專利名稱：一種提高黃素氧化酶活力的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，具體地說，是關于一種利用血紅蛋白VHb提高黃素氧化 酶活力的方法。
背景技術：
在氧氣缺乏的環(huán)境下， 一種好氧細菌透明顫菌(P7/MMc! /" sp.)能夠合成血紅蛋白 (版,函Hemoglobin, VHb) (Wakabayashi， S.， et al. Nature. 1986, 322, 481-483; Dikshit， K. L., et al. Nucleic Acids Res. 1990， 18,4149-4155)。 VHb為同型二聚體,帶有兩個相對分 子量為15,775的亞基，每個亞基含有146個氨基酸殘基和兩個b型血紅素(Tarricone,C., etal. Structure. 1997,5,497-507)。完整的VHb是可溶性的，但是脫去血紅素輔基便不可 溶。VHb已在細菌，酵母，真菌和植物細胞中獲得了成功表達，在低氧環(huán)境下能提高宿主 細胞生長量(Kallio, R T. and Bailey， J. E.. Biotechnol. Prog. 1996, 12, 31-39)，提高相應酶 的表達量(Bhave, S. L. and Chattoo, B. B.. Biotechnol. Bioeng. 2003, 84， 658-666)和有價值的中間代謝物的產量，在體內表達VHb有顯著效果的例子有大腸桿菌中OC—淀粉酶活力提高了 3.3倍(Khosravi， M.， et al.. Plasmid. 1990, 24， 190-194)，鐵蛋白表達量提高了 1.8 倍(Chung,Y.J.,Kim，etal..Mol. Biol. 1998, 31,503-507);產黃頂頭孢霉菌C4crewo"iww 中頭孢菌素C (CPC)產量提高3.2倍(Demodena, J. A., et al. Bio-Technology. 1993,11,926-929);促進了假單胞菌(/^Womo"w sp.)對有機污染物苯甲酸降解和伯克 霍爾德菌(5wr編c/mV sp.)對2, 4—二硝基甲苯降解(Kim， Y" et al.. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2005, 32, 148-154)。研究表明，當VHb在異源宿主中表達可以提高tRNAs和核糖體水平、細胞呼吸活力 和ATP產量(Nilsson, M, et al. Biotechnol. Prog. 1999， 15, 158-163; Roos， V" et aL Biotechnol. Prog. 2002， 18,652-656)，但是，人們還是沒有完全搞清楚新陳代謝效果和血 紅蛋白VHb功能之間的聯系。VHb具有一個高的氧結合和釋放系數(Giangiacomo， L.， et al.. Biochemistry. 2001, 40, 9311-9316),高氧結合系數反映了 VHb有較高的氧結合能力，但 是更高的氧釋放系數表明VHb能夠更迅速釋放氧(Webster, D. A.. Structure and function of bacterial hemoglobin and related proteins. In Eichorn， G. C. and Marzilli， L. G. (eds.)， Advances in inorganic biochemistry, New York, Elsevier, 1987,. pp. 245-265)。 VHb與紅酵母D-氨基酸氧化酶(DAO)融合后在大腸桿菌中獲得成功表達，得到的 融合蛋白VHb-DAO轉化CPC的催化效率提高了 i2.5倍，穩(wěn)定性提高約3倍(Khang， Y. H., et al. Biotechnol. Bioeng. 2003， 82, 480-488) 。 Khang等提出，由于VHb中潛在位點與DAO 中FAD結合域存在較強的相互作用，使得VHb同時起到了一個氧供體和氧受體作用。由于DAO是一種黃素氧化酶，其以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為輔因子，而VHb 與紅酵母DAO融合后能夠提高CPC的氧化效率，因此我們推測VHb在反應體系中起 到氧載體作用，因為DAO催化過程中需要氧氣，所以VHb的存在增強了DAO的催化效 率。發(fā)明內容為了驗證上述推測，本申請的發(fā)明人分別以游離的和固定化的透明顫菌血紅蛋白 (VHb)對三種黃素氧化酶——三角酵母D —氨基酸氧化酶(DAO)、葡萄糖氧化酶(GOD) 和醇氧化酶(AOD)的催化活性的影響進行了研究。研究結果表明，不管是游離的還是固定化的VHb,對于黃素氧化酶的催化活性都有明 顯的增效作用。因此，本發(fā)明的首要目的就在于提供一種提高黃素氧化酶催化活性的方法。 本發(fā)明的另一目的在于提供一種VHb用于促進黃素氧化酶催化活性的應用。 本發(fā)明的提高黃素氧化酶催化活性的方法包括將VHb作為助催化劑用于黃素氧化酶 的催化反應體系，所述VHb可以是游離的形式，也可以是固定化酶的形式。實驗表明，本發(fā)明的使用VHb作為助催化劑的方法，可以顯著提高黃素氧化酶的催 化氧化的能力；而且，相比現有技術報道的融合蛋白的形式，本發(fā)明的方法可以在催化氧 化過程中，通過外源添加的方式補充VHb，因此，在實際應用中更有優(yōu)勢。


圖1為用于在重組大腸桿菌BL21(DE3)中表達重組血紅蛋白VHb的重組表達質粒 pHVHB的構建流程圖。圖2為樣品不同純化階段的SDS-PAGE (15%)電泳圖，凝膠用考馬斯亮蘭染色，其 中1和6為Marker, 2為重組菌株BL21 (DE3)/pLHB-3的粗提物，3為使用含有500 mM咪 唑的洗脫緩沖液洗脫的HDAO，其分子量為41.4 kDa， 4為重組菌株BL21(DE3)/pHVHB 的粗提物，5為使用含有500mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫的HVHb,其分子量為17.9 kDa。圖3顯示了固定化VHb對固定化HDAO酶活性的影響。圖4顯示了游離VHb對固定化HDAO酶活性的影響。
圖5顯示了游離VHb對固定化GOD和固定化AOD酶活性的影響。 圖6顯示了固定化VHb對固定化GOD和固定化AOD酶活性的影響。
具體實施方式
以下結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限定本發(fā)明的范圍。根據本發(fā)明，HDAO為帶有組氨酸純化標簽的D—氨基酸氧化酶(DAO)， HVHB為 帶有組氨酸標簽的透明顫菌血紅蛋白(VHb)。本發(fā)明中，VHb的基因表示為vg6或者Z/v/^或者v/^; DAO的基因表示為kfao;融 合蛋白HVDAO的基因表示為Z vctoo。以下實施例中，除特別說明外，DNA片段連接、質粒的制備、化學轉化導入宿主菌、 克隆等操作均參照《分子克隆》(Sambrook，J.，Fritsch，E. R,Maniatis，T. (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed，，' Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY )。以下對實施例中所用的實驗材料及其來源作說明親和純化樹脂Sepabeads FP-IDA-N產購自Resindion R.S丄公司；固定化載體為環(huán)氧型載體，其中Sepabeads EXE16， Sepabeads Ec-Ep購于Resindion R.S丄公司)；Eupergit C禾卩Eupergit CM購于Degussa公司；Amberzyme oxirane resin購于 Rohm&Haas公司。限制性內切酶和T4 DNA連接酶購于Takara公司。醇氧化酶(AOD)購于Sigma公司；葡萄糖氧化酶(GOD)購自TOYOBO公司，其他化學試劑都為分析純。質粒pET-28b(+): Novagen公司產品，大小為5.3 kb，含有組氨酸純化標簽以及卡那 霉素抗性基因，啟動子是T7/flc，并具有多個限制性酶切位點。LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基中酵母膏，蛋白胨購于OXOID公司。大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)購于Novagen公司。實施例1、重組質粒pHVHB的構建構建重組質粒pHVHB的過程如圖l所示，具體如下 首先設計如下擴增引物VHBF2 (上游)5'-GGAATTCCATATGTTAGACCAGCAAACC-3';和 VHBR2 (下游)5，-CCCAAGCTTTTATTCAACCGCTTGAGCGTA-3，以pUC-6S-VHb (CGMCC 1.6352)為模板，采用p/w酶(Sangon公司)擴增Genbank 序列號為X13516的vA6基因片段。PCR反應條件為:94°C， 30Sec， 55。C， 30 Sec， 72°C， 30 Sec， 30個循環(huán)。 使用上海華舜生物工程公司試劑盒，割膠回收PCR產物。PCR回收產物用M/e I和///"dlll雙酶切，割膠回收約450 bp的DNA片段，與經相 同酶切的載體pET-28b (Novagen公司產品，大小為5.3 kb，含有組氨酸純化標簽以及卡 那霉素抗性基因，啟動子是T7/"c，并具有多個限制性酶切位點)載體在T4DNA連接酶 作用下連接，連接條件為16'C連接4h;外源DNA與載體的摩爾比例是3: 1。連接產物用化學轉化方法轉化至感受態(tài)細胞DH5a以擴增重組質粒，然后參考《分子 克隆》以堿裂解法抽提質粒。得到的重組表達質粒命名為pHVHB,該質粒大小約為5.8kb，含有組氨酸純化標簽以 及卡那霉素抗性基因，啟動子是T7toc，并具有多個限制性酶切位點。重組表達質粒pHVHB經測序驗證為正確。實施例2、重組質粒pHVHB轉化大腸桿菌BL21(DE3)將重組表達質粒pHVHB用化學轉化法(CaCb法)轉化至大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)， 轉化產物涂布在含有50 pg/m卡那霉素的LB平板上，能在含卡那霉素的平板上生長的即 為轉化子，獲得的轉化子命名為BL21(DE3)/pHVHB。實施例3、 VHb的制備3.1、 BL21(DE3)/pHVHB的發(fā)酵取實施例2得到的轉化有重組表達質粒pHVHB的轉化子BL21(DE3)/pHVHB，接種 到含有50tig/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)至對數生長期。然后按照5 %接種量 將種子液接入裝有3LTB培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在37。C， 400rpm， 1.3vvm的條件下培 養(yǎng)至OD,達到1.0。調節(jié)溫度至3(TC，加入乳糖使其終濃度為1.5%，繼續(xù)培養(yǎng)約20h。發(fā)酵完畢后，發(fā)酵液在5000rpm下離心10min，菌體在一20'C下保存。3.2、 VHb的分離純化所有蛋白質純化操作主要在4°C進行。 3.2.1、菌體處理取凍融的菌體，按照每克菌體加入2ml裂解緩沖液(O.IM磷酸鈉，5%甘油，pH8.0) 的比例，用裂解緩沖液重懸菌體，并用壓榨機在2000 P.S.I的操作壓力下破碎細胞，工作 3個循環(huán)。破碎后的菌液在4。C， 12000rpm離心lh，回收上清液。3.2.2、 蛋白質柱分離稱取經預處理的樹脂FP-IDA-Np+裝柱，柱的尺寸是2 cmx50 cm，裝柱的樹脂約為20 ml。將上述步驟3.2.1獲得的上清液上柱，上柱速度為1.0柱體積/小時(1BV/h)。使用Washing Buffer (100 mM 7Hs-Cl， 50mM咪啤，250mMNaC1, 5%甘油，速度 1.0BV/h)洗去雜蛋白。過程中測定過氧化氫酶(上清液中所含雜蛋白)，當過氧化氫酶活 力為零時，結束Washing階段。然后使用Elution Buffer (100 mM JHy-Cl， 500mM咪唑， 250mMNaC，5%甘油，速度1.0BV/h)洗脫目的蛋白。3.2.3、 電泳分析分別取步驟3.2.1離心獲得的上清液(粗酶液)和步驟3.2.2柱分離獲得的純化的蛋白 樣品，使用15%SDS-PAGE進行檢測，結果如圖2所示。由圖2的結果可見，利用樹脂FP-IDA-N產一步法純化，可以得到純化的重組血紅蛋 白HVHb。HVHb成熟蛋白的氮基酸殘基數是166aa，理論分子量推算出來應該是17.9 kDa; 從SDS-PAGE結果可見，目的蛋白的分子量大致在14和21kDa的中間位置，與理論推算 值相符。實施例4、 D —氨基酸氧化酶(DAO)的制備4.1 、 DAO表達質粒轉化大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)本實施例中所使用的質粒pLHB-3按照劉洪波等(劉洪波等，生物工程學報，1999， 15(3): 337-342)的方法構建，大小為6.4kb，含有帶組氨酸純化標簽的DAO基因(HDAO 基因)以及卡那霉素抗性基因，啟動子是T7/ac。以DAO的表達質粒pLHB-3轉化大腸桿菌宿主菌BL21(DE3) (Novagen公司)，轉 化產物涂布在含有50 pg/ml卡那霉素的LB平板上，能在含卡那霉素的平板上生長的即為 轉化子，獲得的轉化子命名為BL21(DE3)/pLHB-3。4.2、 重組菌株發(fā)酵獲得DAO取4.1得到的重組菌株BL21(DE3)/pLHB-3，接種到含有50嗎/ml卡那霉素的LB培養(yǎng) 基中，37"培養(yǎng)至對數生長期。然后按照5 %接種量將種子液接入裝有3LTB培養(yǎng)基的5L 發(fā)酵罐中，在37。C， 400ipm， 1.3vvm的條件下培養(yǎng)至OD,達到1.0。調節(jié)溫度至30。C, 加入乳糖使其終濃度為1.5%，繼續(xù)培養(yǎng)約20h。發(fā)酵完畢后，發(fā)酵液在5000rpm下離心10min，菌體在-20。C下保存。4.3、 DAO的分離純化 4.3.1、 菌體處理取凍融的菌體，按照每克菌體加入2ml裂解緩沖液(O.IM磷酸鈉，5%甘油，pH8.0) 的比例，用裂解緩沖液重懸菌體，并用壓榨機在2000RS.1的操作壓力下破碎細胞，工作3 個循環(huán)。破碎后的菌液在4'C， 12000rpm離心lh，回收上清液。4.3.2、 蛋白質柱分離稱取預處理過的樹脂FP-IDA-N產裝柱，柱的尺寸是2cmx50cm，裝柱的載體約為20 ml。樣品上柱速度是1.0柱體積/小時(lBV/h)。使用Washing Buffer (100 mM 7Hy-Cl, 50mM咪唑，250mMNaCl， 5%甘油，速度1.0BV/h)去除雜蛋白。過程中測定過氧化氫 酶，當過氧化氫酶活力為零時，結束Washing階段。然后使用Elution Buffer( 100 mM 7h>Cl, 500mM咪唑，250mMNaCl， 5%甘油，速度1.0BV/h)，洗脫目的蛋白。4.3.3、 電泳分析分別取步驟4.3.1獲得的上清液(粗酶液)和步驟4.3.2柱分離獲得的純化的蛋白樣品， 使用15% SDS-PAGE進行檢測，結果如圖2所示。HDAO成熟蛋白的氨基酸殘基數是376aa，理論分子量推算出來應該是41.4KDa。由 圖2的結果可見，目的蛋白的分子量略小于43Kda，與理論推算值相符。實施例5、固定化酶的制備5.1、 固定化VHb的制備選用Amberzyme oxirane resin載體，VHb溶液的濃度為6.8 mg/ml，按照每120mg蛋 白使用lg載體的比例將載體投入VHb純酶液中，再加入兩倍體積的1.25 M、 pH8.0的磷 酸鉀緩沖液，在15。C， 100rpm下振蕩20h。然后用20ml磷酸鉀緩沖液(100mM， pH7.0) 沖洗干凈，并借助真空泵抽干水分，獲得固定化VHb。5.2、 固定化HDAO的制備選取5種環(huán)氧型載體SepabeadsEXE16， Sepabeads Ec-Ep， EupergitC， EupergitCM 和Amberzyme oxiraneresin，按照每300 mg蛋白使用lg載體的比例，分別投入HDAO (6.3 mg/ml)的純酶液中，處理方法與以上5.1的VHb相同，獲得固定化HDAO。5.3、 固定化葡萄糖氧化酶(GOD)和醇氧化酶(AOD)的制備選用Amberzyme oxirane resin, GOD和AOD溶液的濃度均為2mg/ml。按照每20mg 蛋白使用lg載體的比例將載體投入各純酶液中，處理方法與與以上5.1的VHb相同，獲 得固定化GOD和AOD。
實施例6、 VHb對于黃素氧化酶催化活性的影響6.1、 VHb對固定化HDAO活力影響首先對DAO催化反應系統進行說明，反應器容積約50ml，自身有恒溫裝置，頂端安 裝有一個攪拌槳，底部有砂芯漏斗，外接一個進氣管。分別取固定化的和游離的VHb作為助催化劑逐漸加入固定化DAO的催化反應體系 中，從酶反應器底部通入空氣(30 ml/min)，分別在2 min和10 min時取樣測定固定化 DAO的活力。具體測定方法如下取0.3克固定化DAO，加入15 ml 4%CPC溶液(用pH7.5， 0.1M磷酸鈉緩沖液配制， 用3mol/L氨水調節(jié)pH7.25)，循環(huán)水浴保溫2(TC， 400rpm攪拌，通入空氣30ml/min，轉 化過程中用3 mol/L氨水維持pH7.25。分別在2min和lOmin時用微量進樣器取出20 ^ 反應的樣品，加入20nl酸終止液，再加入960 ^U重蒸水，12000 rpm離心5 min，上清進 行HPLC測定，HPLC的具體條件如下流動相乙腈甲醇1.29% (v/v)乙酸=7.5: 15: 77.5;流速lml/min;波長260nm;柱子AZORBAXEclipseXDB-C8 (4.6X150nm， Agilent, US A)。酶活力定義1個單位(U) DAO酶活力定義為每分鐘產生的酮酸和GL-7-ACA微摩 爾數之和所需要的酶量。添加固定化VHb的固定化HDAO的活力測定結果如圖3所示，當固定化VHb加入 質量為50mg時，此時固定化HDAO活力是對照(未添加VHb)的1.7倍，當固定化VHb 質量增加至300mg時，固定化HDAO活力是對照的2倍。添加游離VHb的HDAO的活力測定結果如圖4所示，當添加游離VHb的質量從0.05 增加至l.Omg時，固定化HDAO活力持續(xù)增加，當加入l.Omg游離VHb后，HDAO固 定化酶活力與對照(未添加VHb)相比增加了3倍?？梢?，不管是游離的還是固定化的VHb，作為助催化劑都可以明顯提高DAO的催化 氧化活性。6.2、 VHb對固定化葡萄糖氧化酶(GOD)和醇氧化酶(AOD)活力影響 首先對固定化GOD和固定化AOD催化反應系統進行說明反應器容積約50ml，自身有恒溫裝置，頂端安裝有一個攪拌槳，底部有砂芯漏斗，外接一個進氣管。
分別取游離的和固定化的VHb作為助催化劑逐漸加入固定化GOD和固定化AOD的 催化反應體系中，從反應器底部通入氮氣(2ml/min)，反應10 min取樣測定固定化GOD 和固定化AOD活力。具體測定方法如下固定化GOD活力測定取5ml溶液A(將3.5mg辣根過氧化物酶與3.5mg 4-氨基安 替吡啉溶于20 ml的0.2M， pH7.0磷酸鈉緩沖液中，加入3 %苯酚溶液lml)與5ml溶液 B (0.36 mol/L葡萄糖溶液)混勻，在2(TC保溫5min，加入固定化GOD，反應10min后 取樣測定OD5(M)nm變化值。酶活力定義1個單位(U) GOD活力定義為每分鐘消耗1微摩爾葡萄糖所需要的酶固定化AOD活力測定取5ml溶液A(將3.5mg辣根過氧化物酶與3.5mg4-氨基安 替吡啉溶于20 ml的0.2M, pH7.0磷酸鈉緩沖液中，加入3 %苯酚溶液lml)與5ml溶液 B (0.2moI/L甲醇溶液)混勻，在2(TC保溫5min,加入固定化AOD，反應10min后取樣 測定OD鄉(xiāng)細變化值。酶活力定義1個單位(U) AOD活力定義為每分鐘消耗1微摩爾甲醇所需要的酶量。 如圖5所示為添加游離VHb的GOD和AOD的活力測定結果，可見對于固定化GOD, 當加入0.5mg和l.Omg游離VHb后，GOD固定化酶活力分別是對照(未添加VHb)酶 活力的1.4倍和1.6倍。同樣對于固定化AOD，當加入VHb后，酶活力分別提高了L2倍 和4倍。如圖6所示為添加固定化VHb的GOD和AOD的活力測定結果，可見在反應體系中 加入50mg和lOOmg固定化VHb，對于固定化GOD和AOD活力均有提高，當加入lOOmg 固定化VHb后，固定化GOD和AOD活力分別提高了 0.8禾H 1.5倍。雖然以上僅以固定化的D—氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶和醇氧化酶為材料，構建出 VHb和三角酵母DAO結合在一起所形成的融合蛋白HVDAO，并且將它們用于頭孢菌素 C氧化的反應體系，借以對本發(fā)明的技術方案進行了驗證，但是根據本發(fā)明的公開，將 VHb用于提高其他種類黃素氧化酶的活力，這對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。 因此，將VHb或者VHb和其它黃素氧化酶融合表達所形成的融合蛋白用于其他黃素氧化 酶催化的反應體系，同樣應屬于本發(fā)明的范圍。
權利要求
1、一種提高黃素氧化酶活力的方法，其特征在于，在黃素氧化酶的催化反應體系中加入透明顫菌血紅蛋白VHb作為助催化劑。
2、 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述透明顫菌血紅蛋白VHb為游離酶或 固定化酶。
3、 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述黃素氧化酶包括D—氨基酸氧 化酶、葡萄糖氧化酶以及醇氧化酶。
4、 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述黃素氧化酶為D—氨基酸氧化酶。
5、 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述VHb固定化酶的載體選自Sepabeads EXE16、 Sepabeads Ec-Ep、 EupergitC、 Eupergit CM或Amberzyme oxirane resin。
6、 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述VHb固定化酶的載體為Amberzyme oxirans resin
7、 一種透明顫菌血紅蛋白VHb用于提高黃素氧化酶的催化氧化活性的應用，其特征 在于，將所述透明顫菌血紅蛋白VHb用作助催化劑。
8、 如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述所述透明顫菌血紅蛋白VHb為游離 酶或固定化酶。
9、 如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述VHb固定化酶的載體選自Sepabeads EXE16、 Sepabeads Ec-Ep、 Eupergit C、 Eupergit CM或Amberzyme oxirane resin 。
10、 如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述VHb固定化酶的載體為Amberzyme oxirane resin 。
11、 如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述黃素氧化酶包括D—氨基酸氧化酶、 葡萄糖氧化酶以及醇氧化酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高黃素氧化酶催化效率的方法，構建出用于表達VHb和用于表達VHb和DAO結合在一起的融合蛋白HVDAO的重組大腸桿菌菌株；在固定化DAO催化頭孢菌素C氧化的反應體系中加入VHb；實驗表明，VHb可以顯著提高DAO催化頭孢菌素C氧化的能力，提高葡萄糖氧化酶和醇氧化酶的活力，同時其融合蛋白HVDAO的氧化活性高于DAO，因此，VHb可以用于提高黃素氧化酶的活力。
文檔編號C12N9/96GK101130766SQ200610030478
公開日2008年2月27日 申請日期2006年8月25日 優(yōu)先權日2006年8月25日
發(fā)明者姜衛(wèi)紅, 晟 楊, 楊蘊劉, 鄭華寶, 軍 陳 申請人:中國科學院上海生命科學研究院