專利名稱：一種檢測l-抗壞血酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學(xué)傳感器的制備以及用該傳感器對L-抗壞血酸的測定。
背景技術(shù)：
L-抗壞血酸(AA)，即維生素C，廣泛存在于食品、藥物及人體中，是維持生命的重要成分之一，但人體不能自身合成。AA在人體的生命過程中扮演了極其重要的作用，它可以清除人體內(nèi)有害的自由基，提高人體對鐵的吸收；將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，使高膽固醇血癥患者的膽固醇下降；可促進膠原蛋白抗體的合成，具有抗癌的作用；并參與神經(jīng)介質(zhì)、激素的生物合成。AA還參與人體內(nèi)多種反應(yīng)，在體內(nèi)的氧化和還原作用以及細胞呼吸中起重要作用。研究表明，一個成人每天需要攝入AA的量約為70-90mg，AA的缺乏可導(dǎo)致多種疾病， 如壞血病、免疫力低下、感冒，抑郁癥、甚至是癌癥。但是攝入過量的AA也會給身體帶來損害，患者會出現(xiàn)尿道結(jié)石、腹瀉、胃痙攣等癥狀。AA含量高低常作為某些疾病診斷及營養(yǎng)分析的重要指標，但AA極易氧化失效，而且在某些食物中其含量較低，因此研究一種快速，靈敏，廉價的AA檢測方法是十分有必要的。目前對AA的檢測方法主要有有經(jīng)典的碘量法，火焰原子吸收光譜、液相色譜法、分光光度法，還有常用的庫侖法、常規(guī)極譜法、熒光光度法、 化學(xué)發(fā)光法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細管電泳法。這些方法中有的要求的實驗條件和操作技術(shù)較高，而有些方法步驟煩瑣，不利于快速分析。因此開發(fā)價格便宜，操作簡單，而靈敏度又較高的AA分析方法具有重大的實際意義。電化學(xué)傳感技術(shù)以其操作簡單，成本低，備檢測的樣品不需經(jīng)過預(yù)處理可直接測量；電極響應(yīng)快，需較短時間；選擇性、靈敏度較好； 穩(wěn)定性和抗干擾強，而具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有檢測技術(shù)的缺點，本發(fā)明提供了一種采用L-半胱氨酸/殼聚糖修飾的電化學(xué)傳感器快速測定AA含量的方法。L-半胱氨酸是天然氨基酸中唯一具有活潑-SH基團的化合物，同時還含有同樣活潑的-NH2，具有良好的電化學(xué)活性，因而對其電化學(xué)特性研究具有十分重要的意義。L-半胱氨酸能和一些離子發(fā)生螯合作用，使得L-半胱氨酸修飾電極在化學(xué)分析和生物分析中具有廣泛的應(yīng)用。殼聚糖，是由甲殼素進一步脫乙?；蟮玫降木€性、天然含氨基的聚糖，在自然界中含量豐富，成膜性好。其分子內(nèi)具有豐富的-NH2和-OH，從而使得殼聚糖對許多離子、有機物具有離子交換、離子螯合、吸附等作用。因而在分析領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，尤其是作為活性檢測物質(zhì)制備的各種修飾電極，性能優(yōu)越。但是殼聚糖的選擇性吸附能力不強，制備出的修飾電極缺乏良好的抗干擾性。自組裝膜技術(shù)是活性分子通過化學(xué)鍵自發(fā)吸附在異相界面上而形成的有序分子組裝體系，可以在分子水平上按人們預(yù)期的目標進行設(shè)計。自組裝膜具有均勻一致、高密堆積和低缺陷等優(yōu)點，并可按預(yù)先設(shè)計，通過精確的化學(xué)控制獲得特定的功能，具有超分子的結(jié)構(gòu)及界面性質(zhì)。在電極表面構(gòu)筑自組裝膜，將擴充修飾電極的應(yīng)用范圍，在電催化、分子識別、光電轉(zhuǎn)換、化學(xué)及生物傳感器等方面具有顯著的優(yōu)點和廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明人通過對殼聚糖和L-半胱氨酸的研究，經(jīng)過大量的實驗，得出了采用L-半胱氨酸和殼聚糖復(fù)合起來制備電化學(xué)傳感器(工作電極)的思路，本發(fā)明采用自組裝法，制得了 L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學(xué)傳感器(工作電極)。該傳感器既克服了殼聚糖對離子的選擇性吸附能力不強的缺點，也彌補了氨基酸不穩(wěn)定、易脫落的劣勢，充分發(fā)揮了二者各自的優(yōu)勢，增強了對離子的檢測能力，并充分發(fā)揮了自組裝技術(shù)制備簡便、穩(wěn)定可靠、識別性高的優(yōu)點，制得了具有較高靈敏度和穩(wěn)定性的電化學(xué)傳感器。一種檢測L-抗壞血酸的方法，采用基于L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的工作電極的電化學(xué)傳感器對溶液中L-抗壞血酸的濃度進行測定，步驟如下(1)將待測L-抗壞血酸加入乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，以此作為電解液；控制PH 為 5. 0-5. 4 ；(2)以L-半胱氨酸/殼聚糖修飾的玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬電極為輔助電極，置于⑴中所述的電解液中，電化學(xué)測試。電解液中L-抗壞血酸濃度為1. OX 10_5 2. OX 10_3mol/L的范圍內(nèi)峰電流成良好線性關(guān)系，檢出限為4. 3X 10_6mOl/L ；電解液pH較好為5. 0。本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的電化學(xué)傳感器的工作電極結(jié)構(gòu)為在玻碳電極基底表面有一層L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；其制備步驟如下1.進行玻碳電極預(yù)處理，先用拋光粉對玻碳電極進行打磨、拋光，然后對玻碳電極進行超聲清洗，得到基底表面光潔的玻碳電極；2.將殼聚糖和L-半胱氨酸加入到醋酸溶液中，不斷攪拌使之溶解充分；其中， 殼聚糖的含量為0. 5 0. 7wt%, L-半胱氨酸的含量為0. 3 0. 5wt% ；3.將預(yù)處理好的玻碳電極侵入2所制得的溶液中，室溫下自組裝3-7小時；4.將玻碳電極取出并用蒸餾水清洗，以去除多余的L-半胱氨酸和殼聚糖，室溫下晾干，得到L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的AA電化學(xué)傳感器的工作電極。5.將待測AA標準溶液加入pH為5. 0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，作為電解液，放入電解池中，并以以L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬電極為輔助電極，置于電解液中，電化學(xué)測試。每次掃描結(jié)束，將三電極置于空白底液中循環(huán)掃描至無峰，用二次蒸餾水沖洗，濾紙吸干后即可進行下一次掃描，這樣可保持電極良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，實驗均在室溫下進行。玻碳電極包括玻碳基底，玻碳基底表面吸附有L-半胱氨酸/殼聚糖響應(yīng)膜，玻碳基底與一電極引線相連，電極引線外側(cè)包覆有絕緣層。本發(fā)明的電化學(xué)傳感器具有快速、靈敏、抗干擾能力強的優(yōu)點。此外本發(fā)明采用自組裝法將活性檢測物質(zhì)L-半胱氨酸和殼聚糖修飾到電極表面，電化學(xué)傳感器(工作電極) 的制備簡便、成本低廉。


圖1為本發(fā)明玻碳工作電極結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為在不同pH乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，1. 5X 10_3mol/LAA的峰電流；圖3為本發(fā)明在不同修飾電極下1.5X10-3mol/L AA的循環(huán)伏安曲線，底液pH為 5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，a裸電極，b聚糖修飾電極，cL-半胱氨酸修飾電極，dL-半胱氨酸/殼聚糖修飾電極；圖4為不同AA濃度下的線性伏安曲線，底液pH為5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，其中的小圖為以濃度為橫坐標，峰電流為縱坐標作的標準曲線，其中，a Omol/L, b 1.0Xl(T5mol/L，c 8. 0 X 10_5mol/L, d 1 X l(T4mol/L，e2. 0 X ΙθΛιοΙ/L，f 5. 0 X l(T4mol/L，g 8. OX l(T4mol/L，h 1.0X 10_3mol/L, i2. 0X l(rtiol/L。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步闡述。實施例1本電化學(xué)傳感器的制備方法為(1)用拋光粉打磨玻碳電極，使其基底表面平整光潔，然后用超聲(頻率53KHZ，溫度25°C )清洗其表面，得到預(yù)處理的玻碳電極；(2)將1. Og殼聚糖和0. 6gL-半胱氨酸加入到200ml體積分數(shù)為1 %的醋酸溶液中，攪拌使它們充分溶解；(3)將預(yù)處理的玻碳電極浸入步驟(2)所制得的溶液中，室溫下自組裝3小時，使殼聚糖和L-半胱氨酸溶液自組裝到電極基底表面上，形成L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；(4)用去離子水清洗浸泡的玻碳電極，去除多余的L-半胱氨酸和殼聚糖，得到 L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學(xué)傳感器。實施例2本電化學(xué)傳感器的制備方法為(1)用拋光粉打磨玻碳電極，使其基底表面平整光潔，然后用超聲清洗其表面，得到預(yù)處理的玻碳電極；(2)將1. 4g殼聚糖和1. OgL-半胱氨酸加入到200ml體積分數(shù)為1 %的醋酸溶液中，攪拌使它們充分溶解；(3)將預(yù)處理的玻碳電極浸入步驟(2)所制得的溶液中，室溫下自組裝5小時，使殼聚糖和L-半胱氨酸溶液自組裝到電極基底表面上，形成L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；(4)用去離子水清洗浸泡的玻碳電極，去除多余的L-半胱氨酸和殼聚糖，得到 L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學(xué)傳感器。實施例3本電化學(xué)傳感器的制備方法為(1)用拋光粉打磨玻碳電極，使其基底表面平整光潔，然后用超聲清洗其表面，得到預(yù)處理的玻碳電極；(2)將1. 2g殼聚糖和0. SgL-半胱氨酸加入到200ml體積分數(shù)為的醋酸溶液中，攪拌使它們充分溶解；(3)將預(yù)處理的玻碳電極浸入步驟( 所制得的溶液中，室溫下靜置7小時，使殼
5聚糖和L-半胱氨酸溶液自組裝到電極基底表面上，形成L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；(4)用去離子水清洗浸泡的玻碳電極，去除多余的L-半胱氨酸和殼聚糖，得到 L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學(xué)傳感器。將待測AA標準溶液加入pH為5. 0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，作為電解液，放入電解池中，并以以L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬電極為輔助電極，置于電解液中，電化學(xué)測試。每次掃描結(jié)束，將三電極置于空白底液中循環(huán)掃描至無峰，用二次蒸餾水沖洗，濾紙吸干后即可進行下一次掃描，這樣可保持電極良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，實驗均在室溫下進行。玻碳電極包括玻碳基底，玻碳基底表面吸附有L-半胱氨酸/殼聚糖響應(yīng)膜，玻碳基底與一電極引線相連，電極引線外側(cè)包覆有絕緣層。見圖1。本發(fā)明具有靈敏度高、選擇性高的優(yōu)點。下面通過電化學(xué)測試的結(jié)果闡述本發(fā)明的優(yōu)點圖2為在不同pH條件下AA的峰電流，測定條件電解液為不同pH的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(0. lmol/L)，AA濃度為1. 0 X 10_4mOl/L，測定方法為循環(huán)伏安法，電位掃描范圍-0. 2 IV，掃描速度100mV/S，由圖可以看出，在pH為5. 0的條件下峰電流響應(yīng)最好；圖3為在不同修飾電極下AA的循環(huán)伏安曲線。測定條件電解液為pH5. 0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(0. lmol/L)，AA濃度為1. 5 X 10_3mol/L，測定方法為循環(huán)伏安法電位掃描范圍-0. 2 IV，掃描速度100mV/S，由圖可見L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的玻碳電極的峰電流最大，而裸電極上幾乎沒有峰電流響應(yīng)，L-半胱氨酸修飾電極和殼聚糖修飾電極雖然有峰但電流響應(yīng)很小，說明經(jīng)過L-半胱氨酸/殼聚糖修飾后的電極兼具了二者的優(yōu)勢，能夠更好地對AA產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)，提高了傳感器的靈敏度；圖4為不同AA濃度下的線性伏安曲線，測定條件電解液為pH5. 0.的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(0. lmol/L)，測定方法為線性伏安法掃描范圍-0. 2 IV，掃描速度100mV/S。 可以看出峰電流在AA濃度為1. OX 10_5 2. OX 10_3mol/L的范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系，檢出限為4. 3X 10_6mol/L(CL = 3Sic/X ；CL為檢出限，si為樣品測量讀數(shù)的標準偏差，c為樣品含量值，X為樣品測量讀數(shù)平均值。)。
權(quán)利要求
1.一種檢測L-抗壞血酸的方法，其特征在于采用基于L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的工作電極的電化學(xué)傳感器對溶液中L-抗壞血酸的濃度進行測定，步驟如下(1)將待測L-抗壞血酸樣品加入乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，以此作為電解液；控制電解液 PH 為 5. 0-5. 4 ；(2)以L-半胱氨酸/殼聚糖修飾的玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極， 鉬電極為輔助電極，置于(1)中所述的電解液中，電化學(xué)測試。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于電解液中L-抗壞血酸濃度為4. 3X 10_6mol/L 2. OX 10_3mol/L，調(diào)整電解液pH為5. 0。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于電解液中L-抗壞血酸濃度為1. OX 10_5 2. OX 10_3mol/L。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于電化學(xué)傳感器的工作電極結(jié)構(gòu)為在玻碳電極基底表面有一層L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；其制備步驟如下(1)打磨拋光玻碳電極，使其基底表面平整光潔，超聲清洗其表面，得到預(yù)處理的玻碳電極；(2)將殼聚糖和L-半胱氨酸加入到醋酸溶液中，不斷攪拌使之溶解充分；其中，殼聚糖的含量為0. 5 0. 7wt%, L-半胱氨酸的含量為0. 3 0. 5wt% ；(3)將⑴所得到的玻碳電極侵入(2)所制得的溶液中，室溫下自組裝3-7小時，得到 L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；(4)將(3)中制得的L-半胱氨酸/殼聚糖修飾玻碳電極用蒸餾水清洗，去除多余的 L-半胱氨酸和殼聚糖，室溫下晾干，得到L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學(xué)傳感器的工作電極。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于醋酸溶液的體積濃度為1_2%。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于打磨拋光玻碳電極的過程是采用拋光粉對玻碳電極進行打磨、拋光。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測L-抗壞血酸的方法，采用新型L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的L-抗壞血酸(AA)電化學(xué)傳感器，包括玻碳電極，玻碳電極上有L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜，能對低含量的AA進行檢測。本發(fā)明公開了傳感器的制備方法，包括玻碳電極預(yù)處理；殼聚糖和L-半胱氨酸醋酸溶液的制備；將預(yù)處理的玻碳電極浸入所制得的溶液中，室溫下自組裝5～7分鐘，得到L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；洗去玻碳電極上多余的L-半胱氨酸和殼聚糖，得到L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學(xué)傳感器。本傳感器對AA檢測其具有制備簡便、快速、靈敏的優(yōu)點，AA濃度為1.0×10-5～2.0×10-3mol/L的范圍內(nèi)峰電流成良好線性關(guān)系，檢出限為4.3×10-6mol/L。
文檔編號G01N27/26GK102375008SQ20101026178
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者侯保榮, 龐雪輝, 張潔, 解建東, 譚福能, 隋衛(wèi)平, 魏琴 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所