專利名稱：一種利用紫外分光光度法測定植物中抗壞血酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生理生化分析領(lǐng)域，具體涉及ー種利用紫外分光光度法測定植物中抗壞血酸含量的方法。
背景技術(shù)：
抗壞血酸，又稱維生素C，是動植物體內(nèi)維持生命所必需的ー種物質(zhì)?？箟难嶙鳛榧毎麅?nèi)重要的還原物質(zhì)，它具有維持細胞氧化還原電位，清除活性氧，維持維生素E的還原狀態(tài)等重要作用。高等動植物體內(nèi)存在的谷胱甘肽——抗壞血酸氧化還原系統(tǒng)是細胞內(nèi)的多條電子傳遞鏈之一，參與細胞內(nèi)能量代謝，防止含巰基蛋白質(zhì)的氧化，延緩細胞衰老的進程。對抗壞血酸的各方面研究方興未艾，測定各種生物組織中抗壞血酸含量是研究抗壞血酸的合成，代謝及生理作用的必要手段之一?？箟难?維生素C)分為脫氫抗壞血酸和還原型抗壞血酸，相對應的，不同的方法可以測定脫氫型抗壞血酸和總抗壞血酸的含量。目前國家標準中規(guī)定的蔬菜水果總抗壞血酸的測定方法為熒光法和2，4- ニ硝基苯肼法(GB/ T5009. 86-2003)。國家標準中規(guī)定的還原型抗壞血酸的測定方法為2，6-ニ氯靛酚滴定-こ 醚萃取法(GB/T 12143. 3-89)和固藍鹽B顯色法(GB/T 5009. 159-2003)。幾種方法適合于食品質(zhì)量檢測固藍鹽B顯色法。適用于實驗分析的小樣品抗壞血酸含量測定方法僅有紅菲羅啉顯色法和高效液相色譜法。而目前的紅菲羅啉顯色法精確度不高，而高效液相色譜法操作條件不易控制且較繁瑣。而且，上述國標方法采用間接法測定，會受到樣品中其他物質(zhì)的干擾，比如2，6_ ニ氯靛酚滴定法受樣品中其它還原物質(zhì)干擾，固藍鹽B顯色法受蛋白質(zhì)的影響。發(fā)明人考慮采用紫外分光光度法直接測定抗壞血酸含量是最快捷最廉價的方法， 但是準確度同樣容易受到樣品中其他物質(zhì)的干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用適當?shù)姆椒ǔC正檢測背景，使該檢測準確度得到充分保證的利用紫外分光光度法測定植物中抗壞血酸含量的方法。本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的ー種利用紫外分光光度法測定植物中抗壞血酸含量的方法，包括標準樣品溶液的制備、標準曲線線性回歸方程的獲得、待測樣品的制備、紫外檢測及濃度計算，所述的待測樣品的制備、紫外檢測及濃度計算包括如下步驟a.待測樣品的制備將每2.5 3. 5g偏磷酸和7.5 8. 5mLこ酸用水定容至 IOOml得到偏磷酸-こ酸水溶液，將該溶液與待測物勻漿，離心，取上清液即為待測物提取液；取體積相等的兩份待測物提取液(分別作為測定組和校正組，兩份待測物提取液還可以根據(jù)樣品中抗壞血酸含量均用偏磷酸-こ酸溶液稀釋至待測物提取液體積的2 5倍)， 用堿處理法破壞第一份待測物提取液背景的光吸收(即波長為245nm下的吸光度超出紫外分光光度計的測定范圍)，第二份待測物提取液加入氯化鈉溶液，使其含有的氯化鈉濃度與第一份待測物提取液中生成的氯化鈉濃度相同；b.待測樣品的紫外檢測采用紫外分光光度法測定兩份樣品提取液在波長為 245nm下的吸光度；c.待測樣品濃度的計算將“b”步驟測得的兩次吸光度的差值作為抗壞血酸含量的測量值，代入標準曲線線性回歸方程，計算出待測樣品中抗壞血酸的濃度。待測液用紫外分光光度計測定245nm下的吸光度，兩次吸光度的差值(A-B)值代入標準方程求出回歸值，即為樣品液的抗壞血酸濃度C，樣品的抗壞血酸含量為CXV/W，其中V是加入偏磷酸-こ酸水溶液的體積，W為待測樣品鮮重。該方法中所述的堿處理法破壞其中一份待測物提取液背景的光吸收包括以下步驟向待測物提取液中加入濃度為I 10mol/L的氫氧化鈉溶液，優(yōu)選2 4mol/L的氫氧化鈉溶液，將提取液的PH值調(diào)節(jié)至大于12，混勻后室溫放置10 30分鐘，再加入鹽酸將 PH值調(diào)回原值，所使用的鹽酸濃度優(yōu)選與氫氧化鈉溶液的濃度相同。步驟“a”所述的勻漿時，偏磷酸-こ酸水溶液與待測物采用的比例優(yōu)選為5ml 0.2 lg，所述的離心的條件可以為10000 12000 (X g)，離心10 20分鐘。所述的標準樣品溶液的制備包括以下步驟用去離子水配制5g/L的抗壞血酸溶液，用偏磷酸-こ酸溶液稀釋成多個不同濃度的標準樣品溶液，濃度范圍為5 50mg/L，即用偏磷酸-こ酸水溶液配制呈濃度梯度的抗壞血酸標準液。所述的標準曲線線性回歸方程的獲得是將濃度范圍為5 50mg/L的多個不同濃度的標準樣品溶液分別采用紫外分光光度法進行檢測，檢測波長為245nm，將得到的吸光度繪制標準曲線，井根據(jù)朗伯-比爾定律計算獲得標準曲線線性回歸方程。本發(fā)明所述的待測物為不含單寧酸的植物或植物部位，植物部位可以是植物的莖、葉或根部，所述的植物優(yōu)選為蔬菜、果樹、灌木，如茶樹葉等，本發(fā)明方法特別適用測定十字花科蕓薹屬葉用蔬菜中抗壞血酸的含量，該類蔬菜優(yōu)選白菜、甘藍等，可采用其莖、葉測定其中抗壞血酸含量。在偏磷酸-こ酸水溶液中，抗壞血酸在245nm下的吸光特性符合朗伯比爾定律。植物樣品的偏磷酸-こ酸水提取液中，存在酚等物質(zhì)在245nm下有吸光度，影響測定結(jié)果，因此需要將樣品中的抗壞血酸破壞掉以除去樣品提取液的背景干擾?？箟难嵩趶妷A性溶液中極其不穩(wěn)定，會迅速發(fā)生不可逆的變化，形成在245nm下沒有光密度的物質(zhì)，而強堿性溶液中抗壞血酸及各種有機物的紫外光密度大大增加，導致紫外吸光無法測量，本發(fā)明加入對應的強酸將PH值還原即可測定背景干擾。本發(fā)明采用紫外分光光度差減法，建立了ー種操作簡單的測定植物組織中還原型抗壞血酸的方法。該方法不需要復雜的儀器設(shè)備和昂貴的藥品，只需要常規(guī)的紫外分光光度計和常規(guī)藥品即可完成。本發(fā)明比較了三種清除抗壞血酸以矯正背景的方法。在實驗中，發(fā)現(xiàn)加入銅離子用量不易控制，量大則影響樣品本身的吸光度，量少對抗壞血酸清除效果不佳，且加入銅離子后需煮沸，使操作繁復；活性炭處理對抗壞血酸清除效果極佳，但活性炭本身可以吸附一些色素物質(zhì)和酚類物質(zhì)，使樣品背景受到較大影響，對于不同的植物樣品測定效果不穩(wěn)定， 處于旺盛生長階段的茶樹葉片和甘藍葉片，用活性炭校正背景后測定的結(jié)果比其它方法的測定值高出3倍之多；用NaOH調(diào)節(jié)待測溶液體系PH值大于6時，抗壞血酸標準液與植物組
4織提取液在波長為245nm下的吸光度大幅増加，超出紫外分光光度計的測定范圍，葉片樣品提取液的顏色加深，再用HCl調(diào)節(jié)待測溶液體系PH值為I 2時，其吸光度回到紫外分光光度計的測定范圍，葉片樣品提取液的顏色恢復至無色透明；用NaOH調(diào)節(jié)待測溶液體系 PH值大于12，再用HCl將PH值調(diào)回I 2，經(jīng)檢測100mg/L的抗壞血酸的偏磷酸-こ酸水溶液中抗壞血酸破壞率大于98% (通過245nm下吸光度判斷)。本發(fā)明調(diào)解pH過程能生成高濃度氯化鈉，實驗中未發(fā)現(xiàn)氯化鈉在245nm下對偏磷酸-こ酸水溶液的吸光度造成明顯的影響，但為了排除高鹽對其他物質(zhì)的不可知的影響，在補齊體積時優(yōu)選使用2 4mol/ L NaCl，使測定組與校正組之間可能出現(xiàn)的差異最小。與現(xiàn)有技術(shù)比較本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用紫外分光直接測定法準確有效地清除溶液體系中的抗壞血酸以測定背景對吸光度的干擾。本發(fā)明采用堿處理后調(diào)回PH值的方法校正樣品背景，操作簡單，清除效率高，適合小量植物組織的批量測定。但是，單寧酸在堿性環(huán)境下受破壞嚴重且在245nm下有明顯的光吸收，富含單寧酸的植物不適合本發(fā)明中的方法。因此，本發(fā)明方法適用于不含單寧酸的植物中抗壞血酸含量測定，特別適用十字花科蕓薹屬葉用蔬菜的含量測定。


圖I為實施例I標準樣品溶液中抗壞血酸濃度與吸光度A-B的線性關(guān)系圖。
具體實施例方式以下通過具體實施例進ー步說明本發(fā)明。但實施例的具體細節(jié)僅用于解釋本發(fā)明，不應理解為對本發(fā)明總的技術(shù)方案的限定。其中，抗壞血酸購自于Sigama公司。實施例I.配制偏磷酸-こ酸水溶液將偏磷酸15g，こ酸40mL和250mL水混合后，加熱攪拌至偏磷酸溶解，用水定容至500mL。2.配制抗壞血酸標準樣品溶液用去離子水配制濃度為5g/L的抗壞血酸溶液，用偏磷酸-こ酸溶液分別稀釋成濃度為50mg/L, 40mg/L, 30mg/L, 20mg/L, lOmg/L, 5mg/L的標準液。3.標準曲線線性回歸方程的獲得將上述多個不同濃度的標準樣品溶液分別采用紫外分光光度法進行檢測，檢測波長為245nm，將得到的吸光度繪制標準曲線，井根據(jù)朗伯-比爾定律計算獲得標準曲線線性回歸方程(如圖I所示)。4.待測樣品的制備準確稱取0. 2 Ig白菜(Brassica rapapekinensis或 Brassica campestris pekinensis 或 Brassicapekinensisノ ロ十片，刀U入 5mL 偏憐酸一乙酸水溶液勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管中，10000 12000 (Xg)離心10分鐘，取上清液，分為兩等份，其中一份稀釋一倍，因為白菜抗壞血酸含量高，該步驟為調(diào)節(jié)待測液濃度符合本方法的測定范圍，另ー份加入等體積的10mg/L抗壞血酸-偏磷酸標準液。5.待測樣品的測定每份再分別吸取2mL至兩個IOmL離心管，其中ー個加入
I.5mg/LNaCl溶液2mL，混勻，轉(zhuǎn)入石英比色皿，用紫外分光光度計測定245nm下吸光度A ； 另外ー個離心管加入3mg/L NaOH溶液lmL，將提取液的pH值調(diào)節(jié)至大于12，混勻，靜置10 分鐘，加入3mg/L HCL溶液ImL，混勻，將pH值調(diào)回至I 2，測定吸光度245nm下吸光度B。
6.待測樣品濃度的計算將步驟5測得的兩次吸光度的差值(A-B)作為抗壞血酸含量的測量值，代入標準曲線線性回歸方程，計算出待測樣品中抗壞血酸的濃度C。樣品的抗壞血酸含量為CXV/W，其中V是加入偏磷酸-こ酸水溶液的體積，W為待測樣品鮮重。按上述方法測定同樣生長環(huán)境下三份白菜葉片樣品。I.計算樣品的抗壞血酸含量，加樣回收率及標準偏差。結(jié)果表I所示表I
權(quán)利要求
1.ー種利用紫外分光光度法測定植物中抗壞血酸含量的方法，包括標準樣品溶液的制備、標準曲線線性回歸方程的獲得、待測樣品的制備、紫外檢測及濃度計算，其特征在于所述的待測樣品的制備、紫外檢測及濃度計算包括如下步驟a.待測樣品的制備將每2.5 3. 5g偏磷酸和7. 5 8. 5mLこ酸用水定容至IOOml得到偏磷酸-こ酸水溶液，將該溶液與待測物勻漿，離心，取上清液即為待測物提取液；取體積相等的兩份待測物提取液，用堿處理法破壞第一份待測物提取液背景的光吸收，第二份待測物提取液加入氯化鈉溶液，使其含有的氯化鈉濃度與第一份待測物提取液中生成的氯化鈉濃度相同，待測物為不含單寧酸的植物或植物部位；b.待測樣品的紫外檢測采用紫外分光光度法測定兩份樣品提取液在波長為245nm下的吸光度；c.待測樣品濃度的計算將“b”步驟測得的兩次吸光度的差值作為抗壞血酸含量的測量值，代入標準曲線線性回歸方程，計算出待測樣品中抗壞血酸的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用紫外分光光度法測定植物中抗壞血酸含量的方法，其特征在于步驟“a”中所述的堿處理法破壞第一份待測物提取液背景的光吸收包括以下步驟 向待測物提取液中加入濃度為I lOmol/L的氫氧化鈉溶液，將提取液的pH值調(diào)節(jié)至大于 12，混勻后室溫放置10 30分鐘，再加入濃度為I 10mol/L的鹽酸將pH值調(diào)至I 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用紫外分光光度法測定植物中抗壞血酸含量的方法，其特征在于所述的標準樣品溶液的制備包括以下步驟用去離子水配制5g/L的抗壞血酸溶液， 用偏磷酸-こ酸溶液稀釋成多個不同濃度的標準樣品溶液，濃度范圍為5 50mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用紫外分光光度法測定植物中抗壞血酸含量的方法，其特征在于所述的標準曲線線性回歸方程的獲得是將濃度范圍為5 50mg/L的多個不同濃度的標準樣品溶液分別采用紫外分光光度法進行檢測，檢測波長為245nm，將得到的吸光度繪制標準曲線，井根據(jù)朗伯-比爾定律計算獲得標準曲線線性回歸方程。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用紫外分光光度法測定植物中抗壞血酸含量的方法，其特征在于步驟“a”所述的取體積相等的兩份待測物提取液再分別用偏磷酸-こ酸溶液稀釋至待測物提取液體積的2 5倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用紫外分光光度法測定植物中抗壞血酸含量的方法，其特征在于步驟“a”所述的勻漿時，偏磷酸-こ酸水溶液與待測物采用的比例為5ml : 0.2 lg。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用紫外分光光度法測定植物中抗壞血酸含量的方法，其特征在于步驟“a”所述的離心的條件為10000 12000 (Xg)，離心10 20分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用紫外分光光度法測定植物中抗壞血酸含量的方法，該方法測定樣品提取液中抗壞血酸的紫外吸收值，再用堿處理法破壞抗壞血酸測定背景紫外吸收值，兩者的差值計算抗壞血酸的含量。特點在于測定背景樣品時采用高濃度堿處理方法，使還原型抗壞血酸清除完全，同時避免了堿性環(huán)境對待測液紫外吸收的影響。該方法操作簡單，測定結(jié)果準確，不易受到還原性物質(zhì)的干擾，適用于植物學研究中數(shù)量較多的樣品抗壞血酸的測定。
文檔編號G01N21/33GK102608056SQ201210081629
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者侯喜林, 張碩, 李英 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學