專(zhuān)利名稱(chēng)：生產(chǎn)l－抗壞血酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及EP 0 832 974 A2中公開(kāi)的Gluconobacter oxydans DSM4025的酶B在生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法中的用途。
從1934年“Reichstein方法”被建立以來(lái)，對(duì)L-抗壞血酸(維生素C)生物技術(shù)合成的可行性研究已經(jīng)進(jìn)行了很多年。微生物Gluconobacteroxydans DSM 4025或攜帶有Saccharomyces cerevisiae的D-阿拉伯糖酸-1，4-內(nèi)酯氧化酶基因的Escherichia coli、Candida albicans和Saccharomycescerevisiae能將L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯氧化成維生素C。Saccharomycescerevisiae和Candida albicans擁有D-阿拉伯糖脫氫酶，催化分別從D-阿拉伯糖和L-半乳糖產(chǎn)生D-阿拉伯糖酸-1，4-內(nèi)酯和L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯的過(guò)程。然而，未有報(bào)道描述用另外的L-己糖作為中間產(chǎn)物來(lái)對(duì)維生素C進(jìn)行生物生產(chǎn)的可能性，所述己糖是L-艾杜糖(L-idose)、L-古洛糖和L-塔羅糖(L-talose)，其具有與維生素C相應(yīng)的構(gòu)型(在C4和C5位置上)。
本發(fā)明提供了EP 0 832 974 A2中公開(kāi)的G.oxydans DSM 4025的酶B在從L-古洛糖、L-半乳糖、L-艾杜糖或L-塔羅糖，或從L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯(及其酸的形式，L-古洛糖酸)和從L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯(及其酸的形式，L-半乳糖酸)來(lái)生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法中的用途。
本發(fā)明還提供了EP 0 832 974 A2中公開(kāi)的G.oxydans DSM 4025的酶B在分別從L-古洛糖或L-半乳糖來(lái)生產(chǎn)L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯或其酸的形式L-古洛糖酸或L-半乳糖酸的方法中的用途。
EP 0 832 974 A2通過(guò)引用的方式被包括在本文內(nèi)，其中公開(kāi)了G.oxydans DSM 4025的酶B具有下列物理-化學(xué)屬性(a)在SDS-PAGE上分子量為大約60,000Da；(b)具有對(duì)一級(jí)及二級(jí)醇和醛的底物特異性；(c)在pH為大約6至大約9之間時(shí)，具有pH穩(wěn)定性；
(d)最佳pH是pH為大約8.0；以及(e)受Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+和Fe3+抑制。
此外，EP 0 832 974 A2中公開(kāi)了酶B的氨基酸序列和核苷酸序列，其在本序列表中由SEQ ID NO2和SEQ ID NO1所代表。從EP 0 832 974A2中已知酶B能將D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-山梨糖酮(D-sorbosone)、D-甘露醇、L-艾杜糖、甘油、D-葡萄糖酸、D-甘露糖酸分別轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖酸、L-山梨糖、2-KGA、D-果糖、L-艾杜糖酸、二羥基丙酮、5-酮基-D-古洛糖酸和5-酮基-D-甘露糖酸。
本發(fā)明涉及用酶來(lái)生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法，所述的酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或與SEQ ID NO2的氨基酸序列90％相同的氨基酸序列，并且具有生產(chǎn)L-抗壞血酸的活性，通過(guò)此酶從底物生產(chǎn)出L-抗壞血酸，所述底物選自由L-古洛糖、L-半乳糖、L-艾杜糖和L-塔羅糖所構(gòu)成的組。
L-己糖，例如L-古洛糖、L-半乳糖、L-艾杜糖和L-塔羅糖，是稀有的糖，其基本通過(guò)化學(xué)方法來(lái)生產(chǎn)，在商業(yè)上是高成本的化合物。然而，近來(lái)已有對(duì)L-古洛糖和L-半乳糖的生物制備的報(bào)道。EP 0 832 974 A2中報(bào)道了通過(guò)G.oxydans DSM 4025的酶A從D-山梨糖醇對(duì)L-古洛糖進(jìn)行的生產(chǎn)。US 6,037,153中公開(kāi)了通過(guò)L-核糖異構(gòu)酶從L-山梨糖對(duì)L-古洛糖進(jìn)行的生產(chǎn)。Izumori et al.(2001 Annual Meeting of the Society for Bioscienceand Bioengineering，Japan)中報(bào)道了從L-山梨糖對(duì)L-半乳糖進(jìn)行的生產(chǎn)。在此方法中，他們將兩種用到酶的方法加以組合，所述方法由用Pseudomonas cichorii ST-24菌株的L-塔格糖(tagatose)差向異構(gòu)酶來(lái)進(jìn)行的“L-山梨糖到L-塔格糖”的反應(yīng)(US 5,811,271)和用Bacillusstearothermophilus 14a菌株的D-阿拉伯糖異構(gòu)酶來(lái)進(jìn)行的“L-塔格糖到L-半乳糖”的反應(yīng)構(gòu)成。L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯可從D-古洛糖來(lái)制備。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種方法，用于(a)生產(chǎn)(i)L-抗壞血酸，該過(guò)程是通過(guò)酶從L-古洛糖或L-半乳糖來(lái)進(jìn)行的，其中包括將L-古洛糖或L-半乳糖和酶或其功能等同物在反應(yīng)混合物中相接觸，所述的酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或與SEQ ID NO2的氨基酸序列90％相同的氨基酸序列或其部分，并且具有從L-古洛糖及L-半乳糖生產(chǎn)L-抗壞血酸的活性；(ii)L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯，該過(guò)程是通過(guò)酶分別從L-古洛糖或L-半乳糖來(lái)進(jìn)行的，其中包括將L-古洛糖或L-半乳糖和酶或其功能等同物在反應(yīng)混合物中相接觸，所述的酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或與SEQ ID NO2的氨基酸序列90％相同的氨基酸序列或其部分，并且具有從L-古洛糖生產(chǎn)L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯及從L-半乳糖生產(chǎn)L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯的活性；(iii)L-抗壞血酸，該過(guò)程是通過(guò)酶從L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯來(lái)進(jìn)行的，其中包括將L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯和酶或其功能等同物在反應(yīng)混合物中相接觸，所述的酶具有SEQID NO2的氨基酸序列或與SEQ ID NO2的氨基酸序列90％相同的氨基酸序列或其部分，并且具有從L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯及L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯生產(chǎn)L-抗壞血酸的活性；和(b)從反應(yīng)混合物中分離出L-抗壞血酸、L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯。
本發(fā)明的一種實(shí)施方式提供了用酶來(lái)生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法，所述的酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或與SEQ ID NO2的氨基酸序列90％相同的氨基酸序列，并且具有生產(chǎn)L-抗壞血酸的活性，通過(guò)此酶從底物生產(chǎn)出L-抗壞血酸，所述底物選自由L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯、L-半乳糖酸、L-艾杜糖酸-1，4-內(nèi)酯、L-艾杜糖酸、L-塔羅糖酸-1，4-內(nèi)酯和L-塔羅糖酸所構(gòu)成的組。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明包括用酶生產(chǎn)L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-古洛糖酸的方法，所述的酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或與SEQ IDNO2的氨基酸序列90％相同的氨基酸序列，并且具有生產(chǎn)L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-古洛糖酸的活性，通過(guò)此酶從L-古洛糖生產(chǎn)出L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-古洛糖酸。
另外，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用酶生產(chǎn)L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸的方法，所述的酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或與SEQ IDNO2的氨基酸序列90％相同的氨基酸序列，并且具有生產(chǎn)L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸的活性，通過(guò)此酶從L-半乳糖生產(chǎn)出L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸。
上述根據(jù)本發(fā)明的方法包括(a)將酶與各自的底物相接觸，和(b)從反應(yīng)混合物中分離出各自的產(chǎn)物。在維生素C作為產(chǎn)物的情況下，底物選自由L-古洛糖、L-半乳糖、L-艾杜糖、L-塔羅糖、L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯、L-半乳糖酸、L-艾杜糖酸-1，4-內(nèi)酯、L-艾杜糖酸、L-塔羅糖酸-1，4-內(nèi)酯和L-塔羅糖酸所構(gòu)成的組。在L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-古洛糖酸作為產(chǎn)物的情況下，底物是L-古洛糖。在L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸作為產(chǎn)物的情況下，底物是L-半乳糖。
本發(fā)明中，酶的功能等同物可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的化學(xué)肽合成來(lái)制得，或者可以依靠現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，在本文公布的DNA序列的基礎(chǔ)上通過(guò)重組手段來(lái)制得。在蛋白質(zhì)和肽中進(jìn)行的大體上不改變此類(lèi)分子活性的氨基酸交換在本領(lǐng)域的范疇內(nèi)是已知的。最常見(jiàn)的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly及其顛倒過(guò)來(lái)的形式。
此外，酶的功能等同物包括公布的SEQ ID NO1的DNA序列所編碼的氨基酸序列，所述DNA序列例如，在序列表中的序列及其互補(bǔ)序列，或包括上述序列的序列，在標(biāo)準(zhǔn)條件下能與此類(lèi)序列或其片段雜交的DNA序列，以及由于遺傳密碼簡(jiǎn)并在標(biāo)準(zhǔn)條件下不與此類(lèi)序列雜交但編碼具有完全相同的氨基酸序列的多肽的DNA序列；其中，所述的功能等同物具有如下酶活性(i)從L-古洛糖和L-半乳糖生產(chǎn)L-抗壞血酸；(ii)從L-古洛糖生產(chǎn)L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯(及其酸的形式，L-古洛糖酸)和從L-半乳糖生產(chǎn)L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯(及其酸的形式，L-半乳糖酸)，或(iii)從L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯(及其酸的形式，L-古洛糖酸)和從L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯(及其酸的形式，L-半乳糖酸)生產(chǎn)L-抗壞血酸。
用于雜交的“標(biāo)準(zhǔn)條件”在上下文中表示本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員為了探測(cè)特定雜交信號(hào)通常所用的條件，或者，優(yōu)選地，所謂的嚴(yán)謹(jǐn)雜交和非嚴(yán)謹(jǐn)洗滌條件，或更優(yōu)選地，所謂的嚴(yán)謹(jǐn)雜交和嚴(yán)謹(jǐn)洗滌條件，這些都是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟悉的。此外，依靠本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，用基于本文中公開(kāi)的DNA序列而設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)能制得的DNA序列也包括在本發(fā)明中。應(yīng)當(dāng)理解也可以按照例如EP 747 483 A2中所述通過(guò)合成來(lái)制得本發(fā)明的DNA序列。
可以用誘變?cè)?，例如紫外線(xiàn)輻射、X射線(xiàn)輻射、γ-射線(xiàn)輻射，或與含氮的酸N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)相接觸，或用其它適合的誘變?cè)瓉?lái)處理基因或攜帶有所述基因的微生物，來(lái)制備該基因的突變體；或者通過(guò)對(duì)自發(fā)突變產(chǎn)生的或用本領(lǐng)域內(nèi)已知的體外誘變標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生的菌落或克隆進(jìn)行分離來(lái)制備所述突變體。所述標(biāo)準(zhǔn)方法中的很多種都已被描述于若干份公開(kāi)文本中。
在本文中使用的“突變體”是任何編碼非天然多核苷酸序列或編碼從其天然形式變化來(lái)的多核苷酸序列(例如，通過(guò)對(duì)1-100個(gè)核苷酸，優(yōu)選20-50個(gè)，更優(yōu)選為少于10個(gè)核苷酸進(jìn)行重新排列或缺失或替換)的基因。如上所述，可以通過(guò)隨機(jī)誘變、化學(xué)誘變、自發(fā)突變、UV輻射、易錯(cuò)PCR(PCR-prone error generation)、定點(diǎn)誘變等來(lái)獲得這樣的非天然序列。優(yōu)選地，所述突變導(dǎo)致與未突變的母體多肽相比產(chǎn)量提高或活性增強(qiáng)的多肽的表達(dá)，這可以通過(guò)實(shí)施例中給出的檢測(cè)手段檢測(cè)出來(lái)。用于產(chǎn)生、篩選和鑒定此類(lèi)突變體細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。
按照《布達(dá)佩斯條約》的規(guī)定，一種特定的優(yōu)選G.oxydans菌株，作為編碼多肽的DNA序列的供體，已于1987年3月17日被保藏到Gttingen(德國(guó))的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen(DSMZ)，編號(hào)為DSM No.4025。具有G.oxydans DSM4025鑒定特征的微生物的生物學(xué)和/或分類(lèi)學(xué)上的均一培養(yǎng)物也可作為所述DNA序列的供體。
G.oxydans DSM 4025的傳代培養(yǎng)物也已被保藏到Agency of IndustrialScience and Technology，F(xiàn)ermentation Research Institute，Japan，保藏編號(hào)為FERM BP-3812。EP 0 278 447 B1中公開(kāi)了該菌株的特征。
如果必要的話(huà)，利用已被確定的核苷酸序列的信息(要考慮到密碼子的使用)，通過(guò)菌落雜交或Southern雜交，或者通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以從不同的生物中分離出編碼分歧進(jìn)化的(evolutionally divergent)酶的基因，所述的酶具有從L-古洛糖或L-半乳糖形成維生素C的活性，以及(i)從L-古洛糖和L-半乳糖生產(chǎn)L-抗壞血酸的活性，(ii)從L-古洛糖生產(chǎn)L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯(及其酸的形式，L-古洛糖酸)和從L-半乳糖生產(chǎn)L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯(及其酸的形式，L-半乳糖酸)的活性，或(iii)從L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯(及其酸的形式，L-古洛糖酸)和從L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯(及其酸的形式，L-半乳糖酸)生產(chǎn)L-抗壞血酸的活性，所述菌落雜交或Southern雜交是用根據(jù)從所述核苷酸序列推斷出的氨基酸序列而合成的探針來(lái)進(jìn)行的，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用也是根據(jù)所述信息而合成的引物來(lái)進(jìn)行的。
此外，用于構(gòu)建攜帶有G.oxydans DSM 4025的酶B及上面定義的其功能等同物或突變體的重組微生物的優(yōu)選宿主微生物可以是Escherichiacoli、Pseudomonas putida和G.oxydans DSM 4025及其生物學(xué)和/或分類(lèi)學(xué)上的均一培養(yǎng)物或突變體。
為構(gòu)建在重組表達(dá)載體或在宿主微生物的染色體DNA上攜帶有編碼G.oxydans DSM 4025的酶B及其功能等同物或突變體的基因的重組微生物，可以使用多種基因轉(zhuǎn)移方法，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合(conjugalmating)和電穿孔。用于構(gòu)建重組微生物的方法可以選自細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中公知的方法。通常的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以用于Escherichia coli和Pseudomonas。轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)也可以用于Escherichia coli。接合系統(tǒng)也可以廣泛地使用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌，包括E.coli、Pseudomonasputida和G.oxydans。接合可以發(fā)生于液體培養(yǎng)基中或固體表面上。優(yōu)選的受體選自E.coli、Pseudomonas putida和G.oxydans，其能通過(guò)合適的重組表達(dá)載體產(chǎn)生出具有活性的酶B。通常向用于接合的受體中加入選擇性標(biāo)志；例如，通常選用對(duì)萘啶酸或利福平的抗性。
本發(fā)明中提供的微生物可在有氧條件下被培養(yǎng)于補(bǔ)充有合適營(yíng)養(yǎng)物的水性培養(yǎng)基中。培養(yǎng)在大約1.0至大約9.0之間的pH下進(jìn)行，優(yōu)選在大約2.0至大約8.0之間。雖然培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)所用的pH、溫度和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基而改變，但是通常2至5天會(huì)帶來(lái)有利的結(jié)果。用于開(kāi)展培養(yǎng)的合適的溫度范圍為大約13℃至大約45℃，優(yōu)選為大約18℃至大約42℃。
因此，上述本發(fā)明用于生產(chǎn)維生素C的方法在大約1至大約9之間的pH和大約13℃至大約45℃之間的溫度下進(jìn)行1至120小時(shí)。優(yōu)選地，該方法進(jìn)行于大約2至大約8之間的pH和大約13℃至大約45℃之間的溫度下。如本發(fā)明的其它實(shí)施方式所述，上述條件也可以用于生產(chǎn)L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸。
通常要求培養(yǎng)基中含有如下?tīng)I(yíng)養(yǎng)物可被吸收的碳源、可被消化的氮源和無(wú)機(jī)物、維生素、痕量元素和其它促進(jìn)生長(zhǎng)的因子。可被吸收的碳源的例子包括甘油、D-葡萄糖、D-甘露醇、D-果糖、D-阿糖醇、D-山梨糖醇和L-山梨糖。
若干有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)也可被用作氮源，例如酵母提取物、肉類(lèi)提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米漿、尿素、氨基酸、硝酸鹽、銨鹽等。無(wú)機(jī)物硫酸鎂、磷酸鉀、氯化亞鐵和氯化鐵、碳酸鈣等也可以使用。
在本文中使用的L-抗壞血酸指以游離酸的形式或以鹽的形式存在的物質(zhì)，所述鹽的形式例如是鈉鹽、鉀鹽或半鈣(hemicalcium)鹽，例如二水合L-抗壞血酸鈣。此外，除非另有指明，L-抗壞血酸的濃度都是以游離酸的形式來(lái)描述的。
在本文中使用的L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯和L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯指以其內(nèi)酯的形式和/或其酸的形式存在的物質(zhì)，在多種物理-化學(xué)條件下，這兩種形式以平衡狀態(tài)共同存在。
在本文中使用的短語(yǔ)“用于雜交的標(biāo)準(zhǔn)條件”指本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員為了探測(cè)特定雜交信號(hào)通常所用的條件，或者，優(yōu)選地，所謂的嚴(yán)謹(jǐn)雜交和非嚴(yán)謹(jǐn)洗滌條件，或更優(yōu)選地，所謂的中度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件，或進(jìn)一步優(yōu)選地，所謂的嚴(yán)謹(jǐn)雜交和嚴(yán)謹(jǐn)洗滌條件，這些都是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟悉的。
例如，可以恰當(dāng)?shù)厥褂孟铝须s交條件和洗滌條件的組合“高嚴(yán)謹(jǐn)度雜交”6XSSC、0.5％SDS、100μg/ml變性鮭魚(yú)精DNA、50％甲酰胺，在42℃下輕搖培養(yǎng)過(guò)夜。
“高嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌”在2XSSC、0.5％SDS中于室溫下洗滌一次，15分鐘；然后在0.1XSSC、0.5％SDS中于室溫下再洗滌一次，15分鐘。
“低嚴(yán)謹(jǐn)度雜交”6XSSC、0.5％SDS、100μg/ml變性鮭魚(yú)精DNA、50％甲酰胺，在37℃下輕搖培養(yǎng)過(guò)夜。
“低嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌”在0.1XSSC、0.5％SDS中于室溫下洗滌一次，15分鐘。
中度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件可通過(guò)改變上述雜交反應(yīng)發(fā)生的溫度和/或洗滌條件來(lái)獲得。
反應(yīng)混合物中，L-醛糖和L-醛糖內(nèi)酯等底物的濃度可根據(jù)其它反應(yīng)條件而改變，但是，其通常在大約1g/l至大約300g/l之間，優(yōu)選在大約10g/l至大約200g/l之間。
所述反應(yīng)可在有氧條件下進(jìn)行。
在反應(yīng)中使用的酶可以是任何形式的，其包括但不限于酶溶液、固定的酶、完整細(xì)胞和固定的細(xì)胞。
反應(yīng)之后，可以通過(guò)多種色譜的組合方式從反應(yīng)混合物中回收L-抗壞血酸和L-醛糖內(nèi)酯，所述色譜例如是薄層色譜、吸附色譜、離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜或高效液相色譜。也可以將本發(fā)明的反應(yīng)混合物中未經(jīng)純化的作為反應(yīng)產(chǎn)物的L-醛糖內(nèi)酯，作為進(jìn)一步反應(yīng)的底物。
下述實(shí)施例被用來(lái)進(jìn)一步地闡述本發(fā)明的方法。這些實(shí)施例僅作闡述用，而并非欲以任何方式對(duì)本發(fā)明的范圍加以限制。
實(shí)施例1通過(guò)攜帶有酶B基因的Escherichia coli JM 109從L-古洛糖生產(chǎn)L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯/L-古洛糖酸如EP 0 832 974 A2中所述，從pSS103R中將編碼酶B的基因克隆并亞克隆到載體pTrcMalE中，以構(gòu)建pTrcMalE-EnzB。在2ml加有100動(dòng)泵來(lái)控制連續(xù)補(bǔ)料速率。再用第三個(gè)蠕動(dòng)泵將從第一發(fā)酵罐中取出的培養(yǎng)液進(jìn)一步地轉(zhuǎn)移到第二階段發(fā)酵罐中。最后，用第四個(gè)蠕動(dòng)泵將培養(yǎng)液取到收獲儲(chǔ)藏罐中，而工作體積被保持為2L。溫度被控制在28℃，攪拌速度和通氣速率被分別設(shè)置為800rpm和1.0L/min。用氫氧化鈉溶液將pH控制為7.0。
已知對(duì)通過(guò)上述混合培養(yǎng)從D-山梨糖醇來(lái)生產(chǎn)2-KGA的過(guò)程進(jìn)行DO控制，有助于增加G.suboxydans IFO 3291的細(xì)胞活性和2-KGA的產(chǎn)量。因此，發(fā)酵開(kāi)始后的9至52小時(shí)之間，第一階段發(fā)酵罐的DO水平被控制在10％。DO水平是通過(guò)提供混合了純氧的空氣來(lái)控制的。在第一發(fā)酵罐和第二發(fā)酵罐中，稀釋速率(D)被設(shè)置在0.035h-1至0.045h-1的范圍內(nèi)。發(fā)酵持續(xù)250小時(shí)。表1顯示了G.oxydans DSM 4025和G.suboxydans IFO 3291的混合物在上述兩階段連續(xù)模式中的發(fā)酵活性。在此連續(xù)模式中，平均產(chǎn)生出了74.5g/L的2-KGA。在此連續(xù)模式的穩(wěn)定狀態(tài)下，第一發(fā)酵罐中對(duì)2-KGA的生產(chǎn)能力被計(jì)算為2.57g/L/h。此外，總生產(chǎn)能力被計(jì)算為1.33g/L/h，總的2-KGA摩爾轉(zhuǎn)化率是60.6％。
表1使用3L發(fā)酵罐的兩階段連續(xù)模式中的發(fā)酵活性
實(shí)施例2 通過(guò)對(duì)G.oxydans DSM 4025和G.suboxydans IFO 3291的混合培養(yǎng)從13％的D-山梨糖醇來(lái)進(jìn)行兩階段2-KGA連續(xù)發(fā)酵初始生產(chǎn)培養(yǎng)基和用于補(bǔ)料分批模式的補(bǔ)料培養(yǎng)基由與實(shí)施例1中所述相同的成分構(gòu)成。所述兩階段連續(xù)發(fā)酵按照實(shí)施例1中所描述的來(lái)進(jìn)行。所述的兩階段2-KGA連續(xù)發(fā)酵中使用含有13％的D-山梨糖醇、3％的玉米漿、0.25％的MgSO4·7H2O、0.05％的甘油、酵母提取物(BYF100)和0.15％的消泡劑的連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)基(10L)。
表2
nd無(wú)法探測(cè)到實(shí)施例3通過(guò)攜帶有酶B基因的Escherichia coli JM 109從L-半乳糖生產(chǎn)L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯/L-半乳糖酸如實(shí)施例1中所述來(lái)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，除了本實(shí)施例中所用的底物為L(zhǎng)-半乳糖。表3中概括了L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯加L-半乳糖酸的量和維生素C的量。
表3
L-GaLL-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯；L-GaAL-半乳糖酸；nd無(wú)法探測(cè)到實(shí)施例4通過(guò)攜帶有酶B基因的Escherichia coli JM 109從L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯/L-半乳糖酸生產(chǎn)維生素C如實(shí)施例1中所述來(lái)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，除了本實(shí)施例中所用的底物為L(zhǎng)-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯。維生素C的量被概括于表4中。
背景技術(shù)：
(a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生產(chǎn)多不飽和脂肪酸(PUFAs)、更具體地生產(chǎn)ω-3脂肪酸的新方法。
(b)發(fā)明背景微藻(microalgae)，更具體是在海水養(yǎng)殖中培養(yǎng)的藻類(lèi)，通常含有豐富的PUFAs，其中最重要的兩種是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。以下表1顯示在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)中供養(yǎng)的多種微藻的EPA和DHA的濃度。
表1 多種微藻的脂肪酸
《國(guó)際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約》國(guó)際表格東方科學(xué)儀器進(jìn)出口集團(tuán)有限公司為 存活證明中華人民共和國(guó)北京市按照規(guī)定10.2，由本頁(yè)頁(yè)尾指三里河路52號(hào)明的國(guó)際保藏單位出具。
中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
1.表示最初保藏日期，或者如果進(jìn)行了新保藏或轉(zhuǎn)移，則表示最近的相關(guān)日期(新保藏的日期或轉(zhuǎn)移的日期)。
2.對(duì)規(guī)定10.2(a)(ii)和(iii)中所指的情況，指最近的存活性試驗(yàn)。
3.在適用的框中打叉。
4.如果已要求該信息并且試驗(yàn)結(jié)果為陰性，則需要填寫(xiě)。
DSMZ-BP/9表格(單頁(yè))12/2001
序列表<110>羅奇維生素股份公司(Roche Vitamins AG)<120>抗壞血酸的生產(chǎn)<130>Case 21409<150>EP 02021602<151>2002-09-27<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1740<212>DNA<213>氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1740)<400>1atg aac ccc aca acg ctg ctt cgc acc agc gcg gcc gtg cta ttg ctt48Met Asn Pro Thr Thr Leu Leu Arg Thr Ser Ala Ala Val Leu Leu Leu1 5 10 15acc gcg ccc gcc gca ttc gcg cag gta acc ccg att acc gat gaa ctg96Thr Ala Pro Ala Ala Phe Ala Gln Val Thr Pro Ile Thr Asp Glu Leu20 25 30ctg gcg aac ccg ccc gct ggt gaa tgg att aac tac ggc cgc aac caa144Leu Ala Asn Pro Pro Ala Gly Glu Trp Ile Asn Tyr Gly Arg Asn Gln35 40 45gaa aac tat cgc cac tcg ccc ctg acc cag atc act gcc gac aac gtt192Glu Asn Tyr Arg His Ser Pro Leu Thr Gln Ile Thr Ala Asp Asn Val50 55 60ggt cag ttg caa ctg gtc tgg gcc cgc ggg atg gag gcg ggg gcc gta240Gly Gln Leu Gln Leu Val Trp Ala Arg Gly Met Glu Ala Gly Ala Val65 70 75 80cag gtc acg ccg atg atc cat gat ggc gtg atg tat ctg gca aac ccc288Gln Val Thr Pro Met Ile His Asp Gly Val Met Tyr Leu Ala Asn Pro85 90 95ggt gat gtg atc cag gcg ctg gat gcg caa aca ggc gat ctg atc tgg336Gly Asp Val Ile Gln Ala Leu Asp Ala Gln Thr Gly Asp Leu Ile Trp100 105 110gaa cac cgc cgc caa ctg ccc gcc gtc gcc acg cta aac gcc caa ggc384Glu His Arg Arg Gln Leu Pro Ala Val Ala Thr Leu Asn Ala Gln Gly115 120 125
gac cgc aag cgc ggc gtc gcc ctt tac ggc acg agc ctc tat ttc agc432Asp Arg Lys Arg Gly Val Ala Leu Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Phe Ser130 135 140tca tgg gac aac cat ctg atc gcg ctg gat atg gag acg ggc cag gtc480Ser Trp Asp Asn His Leu Ile Ala Leu Asp Met Glu Thr Gly Gln Val145 150 155 160gta ttc gat gtc gaa cgt gga tcg ggc gaa gac ggc ttg acc agt aac528Val Phe Asp Val Glu Arg Gly Ser Gly Glu Asp Gly Leu Thr Ser Asn165 170 175acc acg ggg ccg att gtc gcc aat ggc gtc atc gtc gcg ggt tcc acc576Thr Thr Gly Pro Ile Val Ala Asn Gly Val Ile Val Ala Gly Ser Thr180 185 190tgc caa tat tcg ccc tat gga tgc ttt atc tcg ggg cac gat tcc gcg624Cys Gln Tyr Ser Pro Tyr Gly Cys Phe Ile Ser Gly His Asp Ser Ala195 200 205acg ggt gag gag ctg tgg cgc aac cac ttt atc ccg cag ccg ggc gaa672Thr Gly Glu Glu Leu Trp Arg Asn His Phe Ile Pro Gln Pro Gly Glu210 215 220gag ggt gac gag act tgg ggc aat gat ttc gag gcg cgc tgg atg acc720Glu Gly Asp Glu Thr Trp Gly Asn Asp Phe Glu Ala Arg Trp Met Thr225 230 235 240ggc gtc tgg ggt cag atc acc tat gat ccc gtg acg aac ctt gtg ttc768Gly Val Trp Gly Gln Ile Thr Tyr Asp Pro Val Thr Asn Leu Val Phe245 250 255tat ggc tcg acc ggc gtg ggc cca gcg tcc gaa acc cag cgc ggc acg816Tyr Gly Ser Thr Gly Val Gly Pro Ala Ser Glu Thr Gln Arg Gly Thr260 265 270ccg ggc ggc acg ctg tat ggc acc aac acc cgc ttt gcg gtg cgt ccc864Pro Gly Gly Thr Leu Tyr Gly Thr Asn Thr Arg Phe Ala Val Arg Pro275 280 285gac acg ggc gag att gtc tgg cgt cac cag acc ctg ccg cgc gac aac912Asp Thr Gly Glu Ile Val Trp Arg His Gln Thr Leu Pro Arg Asp Asn290 295 300tgg gac caa gaa tgc acg ttc gag atg atg gtc gcc aac gtc gat gtg960Trp Asp Gln Glu Cys Thr Phe Glu Met Met Val Ala Asn Val Asp Val305 310 315 320caa ccc tcg gcc gag atg gag ggt ctg cgc gcc atc aac ccc aat gcg1008Gln Pro Ser Ala Glu Met Glu Gly Leu Arg Ala Ile Asn Pro Asn Ala325 330 335gcg acg ggc gag cgc cgt gtg ctg acg ggt gcg cct tgc aag acc ggc1056Ala Thr Gly Glu Arg Arg Val Leu Thr Gly Ala Pro Cys Lys Thr Gly340 345 350acg atg tgg tcg ttt gat gcg gcc tcg ggc gaa ttc ctg tgg gcg cgt110Thr Met Trp Ser Phe Asp Ala Ala Ser Gly Glu Phe Leu Trp Ala Arg355 360 365gat acc aac tac acc aat atg atc gcc tcg atc gac gag acc ggc ctt1152Asp Thr Asn Tyr Thr Asn Met Ile Ala Ser Ile Asp Glu Thr Gly Leu370 375 380
gtg acg gtg aac gag gat gcg gtg ctg aaa gag ctg gac gtt gaa tat1200Val Thr Val Asn Glu Asp Ala Val Leu Lys Glu Leu Asp Val Glu Tyr385 390 395 400gac gtc tgc ccg acc ttc ctg ggt ggg cgc gac tgg tcg tca gcc gca1248Asp Val Cys Pro Thr Phe Leu Gly Gly Arg Asp Trp Ser Ser Ala Ala405 410 415ctg aac ccg gac acc ggc att tac ttc ttg ccg ctg aac aat gcc tgc1296Leu Asn Pro Asp Thr Gly Ile Tyr Phe Leu Pro Leu Asn Asn Ala Cys420 425 430tac gat att atg gcc gtt gat caa gag ttt agc gcg ctc gac gtc tat1344Tyr Asp Ile Met Ala Val Asp Gln Glu Phe Ser Ala Leu Asp Val Tyr435 440 445aac acc agc gcg acc gca aaa ctc gcg ccg ggc ttt gaa aat atg ggc1392Asn Thr Ser Ala Thr Ala Lys Leu Ala Pro Gly Phe Glu Asn Met Gly450 455 460cgc atc gac gcg att gat atc agc acc ggg cgc acc ttg tgg tcg gcg1440Arg Ile Asp Ala Ile Asp Ile Ser Thr Gly Arg Thr Leu Trp Ser Ala465 470 475 480gag cgc cct gcg gcg aac tac tcg ccc gtt ttg tcg acg gca ggc ggt1488Glu Arg Pro Ala Ala Asn Tyr Ser Pro Val Leu Ser Thr Ala Gly Gly485 490 495gtg gtg ttc aac ggc ggg acc gac cgc tat ttc cgt gcc ctc agc cag1536Val Val Phe Asn Gly Gly Thr Asp Arg Tyr Phe Arg Ala Leu Ser Gln500 505 510gaa acc ggc gag act ttg tgg cag gcc cgt ctt gcg acg gtc gcg acg1584Glu Thr Gly Glu Thr Leu Trp Gln Ala Arg Leu Ala Thr Val Ala Thr515 520 525ggg cag gcg atc agc tac gag ttg gac ggc gtg caa tat atc gcc atc1632Gly Gln Ala Ile Ser Tyr Glu Leu Asp Gly Val Gln Tyr Ile Ala Ile530 535 540ggt gcg ggc ggt ctg acc tat ggc acg caa ttg aac gcg ccg ctg gcc1680Gly Ala Gly Gly Leu Thr Tyr Gly Thr Gln Leu Asn Ala Pro Leu Ala545 550 555 560gag gca atc gat tcg acc tcg gtc ggt aat gcg atc tat gtc ttt gca1728Glu Ala Ile Asp Ser Thr Ser Val Gly Asn Ala Ile Tyr Val Phe Ala565 570 575ctg ccg cag taa1740Leu Pro Gln<210>2<211>579<212>PRT<213>氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)<400>2Met Asn Pro Thr Thr Leu Leu Arg Thr Ser Ala Ala Val Leu Leu Leu1 5 10 15
Thr Ala Pro Ala Ala Phe Ala Gln Val Thr Pro Ile Thr Asp Glu Leu20 25 30Leu Ala Asn Pro Pro Ala Gly Glu Trp Ile Asn Tyr Gly Arg Asn Gln35 40 45Glu Asn Tyr Arg His Ser Pro Leu Thr Gln Ile Thr Ala Asp Asn Val50 55 60Gly Gln Leu Gln Leu Val Trp Ala Arg Gly Met Glu Ala Gly Ala Val65 70 75 80Gln Val Thr Pro Met Ile His Asp Gly Val Met Tyr Leu Ala Asn Pro85 90 95Gly Asp Val Ile Gln Ala Leu Asp Ala Gln Thr Gly Asp Leu Ile Trp100 105 110Glu His Arg Arg Gln Leu Pro Ala Val Ala Thr Leu Asn Ala Gln Gly115 120 125Asp Arg Lys Arg Gly Val Ala Leu Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Phe Ser130 135 140Ser Trp Asp Asn His Leu Ile Ala Leu Asp Met Glu Thr Gly Gln Val145 150 155 160Val Phe Asp Val Glu Arg Gly Ser Gly Glu Asp Gly Leu Thr Ser Asn165 170 175Thr Thr Gly Pro Ile Val Ala Asn Gly Val Ile Val Ala Gly Ser Thr180 185 190Cys Gln Tyr Ser Pro Tyr Gly Cys Phe Ile Ser Gly His Asp Ser Ala195 200 205Thr Gly Glu Glu Leu Trp Arg Asn His Phe Ile Pro Gln Pro Gly Glu210 215 220Glu Gly Asp Glu Thr Trp Gly Asn Asp Phe Glu Ala Arg Trp Met Thr225 230 235 240Gly Val Trp Gly Gln Ile Thr Tyr Asp Pro Val Thr Asn Leu Val Phe245 250 255Tyr Gly Ser Thr Gly Val Gly Pro a Ser Glu Thr Gln Arg Gly Thr
260 265 270Pro Gly Gly Thr Leu Tyr Gly Thr Asn Thr Arg Phe Ala Val Arg Pro275 280 285Asp Thr Gly Glu Ile Val Trp Arg His Gln Thr Leu Pro Arg Asp Asn290 295 300Trp Asp Gln Glu Cys Thr Phe Glu Met Met Val Ala Asn Val Asp Val305 310 315 320Gln Pro Ser Ala Glu Met Glu Gly Leu Arg Ala Ile Asn Pro Asn Ala325 330 335Ala Thr Gly Glu Arg Arg Val Leu Thr Gly Ala Pro Cys Lys Thr Gly340 345 350Thr Met Trp Ser Phe Asp Ala Ala Ser Gly Glu Phe Leu Trp Ala Arg355 360 365Asp Thr Asn Tyr Thr Asn Met Ile Ala Ser Ile Asp Glu Thr Gly Leu370 375 380Val Thr Val Asn Glu Asp Ala Val Leu Lys Glu Leu Asp Val Glu Tyr385 390 395 400Asp Val Cys Pro Thr Phe Leu Gly Gly Arg Asp Trp Ser Ser Ala Ala405 410 415Leu Asn Pro Asp Thr Gly Ile Tyr Phe Leu Pro Leu Asn Asn Ala Cys420 425 430Tyr Asp Ile Met Ala Val Asp Gln Glu Phe Ser Ala Leu Asp Val Tyr435 440 445Asn Thr Ser Ala Thr Ala Lys Leu Ala Pro Gly Phe Glu Asn Met Gly450 455 460Arg Ile Asp Ala Ile Asp Ile Ser Thr Gly Arg Thr Leu Trp Ser Ala465 470 475 480Glu Arg Pro Ala Ala Asn Tyr Ser Pro Val Leu Ser Thr Ala Gly Gly485 490 495Val Val Phe Asn Gly Gly Thr Asp Arg Tyr Phe Arg Ala Leu Ser Gln500 505 510
Glu Thr Gly Glu Thr Leu Trp Gln Ala Arg Leu Ala Thr Val Ala Thr515 520 525Gly Gln Ala Ile Ser Tyr Glu Leu Asp Gly Val Gln Tyr Ile Ala Ile530 535 540Gly Ala Gly Gly Leu Thr Tyr Gly Thr Gln Leu Asn Ala Pro Leu Ala545 550 555 560Glu Ala Ile Asp Ser Thr Ser Val Gly Asn Ala Ile Tyr Val Phe Ala565 570 575Leu Pro Gln
權(quán)利要求
1.一種用酶來(lái)生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法，所述的酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或與SEQ ID NO2的氨基酸序列90％相同的氨基酸序列，并且具有生產(chǎn)L-抗壞血酸的活性，所述方法中，L-抗壞血酸產(chǎn)自選自由L-古洛糖、L-半乳糖、L-艾杜糖和L-塔羅糖所構(gòu)成的組的底物。
2.一種用酶來(lái)生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法，所述的酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或與SEQ ID NO2的氨基酸序列90％相同的氨基酸序列，并且具有生產(chǎn)L-抗壞血酸的活性，通過(guò)該酶從底物生產(chǎn)出L-抗壞血酸，所述底物選自由L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯、L-半乳糖酸、L-艾杜糖酸-1，4-內(nèi)酯、L-艾杜糖酸、L-塔羅糖酸-1，4-內(nèi)酯和L-塔羅糖酸所構(gòu)成的組。
3.一種用酶來(lái)生產(chǎn)L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-古洛糖酸的方法，所述的酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或與SEQ ID NO2的氨基酸序列90％相同的氨基酸序列，并且具有生產(chǎn)L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-古洛糖酸的活性，通過(guò)該酶從L-古洛糖生產(chǎn)出L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-古洛糖酸。
4.一種用酶來(lái)生產(chǎn)L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸的方法，所述的酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或與SEQ ID NO2的氨基酸序列90％相同的氨基酸序列，并且具有生產(chǎn)L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸的活性，通過(guò)該酶從L-半乳糖生產(chǎn)出L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸。
5.如權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中包括(a)將所述的酶與各自的底物相接觸和(b)從反應(yīng)混合物中分離出產(chǎn)物，所述產(chǎn)物選自由L-抗壞血酸、L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯和L-半乳糖酸所構(gòu)成的組。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的方法在大約1至大約9之間的pH和大約13℃至大約45℃之間的溫度下進(jìn)行1至120小時(shí)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的方法在大約2至大約8之間的pH和大約18℃至大約42℃之間的溫度下進(jìn)行。
8.G.oxydans DSM 4025的酶B在從底物生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法中的用途，所述底物選自由L-古洛糖、L-半乳糖、L-艾杜糖、L-塔羅糖、L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯和L-半乳糖酸所構(gòu)成的組；其中，酶B具有下列物理-化學(xué)屬性(a)在SDS-PAGE上分子量為大約60,000Da；(b)具有對(duì)一級(jí)及二級(jí)醇和醛的底物特異性；(c)在pH為大約6至大約9之間時(shí)，具有pH穩(wěn)定性；(d)最佳pH是pH為大約8.0；以及(e)受Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+和Fe3+抑制。
9.G.oxydans DSM 4025的酶B在用于從L-古洛糖來(lái)生產(chǎn)L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-古洛糖酸的方法中的用途，其中，酶B具有下列物理-化學(xué)屬性(a)在SDS-PAGE上分子量為大約60,000Da；(b)具有對(duì)一級(jí)及二級(jí)醇和醛的底物特異性；(c)在pH為大約6至大約9之間時(shí)，具有pH穩(wěn)定性；(d)最佳pH是pH為大約8.0；以及(e)受Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+和Fe3+抑制。
10.G.oxydans DSM 4025的酶B在用于從L-半乳糖來(lái)生產(chǎn)L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯或L-半乳糖酸的方法中的用途，其中，酶B具有下列物理-化學(xué)屬性(a)在SDS-PAGE上分子量為大約60,000Da；(b)具有對(duì)一級(jí)及二級(jí)醇和醛的底物特異性；(c)在pH為大約6至大約9之間時(shí)，具有pH穩(wěn)定性；(d)最佳pH是pH為大約8.0；以及(e)受Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+和Fe3+抑制。
全文摘要
本發(fā)明提供了EP 0 832 974 A2中公開(kāi)的G.oxydans DSM 4025的酶B在從L－古洛糖、L－半乳糖、L－艾杜糖或L－塔羅糖，或從L－古洛糖酸－1，4－內(nèi)酯(及其酸的形式，L－古洛糖酸)和從L－半乳糖酸－1，4－內(nèi)酯(及其酸的形式，L－半乳糖酸)來(lái)生產(chǎn)L－抗壞血酸的方法中的用途。
文檔編號(hào)C12P17/04GK1681935SQ03822442
公開(kāi)日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者塔特索·霍希諾, 新城雅子 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司