權利要求
1.一種包括編碼黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的D-赤糖酸4-磷酸脫氫酶PdxR的核苷酸序列的分離的DNA，所述核苷酸序列選自如下構成的組(a)由SEQ ID NO1或其互補鏈確定的DNA序列；(b)在標準條件下與(a)定義的DNA序列或其片段的互補DNA序列雜交的，并編碼具有黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的D-赤糖酸4-磷酸脫氫酶活性的多肽的DNA序列；(c)編碼具有(a)或(b)的DNA序列編碼的氨基酸序列的多肽的DNA序列；(d)與編碼包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的DNA具有至少80％的同一性，并編碼具有黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的D-赤糖酸4-磷酸脫氫酶活性的多肽的DNA序列；和(e)編碼包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽，并編碼具有黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的D-赤糖酸4-磷酸脫氫酶活性的多肽的DNA序列。
2.包含權利要求1中(a)到(e)的任何一種分離的DNA的載體或質粒。
3.用權利要求1中(a)到(e)中所述任何一種分離的DNA或權利要求2中所述載體或質粒轉化或轉染的宿主細胞。
4.根據權利要求3所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞屬于大腸桿菌屬或中華根瘤菌屬。
5.由權利要求1中(a)到(e)所述任何一種分離的DNA編碼的多肽。
6.根據權利要求5所述的多肽，其中所述多肽不利用O2、NAD+或NADP+催化D-赤糖酸4-磷酸的氧化。
7.根據權利要求6所述的多肽，其中所述多肽利用選自細胞色素c、2，6-二氯酚吲哚酚和鐵氰化物構成的組的電子受體催化D-赤糖酸4-磷酸的氧化。
8.生產權利要求5至7中任何一種具有黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的D-赤糖酸4-磷酸脫氫酶活性的多肽的方法，包括在有助于所述多肽生產的條件下培養(yǎng)權利要求3或4所述的宿主細胞。
9.用于維生素B6的生物生產的方法，包括在有助于維生素B6生產的條件下培養(yǎng)權利要求3所述的宿主細胞，并從培養(yǎng)物種回收維生素B6。
10.用于維生素B6的生物生產的方法，包括將權利要求1中(a)到(e)所述任何一種分離的DNA導入適當的宿主細胞，在有助于維生素B6生產的條件下培養(yǎng)所獲得的宿主細胞，并從培養(yǎng)物中回收維生素B6。
11.根據權利要求9或10所述的方法，其中所述宿主細胞屬于中華根瘤菌屬。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來源于苜蓿中華根瘤菌的、編碼與維生素B
文檔編號C12N15/53GK1685043SQ03822609
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月25日 優(yōu)先權日2002年9月27日
發(fā)明者星野達雄, 市川敬子, 田副正明 申請人:Dsm Ip資產公司