專(zhuān)利名稱(chēng)：豬單胺氧化酶b蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種用于生物基因工程領(lǐng)域的蛋白質(zhì)編碼序列，特別是豬單胺氧化酶B(MAO-B)的蛋白編碼序列。
背景技術(shù)：
單胺氧化酶B(monoamine oxidase B，MAO-B)是一種結(jié)合在線粒體外膜上的黃素酶，這種酶是幾種重要的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)氧化降解過(guò)程中的關(guān)鍵酶。單胺類(lèi)物質(zhì)具有重要的神經(jīng)活性、血管活性和其它一些生命活動(dòng)必須的功能，因而單胺氧化酶B在正常的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)活性的調(diào)節(jié)中起著重要作用。單胺氧化酶(MAO)最初是1928年Hare發(fā)現(xiàn)的。1970年，根據(jù)其偏愛(ài)底物和抑制劑的專(zhuān)一性，MAO分A、B兩型。MAO-B的偏愛(ài)底物是苯乙胺(PEA)和芐胺，特異性地被deprenyl所抑制。
對(duì)MAO-B的研究更多的集中在其抑制劑對(duì)抑郁癥、精神分裂等疾病的治療上。近來(lái)人MAO-B(Binda等，2002)的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，并分辨出了跨膜區(qū)、FAD結(jié)合區(qū)、底物抑制物結(jié)合區(qū)，為設(shè)計(jì)更多專(zhuān)一、高效的抑制劑，從而為相關(guān)疾病的治療提供了更加有效的途徑。在現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中，氣候、飼料、斷奶等環(huán)境因素的變更以及受到運(yùn)輸、屠宰等的刺激時(shí)，豬只會(huì)表現(xiàn)出咬尾、打架、精神緊張、驚恐不安、經(jīng)常嚎叫、不食不睡、消化不良、腹瀉等癥狀，有的豬屠宰后出現(xiàn)蒼白、柔軟、滲水的劣質(zhì)肉(PSE肉)。這些應(yīng)激癥狀都會(huì)嚴(yán)重影響生產(chǎn)性能，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的損失。應(yīng)激反應(yīng)的基礎(chǔ)是體內(nèi)出現(xiàn)一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)紊亂。由于MAO-B在調(diào)節(jié)正常的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中的重要作用，其在仔豬斷奶應(yīng)激反應(yīng)中的作用應(yīng)該引起重視。
在對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的分析中，1988年，人肝MAO-B的全長(zhǎng)cDNA被克隆.由cDNA推導(dǎo)出的氨基酸序列分析表明MAO-B的分子質(zhì)量分別是5810ku，并證明了MAO-A和MAO-B是由不同的基因編碼的，并不是由同一種蛋白質(zhì)加工的產(chǎn)物。隨后牛、小鼠、大鼠、狗MAO-B的編碼蛋白序列相繼被獲得。其中狗的MAO-B蛋白編碼序列是在2003年獲得的，在Chie HASHIZUME，Masatoshi SUZUKI andKoji MASUDA，“Molecular Cloning of Canine Monoamine Oxidase Subtypes A(MAOA)and B(MAOB)cDNAs and Their Expression in the Brain”.J.Vet.Med.Sci..Vol.65893-898.(2003)，即Chie HASHIZUME，Masatoshi SUZUKI和KojiMASUDA等發(fā)表在日本《獸醫(yī)醫(yī)學(xué)雜志》(2003，65卷)上的“犬MAO-A和MAO-B cDNA的分子克隆及其在腦中的表達(dá)”一文中報(bào)道，他們用同源克隆的方法獲得了狗的MAO-B的蛋白編碼序列并將其序列和由序列推導(dǎo)出的氨基酸序列同其它哺乳動(dòng)物進(jìn)行了比較分析。但至今尚未發(fā)現(xiàn)克隆獲得豬MAO-B基因編碼蛋白序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種豬單胺氧化酶B蛋白編碼序列。使其能夠?yàn)槿祟?lèi)應(yīng)激相關(guān)疾病的研究提供動(dòng)物模型，本發(fā)明參考其它哺乳動(dòng)物MAO-B基因序列，并利用同源克隆和電子克隆方法，克隆測(cè)序獲得豬MOA-B的cDNA序列，并對(duì)不同物種MAO-B基因的CDS序列進(jìn)行同源性比較，將大大有益于為今后研究MAO-B基因與豬應(yīng)激敏感性的關(guān)系研究和人類(lèi)相關(guān)疾病的研究和治療。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明中豬MAO-B基因是以人的MAO-B的一段序列為探針進(jìn)行電子克隆而得到完整的編碼蛋白的核苷酸序列。電子克隆得到完整的編碼蛋白序列后，在得到的序列上設(shè)計(jì)引物，并以從仔豬結(jié)腸組織中提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，并克隆測(cè)序，驗(yàn)證電子克隆結(jié)果，最終獲得了豬MAO-B基因蛋白編碼序列。獲得的豬MAO-B基因蛋白編碼序列見(jiàn)SEQ ID NO.1。將豬MAO-B基因cDNA序列中的編碼序列(CDS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見(jiàn)SEQ ID NO.1。
本發(fā)明所獲得的豬MAO-B基因蛋白編碼序列具有SEQ ID NO.1中從第129-1691位的核苷酸序列，其同人、小鼠、大鼠、牛、狗單胺氧化酶B蛋白編碼序列同源性為92.73％。
所述的序列編碼具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，其同人、小鼠、大鼠、牛、狗單胺氧化酶B氨基酸序列同源性為93.81％。
在本發(fā)明中，“豬MAO-B基因蛋白編碼序列”指與SEQ ID NO.1的氨基酸序列相比，有5-10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1

在SEQ ID NO.1中，電子克隆產(chǎn)物長(zhǎng)度為2559bp，其中129-131位為起始密碼子ATG，1689-1691位為終止密碼子TGA，129-1691位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域(CDS)，RT-PCR驗(yàn)證擴(kuò)增并測(cè)序的產(chǎn)物為從第74-1763位長(zhǎng)度為1650bp的片段。在SEQ IDNO.1，豬MAO-B基因編碼520個(gè)氨基酸。
本發(fā)明首次從豬的組織中克隆得到了豬的MAO-B的蛋白編碼序列，為研究MAO-B在養(yǎng)豬生產(chǎn)中各種應(yīng)激反應(yīng)中的作用進(jìn)而為人類(lèi)相關(guān)疾病的研究提供動(dòng)物模型奠定了基礎(chǔ)。


圖1豬MAO-B基因cDNA序列克隆過(guò)程簡(jiǎn)圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1豬MAO-B基因cDNA序列的克隆MAO-B基因cDNA克隆過(guò)程見(jiàn)附圖1。
在克隆過(guò)程中所用到的實(shí)驗(yàn)方法具體操作方法如下1.電子克隆以人MAO-B基因CDS核苷酸序列為信息探針運(yùn)行NCBI中的BLASTn程序在豬的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，得到與探針高度吻合的一系列長(zhǎng)短不一的豬EST序列，然后將這些序列進(jìn)行拼裝連接得到一個(gè)長(zhǎng)的序列，然后再分別以得到的這段長(zhǎng)序列為探針再次在豬EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn，得到更多的EST序列，從而使序列向兩端延伸，最終將所獲得的序列進(jìn)行拼接得到完整的序列。
2.生物克隆驗(yàn)證(1)組織分離(Isolation)在豬場(chǎng)屠宰30日齡杜長(zhǎng)大商品仔豬，取結(jié)腸組織樣，迅速放入液氮中，冷凍后保存于實(shí)驗(yàn)室-70℃冰箱中，準(zhǔn)備提取組織總RNA。
(2)提取RNA的準(zhǔn)備工作玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡過(guò)夜，用自來(lái)水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗2遍，180℃烘烤4小時(shí)。
勻漿器、電泳槽用3％的雙氧水浸泡20-30分鐘，再用0.1％的DEPC水沖洗。由于未滅活的DEPC對(duì)PCR反應(yīng)有影響，可用0.5％的SDS處理。
Tip頭、EP管用0.1％的DEPC水浸泡過(guò)夜，高壓滅菌使DEPC失活。
雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每100ml水或溶液加0.1ml DEPC液，室溫放置過(guò)夜，高壓滅菌30分鐘DEPC失活。
(3)組織總RNA提取取100mg在液氮中凍存的組織樣放入有1ml Trizol(trizalreagent，invitrogen BRL，USA)的勻漿器管中勻漿。4℃ 12000g離心10分鐘。吸取上清液，15-30℃溫育5分鐘。加0.2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒。15-30℃溫育2-3分鐘。4℃ 12000g離心15分鐘。吸取上清液，加0.8ml異丙醇，混合均勻。15-30℃溫育10分鐘，4℃ 12000g離心10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清，加1ml 75％乙醇洗滌RNA，4℃ 7500g離心10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分裝，-70℃保存。
(4)組織總RNA的鑒定通過(guò)分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量并且用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量，具體方法如下電泳槽用RNA清洗液(100mM NaOH，1mM EDTA)浸泡4-5小時(shí)，再用DEPC處理過(guò)的水反復(fù)沖洗數(shù)次后倒入1×TBE待用。瓊脂糖凝膠用1×TBE配制。在10ul上樣緩沖液(2×TBE，13％菲可，0.1％溴酚蘭，7M尿素)中加入1ul以上組織總RNA，65℃變性10分鐘后立即放入冰水中2-3分鐘。點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠中電泳。
(5)引物設(shè)計(jì)及合成在電子克隆得到的豬MAO-B序列中CDS 5’上游和3’下游分別設(shè)計(jì)上下游引物(引物對(duì)B1)，以擴(kuò)增全長(zhǎng)CDS。引物用Primer Premier 5.0自行設(shè)計(jì)，由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如下F5’-CAGGGGCCGAGATCCAGACA-3’R5’-CTCCTTCCCCAAACCCACA-3’(6)RT-PCR擴(kuò)增按大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成10ul 2×Bca 1st Buffer，4ul 25Mm MgSO4，1ul dNTPMixture，0.5ul Rnase Inhibitor(40U/ul)，1ul BcaBEST Polymerase(22U/ul)，1ul Oligo dT Primer，1ul RNA Sample，1.5ul Rnase Free dH2O，總體系為20ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件65℃ 1分鐘，30℃ 5分鐘(15分鐘-30分鐘內(nèi)勻速升溫)，65℃ 25分鐘，98℃ 5分鐘，5℃ 5分鐘。PCR擴(kuò)增條件97℃變性5分鐘；95℃30秒→55℃ 30秒→72℃ 1分鐘，如此進(jìn)行30次循環(huán)；72℃延伸10分鐘，4℃保存。
(7)克隆和測(cè)序PCR擴(kuò)增片段的回收。片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，操作過(guò)程如下盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊，放入1.5mlEP管中。按每100mg瓊脂糖加入300ulS1液的比例加S1液，50℃水浴10分鐘。將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱，10000g離心1分鐘，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul W1液，10000g離心15秒，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul W1液，靜置1分鐘后，10000g離心15秒，倒掉管中液體。離心1分鐘。將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulT1液，靜置1分鐘后，10000g離心1分鐘，EP管中液體即為回收的DNA。
回收片段同T載體的連接。連接用TaKaRa pMD18-T Vector試劑盒，操作過(guò)程如下在EP管中制備下列連接反應(yīng)液pMD 18-T Vector(50ng/ul)0.5ul，DNA20-40ng，Solution 15ul，加dH2O至10ul。將上述反應(yīng)液在16℃反應(yīng)30分鐘(過(guò)夜也可以)，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。從-70℃冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶。100ul感受態(tài)細(xì)胞加入10ul連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘。42℃水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加400ul液體LB培養(yǎng)基，37℃復(fù)活50分鐘。取100ul鋪于LB平板上，平板含0.1％(V/V)的氨芐青霉Amp(100mg/ml)。37℃恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)。
轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)。用記號(hào)筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液(不含模板)的EP管中晃動(dòng)，使單菌落充當(dāng)模板。用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物同Marker一起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落，放入40ml LB液體培養(yǎng)基中，先在液體中加入0.1％(V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)，37℃過(guò)夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)粒回收。
質(zhì)粒的回收。質(zhì)?；厥沼蒙虾ＨA舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒，操作步驟如下將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的菌液加入1.5mlEP管中，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心，倒掉液體獲細(xì)菌沉淀。細(xì)菌沉淀不夠時(shí)可再加一次菌液離心。在細(xì)菌沉淀中加入250ulP1液，振蕩懸浮。加入250ulP2液，溫和搖勻，室溫靜置4分鐘。加入350ulP3液，溫和搖勻。離心10分鐘，將上清液小心移入吸附柱，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulW1，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulW1，靜置1分鐘，離心15秒，倒掉液體。離心1分鐘。將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulT1液，靜置1分鐘后，離心1分鐘。EP管中液體即為回收的質(zhì)粒。
質(zhì)粒的酶切鑒定。為了證明回收質(zhì)粒確為插入目的片段的重組質(zhì)粒，采用雙酶切法鑒定.本研究具體操作如下根據(jù)TaKaRa pMD18-T Vector圖，選擇內(nèi)切酶Bam HI和Hind III.保證目的片段中無(wú)這兩種酶的切點(diǎn)。組成如下酶切反應(yīng)體系Bam HI 1ul，Hin d III 1ul，10×K Buffer 2ul，DNA≤1ul，加dH2O至20ul。30℃反應(yīng)3小時(shí)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
重組質(zhì)粒的測(cè)序。取20ul重組質(zhì)粒于EP管中，封口膜密封，交生物技術(shù)公司測(cè)序。
實(shí)施例2豬MAO-B編碼序列同源性比較在GenBank上搜索并獲得人、牛、鼠、狗MAO-B基因編碼蛋白序列，將其同克隆測(cè)序獲得的本發(fā)明獲得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物學(xué)軟件DNAman上進(jìn)行序列同源性比較。比較結(jié)果顯示SEQ ID NO.1序列與人、牛、鼠、狗等物種MAO-B基因CDS序列同源性分別為92.73％，氨基酸序列同源性分別為93.81％。
本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下SEQ ID NO.1的信息<110>上海交通大學(xué)<120>豬MAO-B蛋白編碼序列<160>2
<210>1<211>2559<212>DNA<213>豬(sus scrofa)<220>
<221>CDS<222>(129)...(1691)<400>1cgccctgggc gggcaatata gccgctcggc ggaggcgcga gcgcgcgggg gcagcgcagc 60gggcaggggc cgagatccag acacccgagc agctggccac cggggcggcc cagagaaggg 120cgagcacc atg agc agc aag tgc gac gtg gtc gtg gta ggg ggc ggc atc tca ggt 176Met Ser Ser Lys Cys Asp Val Val Val Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly15 10 15atg gca gcg gcc aaa ctt ctg cat gac tct ggc ctg agt gtg att gtt 224Met Ala Ala Ala Lys Leu Leu His Asp Ser Gly Leu Ser Val Ile Val20 25 30ctg gaa gcc cgg gac cgc gtg gga ggc agg act tac acc gtc agg aac 272Leu Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Arg Thr Tyr Thr Val Arg Asn35 40 45caa caa gtt aaa tat gtg gac ctt gga gga tct tat gtt ggg cca act 320Gln Gln Val Lys Tyr Val Asp Leu Gly Gly Ser Tyr Val Gly Pro Thr50 55 60cag aat cgc atc tta aga ttg tcc aag gag cta gga ttg gag acc tac 368Gln Asn Arg Ile Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Leu Glu Thr Tyr65 70 75 80aaa gtg aat gaa gtg gag cgt ctg att cac tat gta aag ggc aaa tcc 416Lys Val Asn Glu Val Glu Arg Leu Ile His Tyr Val Lys Gly Lys Ser85 90 95tac ccc ttc agg ggc cca tta cca cct gtg agg aat ccg att acc ttc 464Tyr Pro Phe Arg Gly Pro Leu Pro Pro Val Arg Asn Pro Ile Thr Phe
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權(quán)利要求
1.一種豬單胺氧化酶B蛋白編碼序列，其特征在于，所獲得的豬MAO-B基因蛋白編碼序列具有SEQ ID NO.1中從第129-1691位的核苷酸序列，其同人、小鼠、大鼠、牛、狗單胺氧化酶B蛋白編碼序列同源性為92.73％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬單胺氧化酶B蛋白編碼序列，其特征是，所述的獲得的豬MAO-B基因蛋白編碼序列具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，其同人、小鼠、大鼠、牛、狗單胺氧化酶B氨基酸序列同源性為93.81％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的豬單胺氧化酶B蛋白編碼序列，其特征是，所述的豬MAO-B基因蛋白編碼序列，指與SEQ ID NO.1的氨基酸序列相比，有5-10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或者2或者3所述的豬單胺氧化酶B蛋白編碼序列，其特征是，所述的SEQ ID NO.1，在其中，電子克隆產(chǎn)物長(zhǎng)度為2559bp，其中129-131位為起始密碼子ATG，1689-1691位為終止密碼子TGA，129-1691位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域(CDS)，RT-PCR驗(yàn)證擴(kuò)增并測(cè)序的產(chǎn)物為從第74-1763位長(zhǎng)度為1650bp的片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或者2或者3所述的豬單胺氧化酶B蛋白編碼序列，其特征是，所述的SEQ ID NO.1，在其中，豬MAO-B基因編碼520個(gè)氨基酸。
全文摘要
一種用于生物基因工程領(lǐng)域的豬單胺氧化酶B的蛋白編碼序列。具有SEQ IDNO.1中從第129－1691位的核苷酸序列，其同人、小鼠、大鼠、牛、狗單胺氧化酶B蛋白編碼序列同源性為92.73％。具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，其同人、小鼠、大鼠、牛、狗單胺氧化酶B氨基酸序列同源性為93.81％。能夠?yàn)槿祟?lèi)應(yīng)激相關(guān)疾病的研究提供動(dòng)物模型，本發(fā)明參考其它哺乳動(dòng)物MAO－B基因序列，并利用同源克隆和電子克隆方法，克隆測(cè)序獲得豬MOA－B的cDNA序列，并對(duì)不同物種MAO－B基因的CDS序列進(jìn)行同源性比較，將大大有益于為今后研究MAO－B基因與豬應(yīng)激敏感性的關(guān)系研究和人類(lèi)相關(guān)疾病的研究和治療。
文檔編號(hào)C12N15/53GK1712532SQ20041002539
公開(kāi)日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2004年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月24日
發(fā)明者潘玉春, 白春艷, 孟和, 趙威, 李婧 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)