專利名稱：具有長期穩(wěn)定性的用于熱啟動pcr的干燥組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有長期穩(wěn)定性的用于熱啟動PCR的干燥組合物及其應(yīng)用。更確切地 說，本發(fā)明涉及通過向常規(guī)的PCR組合物中加入所需量的多元醇、無機焦磷酸鹽(以下稱為 “PPi”)和焦磷酸酶(以下稱為“PPase”)，使得用于熱啟動PCR的干燥組合物保持穩(wěn)定并 具有長期耐貯藏性(保質(zhì)期)。
背景技術(shù)：
PCR的特異性由與靶基因序列結(jié)合的引物的高嚴(yán)謹(jǐn)度決定。在預(yù)變性前將基因擴 增所必需的所有成分在室溫下進行混合。因而，在這一混合過程中發(fā)生了低嚴(yán)謹(jǐn)度的引發(fā) 作用(priming)。因為聚合酶在低溫下保持其酶活性，所以當(dāng)發(fā)生引發(fā)作用時，可能會產(chǎn)生 PCR產(chǎn)物。因此，除靶DNA序列的復(fù)雜性以及低反應(yīng)溫度之外，這一低嚴(yán)謹(jǐn)度的引發(fā)作用是 非特異性擴增的另一個關(guān)鍵原因。當(dāng)PCR循環(huán)重復(fù)進行時，非特異性擴增會消耗濃度有限 的引物和其他成分，這表明非特異性反應(yīng)本身起到類似于競爭性抑制劑的作用。非特異性 擴增尤其在低拷貝數(shù)靶DNA的檢測、低濃度DNA樣品的擴增以及同時使用不同引物的多重 PCR方面造成了嚴(yán)重的問題。為了努力克服PCR的所述問題，已經(jīng)開發(fā)了 “熱啟動PCR(hot-startPCR) ”。熱啟 動PCR是一種以獲得更純PCR產(chǎn)物為目的的PCR，其允許高溫混合每種反應(yīng)物，從而可通過 防止在室溫下經(jīng)常發(fā)生的低嚴(yán)謹(jǐn)度引發(fā)作用以及防止非特異性引物的低聚來增加PCR特 異性。進行熱啟動PCR最簡單的方式是打開熱反應(yīng)管并在其中加入必需的成分。然而， 這一方法會將反應(yīng)混合物暴露于污染之中，形成氣溶膠，并且造成蒸發(fā)。進行熱啟動PCR的 另一個方式是在必需成分之間(例如引物和模板之間)形成物理屏障。石蠟通常作為電 物理屏障使用。確切地說，用石蠟覆蓋反應(yīng)混合物，然后當(dāng)所述蠟變硬時，將試劑(起始試 劑)負(fù)載于其上，并向所述試劑加入礦物油。接著將PCR設(shè)備的溫度升高到70°C-9(TC。 然后將所述蠟熔解，所述反應(yīng)混合物和起始試劑得以混合，從而實現(xiàn)PCR。如同解釋的那 樣，所述蠟的熔解以及所述成分的混合在高溫下精確地發(fā)生。因此，這一方法有助于高嚴(yán) 謹(jǐn)度引發(fā)作用，也有助于不同DNA樣品的同時擴增，并且由于蠟和油層的存在保證了反應(yīng) 混合物的長期耐貯藏性。然而，上述方法較為麻煩并且需要很長時間(Bassan，B.J.和 Caentno-Anolles, G.，Biotechniques, 14 :30_34，1993)。此外，用作蒸發(fā)屏障的礦物油會 污染PCR樣品，所述礦物油作為不含DNA的條帶存在，使得定量PCR數(shù)據(jù)分析較為困難。因 此，為了改進這一方法，提出了單獨將石蠟珠用于熱啟動PCR的方法。石蠟珠直到55°C都會 形成固體層。因此，在室溫下，引物沒有與模板DNA充分混合，只有當(dāng)反應(yīng)溫度高于石蠟的 熔點時，引物才與模板DNA混合，表明這可能會增加PCR的特異性。石蠟位于微離心管的底 部，因此容易收集樣品并且成本低。因而，可以預(yù)計石蠟珠是用于改進熱啟動PCR的有前途 的候選物(ffainwright, L. A.和 Seifert, H. S.，Biotechniques, 14 34-36,1993)。另一個熱啟動PCR方法其特征在于使用凡士林(例如AmpliGrease)代替石蠟。這一方法類似于上述使用蠟和油的方法。確切地說，反應(yīng)混合物被分為兩層底部混合物和頂 部混合物。在所述兩層混合物之間加入凡士林以防止該兩層混合物在室溫下混合。凡士林 在低于蠟熔點的溫度下開始熔解(熔點約為50°C )，其冷卻后也不會再變硬，這與常規(guī)的1 使用賭的方法不同(Horton, R. M. ，Hoppe, B. L.禾口 Conti—Tronconi. ，Biotechniques, 16 42-43,1994)。然而，當(dāng)樣品量大時，這一方法存在缺陷。也就是說，當(dāng)過量使用樣品時，由 于兩層混合物之間的密度差異，所述的底部混合物和頂部混合物混合不充分。因此，這一方 法只在樣品量小的反應(yīng)中有效。所使用的其他方法例如使用通過將反應(yīng)混合物用蠟進行覆蓋而制備的反應(yīng)珠， 所述反應(yīng)混合物通過海藻糖溶液進行干燥(Kaijalainen，S.等人，Nucleic Acids Res.， 212959-2960，1993)；或者向反應(yīng)混合物中加入不同的有機溶劑以提高熱啟動PCR效率，所 述有機溶劑例如PEG、DMS0、甘油等作為PCR加速劑使用(Pomp，D.等人，Biotechniques， 10 58-59,1991)。如同上文所解釋的那樣，已經(jīng)對于成功的熱啟動PCR進行了研究和嘗試，熱啟動 PCR的必要性也已經(jīng)被廣泛認(rèn)可。然而，考慮到經(jīng)濟方面的因素以及有限的技能，熱啟動 PCR在使用方面仍然受限制，并且無法應(yīng)用于各種不同的實驗領(lǐng)域。令人遺憾的是，使用石 蠟珠進行熱啟動PCR的結(jié)果尚未如常規(guī)PCR的結(jié)果那樣成功。目前的熱啟動PCR只有在使 用 Taq DNA 聚合酶時才有用(Enneth, G.，Christy, J.，Atwood, S. M.和 Daiss, J. L.，1994， Biotechnology, 12 =506-509)。也就是說，要用其他聚合酶進行熱啟動PCR，則不得不單獨 構(gòu)建每種熱穩(wěn)定的聚合酶特異性抗體，會造成較長的準(zhǔn)備時間和高成本。為了克服所述問題，已經(jīng)開發(fā)了使用PPi和熱穩(wěn)定PPase的熱啟動PCR(韓國專利 No. 10-0292883以及美國專利No. 6951744)。特別地，這一方法的特征在于，通過加入與DNA 聚合反應(yīng)必需的鎂離子強烈結(jié)合的PPi來抑制室溫下的聚合酶反應(yīng)，然后PPase在高溫下 發(fā)生反應(yīng)除去PPi，由此開始反應(yīng)。這一方法無論哪種聚合酶都適用，并具有通過在聚合酶 反應(yīng)期間連續(xù)除去由脫氧核苷三磷酸生成的PPi來保持恒定反應(yīng)溫度的優(yōu)點。然而，一旦 通過這一方法制備了熱啟動PCR master混合物，即使在低溫下焦磷酸酶也會開始由Mg2+緩 慢地分解PPi，從而使DNA活化，造成熱啟動PCR效果降低。此外，PPase非常不穩(wěn)定。所 以，一旦將其加入到PCR master混合物，PPase就會在室溫或4°C下失去其活性。因此，這 種PCR master混合物不能在室溫或4°C下貯藏，而必須貯藏于_20°C。為了避免所述問題， 必須將PPase單獨貯藏在不同的容器中，而當(dāng)將其加入到反應(yīng)中時，必須將其與PPi分開加 入，相比于通常使用的常規(guī)PCR master混合物，造成了不便以及重現(xiàn)性方面的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服所述問題，提供用于熱啟動PCR的干燥組合物以及制造所述 干燥組合物的方法，所述干燥組合物具有改進的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和長期耐貯藏性，并因此在 各種不同的基因診斷和測試中具有改進的適用性。
具體實施例方式本發(fā)明者通過證實以下內(nèi)容完成了本發(fā)明相比于用于PCR的常規(guī)組合物，所述 用于熱啟動PCR的干燥組合物在除去非特異性產(chǎn)物、提高重現(xiàn)性和穩(wěn)定性、貯藏簡單且具有長期耐貯藏性以及方便使用等方面具有更大的優(yōu)勢，其中，所述干燥組合物通過向PCR 反應(yīng)混合物中加入PPi和PPase并將所述混合物進行干燥來制備，所述PCR反應(yīng)混合物包 含反應(yīng)緩沖液、MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)以及DNA聚合酶。本發(fā)明的用于熱啟動PCR的干燥組合物通過在反應(yīng)管中將所述反應(yīng)混合物進行 干燥來制備，其中所述反應(yīng)混合物包含反應(yīng)緩沖液、MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸、DNA聚合 酶、PPi和PPase。所述反應(yīng)混合物可進一步包含引物、探針、核酸模板和熒光染料?？蓪⑹袌錾系娜魏蜳Pase用作本發(fā)明的PPase而不作限制，其優(yōu)選的示例為來 源于大腸桿菌的Tte-無機焦磷酸酶(SibEnzyme Ltd.)，在所述大腸桿菌中，來源于嗜熱 棲熱菌B35(Thermus thermophilus B35)的無機焦磷酸酶基因被克隆；以及來源于大腸 桿菌的Pto-無機焦磷酸酶(Bioneer公司，韓國)，在所述大腸桿菌中，來源于嗜苦古菌 (Picrophilustorridus)的無機焦磷酸酶基因被克隆。將1單位Pto-無機焦磷酸酶定義 為1分鐘內(nèi)由焦磷酸鹽產(chǎn)生40nmol磷酸鹽所需的酶量。通過用Tris_HCl (pH 7. 5)、5mM的 MgCl2以及2. OmM的PPi以0. 5ml的總反應(yīng)體積在70°C將所述反應(yīng)進行10分鐘。本文中所述的熒光染料選自于由SyBr Green, EtBr和HRdye所組成的組。本文中所述的反應(yīng)緩沖液優(yōu)選10mM的Tris-HCl、40mM的KCl，pH 9。所述PCR組 合物中的PPi含量優(yōu)選0. 3-5. OmM，更優(yōu)選0. 95-3. OmM，最優(yōu)選2. OmM。如果PPi的含量高 于5. OmM, PPase的濃度需要成比例地增加。所述PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率隨之將會降低。如果PPi 的含量低于0. 3mM,所述PCR組合物捕捉Mg2+的活性將會降低，造成對于由非特異性引發(fā)作 用產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用無法令人滿意。所述PCR組合物中的PPase含量優(yōu) 選為每20 u 1 PCR混合物高于30mU直至200mU，更優(yōu)選為50_100mU，最優(yōu)選約80mU。如果 PPase的含量高于每20 u 1 PCR混合物200mM，與用低拷貝數(shù)DNA作為模板的情況相比，當(dāng) 用高拷貝數(shù)DNA作為模板時，只在過濃縮(over concentration)才可能對結(jié)果進行確認(rèn)， 并且反應(yīng)性也會降低，從而造成所述PCR產(chǎn)物減少。如果PPase的含量低于每20 ill PCR 混合物30mU，會產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物(參見圖3)。本文中所述的4種脫氧核苷三磷酸為 dATP、dTTP、dGTP和dCTP。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的DNA聚合酶都可用于本發(fā)明而不作限 制，特別是可獨立使用或共同使用具有5' -3'外切核酸酶活性的聚合酶、具有3' -5' 外切核酸酶活性的聚合酶以及不具有5' -3'核酸外切酶活性和3' -5'核酸外切酶 活性的聚合酶。所述具有5' -3'外切核酸酶活性的聚合酶的示例為Taq DNA聚合酶。 所述具有3' -5'外切核酸酶活性的聚合酶的示例為Pfu DNA聚合酶或TLA DNA聚合酶 (Bioneer公司，韓國)。所述不具有5' -3'外切核酸酶活性和3' -5'外切核酸酶活 性的聚合酶的示例為Top DNA聚合酶(Bioneer公司，韓國)。所述PCR組合物中DNA聚合 酶的含量為0. 1-10U (單位)，優(yōu)選0. 5-2U，更優(yōu)選1U。Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、 Top DNA聚合酶和TLADNA聚合酶所具有的特征如表1所示。表 1 本發(fā)明中，所述用于PCR的穩(wěn)定干燥組合物可進一步包含染料和/或多元醇，所述 染料和/或多元醇對于核酸不具有反應(yīng)性，其目的是為了方便實驗、防止PCR產(chǎn)物的污染、 使DNA聚合酶和dNTP保持穩(wěn)定、以及改進反應(yīng)性。本文中所述的“非反應(yīng)性染料”選自不影響PCR反應(yīng)的染料，其示例為可溶性染料 例如羅丹明、tamra、lax、溴酚藍(lán)、二甲苯青(xylenecyanole)、溴甲酚紅以及甲酚紅，其中更 優(yōu)選二甲苯青。在整個組合物中，該非反應(yīng)性染料的優(yōu)選含量為0. 0001-0. 01wt%，更優(yōu)選 0. 001-0. 005wt%，最優(yōu)選0. 001-0. 003wt%。如果非反應(yīng)性染料的含量低于0. OOOlwt %, 則意味著所述染料的含量過低而無法在瓊脂糖凝膠上通過電泳對PCR產(chǎn)物進行分析。也就 是說，很難通過肉眼觀察到樣品的移動。如果非反應(yīng)性染料的含量高于0. Olwt%，那么該高 含量的可溶性染料會在PCR期間起到反應(yīng)抑制劑的作用。此外，在沉降至瓊脂糖凝膠后，這 一較高的濃度中斷了電泳期間樣品的移動?？蓪⒍嘣甲鳛轭~外的穩(wěn)定劑，用于使本發(fā)明中的干燥組合物保持穩(wěn)定，所述多 元醇可為選自于由葡萄糖、甘油、甘露醇、半乳糖醇、葡糖醇和山梨醇所組成的組中的一種 或多種化合物。所述多元醇的含量優(yōu)選10-500mM，更優(yōu)選50-300mM。如果所述含量高于500mM,由于可溶性聚合物本身的溶解度，其幾乎無法制成可溶于水的溶液。此外，在這一高濃度下，由于高粘度，混合無法令人滿意，所述干燥產(chǎn)物的體積大于必需體積，并且在用于 PCR的基因溶液和無菌蒸餾水中的溶解也較為困難。此外，高濃度的可溶性聚合物可起到反 應(yīng)抑制劑的作用。相反，如果所述含量低于10mM，靶酶和表面水分子無法完全得到包覆，從 而不能適當(dāng)?shù)氐玫奖Ｗo。因此，在這一低濃度下，無法預(yù)期使酶的穩(wěn)定化效果，因為所述溶 液的粘性過低從而使得所述溶液在管的整個底部鋪展而無法適當(dāng)?shù)剡M行干燥，所述的酶也 沒有得到完全保護。在本發(fā)明中，除所述多元醇外，可使用明膠、牛血清白蛋白、Thesit或 PEG-8000作為穩(wěn)定劑?？赏ㄟ^常規(guī)方法之一進行干燥，所述常規(guī)方法例如室溫干燥、升溫干燥 (40-60°C )、冷凍干燥和真空干燥。只要不破壞所述組合物的組分，可使用任何干燥過程而 不作限制。干燥方法可根據(jù)酶的種類和量決定。在本發(fā)明中，可使用冷凍干燥或利用真空 離心作用進行的真空干燥。本發(fā)明中所述的組合物可不作限制地進行使用，不僅可用于常規(guī)的PCR，還可用于 任何核酸擴增方法例如多重PCR、實時PCR以及實時定量PCR。用于本發(fā)明的PPase是一種即使在至少70°C的高溫下也能保持穩(wěn)定的熱穩(wěn)定酶。 因此，所述PPase在整個PCR過程中都是穩(wěn)定的。PPase在Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)的溫度 下發(fā)生活化。因此，在Taq DNA聚合酶的作用下，通過PPase分離的Mg2+可適當(dāng)?shù)赜糜赑CR， 從而實現(xiàn)對于產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物的抑制。也就是說，只會產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物。因此，本發(fā)明 中所述的包含PPi和PPase的、用于熱啟動PCR的穩(wěn)定化的干燥組合物能克服用于熱啟動 PCR的常規(guī)master混合物溶液的問題，并且所述組合物不僅具有改進的穩(wěn)定性，而且具有 將目標(biāo)產(chǎn)物進行選擇性擴增的能力，這表明可實現(xiàn)精確的擴增。相比于常規(guī)的PCR組合物，本發(fā)明中所述的用于熱啟動PCR的穩(wěn)定化的干燥組合 物具有以下優(yōu)勢(1)本文中PCR反應(yīng)混合物的每種組分都混合在一起，并且將這一混合物在使用 前進行干燥。因此，混合過程在PCR期間不是必需的，這有利于防止由混合造成的錯誤。其 他優(yōu)點為防止通過PPase的熱啟動無效、抑制非特異性PCR產(chǎn)物、便于實驗、防止由PCR產(chǎn) 物造成的污染、使DNA聚合酶和dNTP保持穩(wěn)定以及提高反應(yīng)性。(2)向核酸中加入非反應(yīng)性染料或額外的穩(wěn)定劑，從而改進可用性和穩(wěn)定性，并具 有長期耐貯藏性。(3)所述組合物可應(yīng)用于普通的PCR過程而不需要在高溫下進行長時間的預(yù)處理。(4)本發(fā)明中所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物比常規(guī)的PCR組合物更為經(jīng)濟。(5)所述組合物能夠防止通過低嚴(yán)謹(jǐn)度引發(fā)作用生成PCR產(chǎn)物，從而使其能有效 地用于同時使用各種樣品的多重PCR。本發(fā)明還提供了所述用于熱啟動PCR的干燥組合物的制備方法。本發(fā)明中所述的制備方法包括下列步驟通過將反應(yīng)緩沖液、MgCl2、4種脫氧核苷 三磷酸、DNA聚合酶、焦磷酸鹽和焦磷酸酶混合來制備反應(yīng)混合物；以及將所述反應(yīng)混合物 進行干燥。在最終反應(yīng)混合物中，所述焦磷酸鹽的含量為0. 3-5mM，更優(yōu)選0. 95-3. OmM0所述焦磷酸酶的含量為30-200mU/20y 1，更優(yōu)選50_100mU。DNA聚合酶為選自于由下列物質(zhì)所 組成的組中的一種或多種酶具有5' -3'外切核酸酶活性的聚合酶、具有3' -5'外切 核酸酶活性的聚合酶、以及不具有5' -3'外切核酸酶活性和3' -5'外切核酸酶活性 的聚合酶。所述反應(yīng)混合物可進一步包含選自于由下列物質(zhì)所組成的組中的一種或多種組 分引物或探針、結(jié)合至DNA的熒光染料、模板核酸、對于核酸不具有反應(yīng)性的染料、多元 醇、明膠、牛血清白蛋白、Thesit以及PEG-8000。所述的熒光染料選自于由SyBr Green、 EtBr和HRdye所組成的組。所述染料選自于由羅丹明、tamra, lax、溴酚藍(lán)、二甲苯青、溴甲 酚紅和甲酚紅所組成的組。本發(fā)明還提供了用于熱啟動PCR的試劑盒，所述試劑盒由所述用于熱啟動PCR的 干燥組合物組成。所述試劑盒可通過用于PCR試劑盒的常規(guī)構(gòu)建方法進行制備。本發(fā)明還提供了用于擴增核酸的方法，所述方法使用了所述用于熱啟動PCR的干 燥組合物。所述方法包括以下步驟將包含模板核酸的樣品與所述用于熱啟動PCR的干燥組 合物混合；誘導(dǎo)反應(yīng)進行以擴增所述反應(yīng)混合物；以及分析所述模板核酸的擴增產(chǎn)物。此 時，通過多重PCR、實時PCR或?qū)崟r定量PCR來進行PCR。如同此前所解釋的那樣，相比于常規(guī)的組合物，本發(fā)明中所述的用于熱啟動PCR 的干燥組合物具有改進的長期耐貯藏性以及室溫下的穩(wěn)定性，從而使其可在室溫下長期貯 藏并具有重現(xiàn)性。此外，所述組合物包含每種必需組分，從而不僅可使其有效地用于多重 PCR,還可用于實時定量PCR。


參考附圖可以更好地理解本發(fā)明中優(yōu)選實施方式的應(yīng)用，其中圖1為顯示瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的照片，其中表示出了可抑制PCR反應(yīng)的PPi 濃度。1-16道顯示隨不同PPi濃度變化的結(jié)果，分別為0. 30mM、0. 35mM、0. 45mM、0. 50mM、 0. 60mM、0. 65mM、0. 75mM、0. 80mM、0. 90mM、0. 95mM、l. 30mM、l. 50mM、l. 80mM、2. 00mM、2. 5OmM 和3. OOmM0 M顯示IOObp長度的DNA梯狀標(biāo)記物(ladder marker) (Bioneer公司，韓國)。圖2為顯示瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的照片，其中表示出了在高PPi濃度下恢復(fù)PCR 反應(yīng)的PPase活性。1-16道顯示使用Taq DNA聚合酶反應(yīng)的結(jié)果。1道和2道顯示未用 PPi和PPase處理的陰性對照，3道和4道顯示只用1. OmM的PPi處理的情況。5_16道顯示 同樣在l.OmM PPi的存在下、而PPase濃度不同時進行PCR的結(jié)果，所述PPase濃度逐步為 200、100、50、25、12. 5,6. 3,3. 2,1. 6,0. 8,0. 4,0. 2 和 0. lmU。17-32 道顯示了使用 Pfu DNA 聚合酶的反應(yīng)的結(jié)果。17道和18道顯示未用PPi和PPase處理的陰性對照，19道和20道 顯示只用1. OmM的PPi處理的情況。21-32道顯示同樣在1. OmM PPi的存在下、而PPase濃 度不同時進行PCR的結(jié)果，所述PPase濃度逐步為200、100、50、25、12. 5,6. 3,3. 2,1. 6,0. 8、 0. 4,0. 2和0. lmU。M顯示IOObp長度的DNA梯狀標(biāo)記物。圖3為顯示瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的照片，其中表示出了在低PPi濃度下恢復(fù)PCR 反應(yīng)的PPase活性。1道和2道顯示未用PPi和PPase處理的陰性對照。3_5道顯示逐步 用0. 15,0. 2和0. 25mM的PPi進行 反應(yīng)的結(jié)果。6_10道顯示在同樣的0. 25mM PPi濃度下、而PPase濃度不同時進行PCR的結(jié)果，所述PPase濃度逐步為300、200、100、50和10mU。M顯示IOObp長度的DNA梯狀標(biāo)記物。圖4為顯示多重PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳的照片，其中在將含有PPi和PPase 的干燥的PCR預(yù)混合物在25°C進行2小時預(yù)反應(yīng)后誘導(dǎo)所述多重PCR。1道和2道顯示用 Jcc 尸ower 熱啟動PCR預(yù)混合物(Bioneer公司，韓國)進行PCR的結(jié)果。3道和4道顯 示用Jcew尸ower PCR預(yù)混合物(Bioneer公司，韓國)進行PCR的結(jié)果。5道和6道顯示 向PCR預(yù)混合物1中加入引物后進行PCR的結(jié)果。7道和8道顯示用PCR預(yù)混合物2進行 反應(yīng)的結(jié)果。9道和10道顯示向PCR預(yù)混合物3中加入引物后所誘導(dǎo)的反應(yīng)的結(jié)果。11 道和12道顯示用PCR預(yù)混合物4進行反應(yīng)的結(jié)果。13道和14道顯示用^cwP0we/1 HL PCR預(yù)混合物(Bioneer公司，韓國)進行反應(yīng)的結(jié)果。15道和16道顯示向PCR預(yù)混合物5 中加入引物后所誘導(dǎo)的PCR的結(jié)果。17道和18道顯示用預(yù)混合物6進行PCR的結(jié)果。19 道和20道顯示向預(yù)混合物7中加入引物后進行反應(yīng)的結(jié)果。21道和22道顯示用預(yù)混合物 8進行PCR的結(jié)果。M顯示IOObp長度的DNA梯狀標(biāo)記物。圖5為顯示多重PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳的照片，其中在將含有PPi和PPase 的干燥的PCR預(yù)混合物在37°C進行2小時預(yù)反應(yīng)后誘導(dǎo)所述多重PCR。1道和2道顯示用 AccuPower HL PCR預(yù)混合物(Bioneer公司，韓國)進行PCR的結(jié)果。3道和4道顯示
用預(yù)混合物進行PCR的結(jié)果，所述預(yù)混合物通過向HL PCR預(yù)混合物中加入 2. OmM的PPi和80mU的PPase進行制備。M顯示IOObp長度的DNA梯狀標(biāo)記物。圖6為顯示瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的照片，其中表示出了干燥預(yù)混合物在50°C反應(yīng) 溫度下的時間過程穩(wěn)定性，所述預(yù)混合物包含PPi、PPase、Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合 酶。1、3、5、7和9道顯示用本發(fā)明的組合物在50°C的反應(yīng)器中進行PCR的結(jié)果，其分別在 所述反應(yīng)器中保留0、1、2、3和4天。2、4、6、8和10道顯示用JCCMjpower HL PCR預(yù)混合 物在50°C的反應(yīng)器中進行PCR的結(jié)果，其分別在所述反應(yīng)器中保留0、1、2、3和4天。圖7顯示熱啟動master混合物溶液的穩(wěn)定性。圖8顯示本發(fā)明中干燥組合物的 穩(wěn)定性。1、2、3、4、5、6 和 7 道以及 M 分別顯示 139bp、211bp、447bp、618bp、1082bp、1296bp、 1561bp以及IOObp長度的DNA梯狀標(biāo)記物。圖9為顯示長片段PCR(Long kb PCR)結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳的照片，所述長片段 PCR使用λ -DNA與干燥預(yù)混合物進行，所述干燥預(yù)混合物為含有PPi、PPase和Taq DNA聚 合酶的干燥預(yù)混合物以及只含有Taq DNA聚合酶的干燥預(yù)混合物。1_8道顯示用含有Taq DNA聚合酶的所述預(yù)混合物進行長片段PCR的結(jié)果。9-16道顯示用含有2. OmM的PPi、80mU 的PPase以及Taq DNA聚合酶的所述預(yù)混合物進行長片段PCR的結(jié)果。1道和9道、2道和 10道、3道和11道、4道和12道、5道和13道、6道和14道、7道和15道、8道和16道分別 顯示擴增產(chǎn)物為 500bp、l. Okbp,2. Okbp,5. Okbp,8. OkbpUO. 0kbp、12. Okbp 以及 15. Okbp 的 PCR結(jié)果。Ml顯示Ikb長度的DNA梯狀標(biāo)記物。圖10為顯示長片段PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳的照片，所述長片段PCR使用 λ -DNA與干燥預(yù)混合物進行，所述干燥預(yù)混合物為含有PPi、PPase和Pfu DNA聚合酶的干 燥預(yù)混合物以及只含有Pfu DNA聚合酶的干燥預(yù)混合物。1-10道顯示用含有Pfu DNA聚 合酶的所述預(yù)混合物進行長片段PCR的結(jié)果。11-20道顯示用含有2. OmM的PPi、80mU的PPase以及Pfu DNA聚合酶的所述預(yù)混合物進行長片段PCR的結(jié)果。1道和11道、2道和12道、3道和13道、4道和14道、5道和15道、6道和16道、7道和17道、8道和18道、9道 和19道、以及10道和20道分別顯示擴增產(chǎn)物為500bp、l. 0kbp、2. 0kbp、5. 0kbp、8. Okbp, 10. 0kbp、12. 0kbp、15kbp、20. Okbp 以及 30. Okbp 的 PCR 結(jié)果。Ml 顯示 Ikb 長度的 DNA 梯狀 標(biāo)記物，M2顯示λ /Hind III梯狀標(biāo)記物。圖11為顯示長片段PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳的照片，所述長片段PCR使用 λ -DNA與干燥預(yù)混合物進行，所述干燥預(yù)混合物為含有PPi、PPase、Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶的預(yù)混合物以及含有Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶的預(yù)混合物。1_10道顯 示用含有Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶的所述預(yù)混合物進行長片段PCR的結(jié)果，11_20 道顯示用含有2. OmM的PPi、80mU的PPase、Taq DNA聚合酶以及PfuDNA聚合酶的所述預(yù)混 合物進行長片段PCR的結(jié)果。每一道和每種長度的梯狀標(biāo)記物與圖10所給出的說明相同。圖12為顯示通過用預(yù)混合物溶液進行實時PCR測定的熒光曲線圖，所述預(yù)混合物 溶液為含有Taq DNA聚合酶、PPi、PPase和熒光物質(zhì)(SyBrGreen)的預(yù)混合物溶液以及含 有Taq DNA聚合酶和熒光物質(zhì)的預(yù)混合物溶液。在該圖中，橫軸表示反應(yīng)循環(huán)，縱軸表示根 據(jù)所述反應(yīng)循環(huán)測定的熒光。藍(lán)線1為表示在實驗組中檢測到的熒光的曲線，紅線2為表 示在對照組中檢測到的熒光的曲線。圖13表示用由實時PCR證實的熒光曲線的熔解曲線的圖，所述實時PCR表示用預(yù) 混合物溶液進行的每個PCR，所述預(yù)混合物溶液為含有Taq DNA聚合酶、PPi > PPase和熒光 物質(zhì)(Greenstar )的預(yù)混合物溶液以及含有Taq DNA聚合酶和熒光物質(zhì)的預(yù)混合物溶液。 在該圖中，橫軸表示溫度變化，縱軸表示根據(jù)溫度升高測定的熒光。紅線1為實驗組的熔解 曲線，淺綠線2為對照組的熔解曲線。圖14為顯示用預(yù)混合物溶液進行的實時定量PCR結(jié)果的圖，所述預(yù)混合物溶液 含有Taq DNA聚合酶和熒光物質(zhì)(Greenstar )。在該圖中，橫軸表示反應(yīng)循環(huán)(以下稱為 "Cy. ”)，縱軸表示隨反應(yīng)循環(huán)測定的熒光。每條曲線表示通過實時定量PCR測定的熒光的 結(jié)果，所述實時定量 PCR 使用 T IOng, lng、lOOpg、10pg、Ipg 或 IOOfg 的 λ -DNA0圖15為顯示所述定量曲線線性的圖，其通過根據(jù)圖14中逐步稀釋的濃度而得的 熒光曲線進行繪制。在該圖中，橫軸表示所測定的熒光的Log取代數(shù)，縱軸表示反應(yīng)循環(huán)。 曲線表示用不同濃度的λ-DNA進行定量分析的結(jié)果，從右上到左下的λ-DNA濃度依次為 100fg、lpg、10pg、lOOpg、Ing以及IOngo根據(jù)所述定量曲線，PCR的效率為98%, PCR的線 性為 0. 9977。圖16為顯示通過圖14的熒光圖進行繪制的熔解曲線圖。在該圖中，橫軸表示溫 度變化，縱軸表示隨溫度升高而測定的熒光。圖17為顯示用預(yù)混合物溶液進行實時定量PCR結(jié)果的圖，所述預(yù)混合物溶液含有 Taq DNA聚合酶、熒光物質(zhì)(Greenstar )、0. 5mM的PPi以及0. 3mU的PPase。在該圖中，橫 軸和縱軸與圖14中的描述相同。圖18為顯示所述定量曲線線性的圖，其通過根據(jù)圖17中逐步稀釋的濃度而得的 熒光曲線進行繪制。在該圖中，橫軸和縱軸與圖15中的描述相同。根據(jù)所述定量曲線，PCR 的效率為104%, PCR的線性為0. 9989。圖19為顯示通過圖17的熒光圖進行繪制的熔解曲線圖。在該圖中，橫軸為溫度變化，縱軸表示隨溫度升高而測定的熒光。圖20為顯示用預(yù)混合物溶液進行實時定量PCR結(jié)果的圖，所述預(yù)混合物溶液含有Taq DNA聚合酶、熒光物質(zhì)(Greenstar )、2. OmM的PPi以及80mU的PPase。在該圖中，橫 軸和縱軸與圖14中的描述相同。圖21為顯示所述定量曲線線性的圖，其通過根據(jù)圖20中逐步稀釋的濃度而得的 熒光曲線進行繪制。在該圖中，橫軸和縱軸表示與圖15中相同的描述。根據(jù)所述定量曲線， PCR的效率為100%, PCR的線性為0. 9999。圖22為顯示通過圖20的熒光圖進行繪制的熔解曲線圖。在該圖中，橫軸表示溫 度變化，縱軸表示隨溫度升高而測定的熒光。圖23為通過將圖16的熔解曲線重疊于圖22的熔解曲線來表示其對比關(guān)系的圖。圖24為顯示長片段PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳的照片，所述長片段PCR使用人 DNA與預(yù)混合物進行，所述預(yù)混合物為含有PPi、PPase和Top DNA聚合酶的預(yù)混合物以及 只含有Top DNA聚合酶的預(yù)混合物。1-7道顯示用含有PPi、PPase以及Top DNA聚合酶的 所述預(yù)混合物進行長片段PCR的結(jié)果，8-16道顯示用只含有Top DNA聚合酶的所述預(yù)混合 物進行長片段PCR的結(jié)果。圖25-31為顯示使用樣品進行實時PCR結(jié)果的圖，所述樣品由本發(fā)明中所述的干 燥預(yù)混合物組合物獲得，所述組合物在50°C下貯藏，并從制得所述組合物起每1-2天作圖 直至第9天。對于對照組，在實驗之前制備含有組合物的溶液，所述組合物與用于所述實驗 組的干燥預(yù)混合物相同。圖32-40為顯示使用樣品進行實時PCR結(jié)果的圖，所述樣品由本發(fā)明中所述的干 燥預(yù)混合物組合物獲得，所述組合物在4°C或-20°C下貯藏，并從制得所述組合物起每周作 圖直至第7周。對于對照組，使用含有組合物的溶液，所述組合物與本發(fā)明中所述的干燥預(yù) 混合物相同。圖41為顯示在相同探針和引物的存在下，使用標(biāo)準(zhǔn)DNA模板與預(yù)混合物進行PCR 的結(jié)果圖，所述預(yù)混合物分別為含有PPi/PPase的本發(fā)明所述的用于熱啟動PCR的干燥預(yù) 混合物；以及其他三種來自不同制造商的預(yù)混合物。圖42為用相同的Y軸刻度表示預(yù)混合 物熒光的圖，所述預(yù)混合物為含有PPi/PPase的本發(fā)明中所述的用于熱啟動PCR的干燥預(yù) 混合物；以及其他三種預(yù)混合物。在該圖中，示出了產(chǎn)品之間的熒光差異。圖43為顯示使用干燥預(yù)混合物進行實時PCR的結(jié)果圖，所述干燥預(yù)混合物含有PPi和PPase而不含穩(wěn)定劑。圖44為顯示使用干燥預(yù)混合物在相同條件下進行實時PCR的 結(jié)果圖，所述干燥預(yù)混合物含有PPi、PPase和穩(wěn)定劑。圖45為顯示使用Exicycler第3版實時PCR設(shè)備(Bioneer公司，韓國)進行PCR 的結(jié)果圖。圖46顯示使用7500Fast (Applied Biosystems)進行PCR的結(jié)果。圖47顯 示使用 7500 (Applied Biosystems)進行 PCR 的結(jié)果。圖 48 顯示使用 Step-One (Applied Biosystems)進行 PCR 的結(jié)果。圖 49 表示使用 DNA engine opt icon (MJ Research Inc.) 進行PCR的結(jié)果。圖50為顯示使用含有西尼羅病毒(West Nile virus)E基因的DNA模板進行實時 PCR的結(jié)果圖。圖51為顯示使用含有水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus)0RF基 因的DNA模板進行實時PCR的結(jié)果圖。圖52為顯示使用含有HBV表面抗原基因的DNA模板進行實時PCR的結(jié)果圖。圖53為顯示使用所述用于熱啟動PCR的干燥預(yù)混合物進行實時PCR的結(jié)果圖。圖 54為顯示使用master混合物溶液(對照)進行實時PCR的結(jié)果圖，所述溶液含有與所述干 燥預(yù)混合物相同的組合物。圖55-60為顯示使用樣品進行實時PCR結(jié)果的圖，所述樣品由干燥預(yù)混合物組合 物獲得，所述組合物在50°C下貯藏，并從制得所述組合物起每1-2天作圖直至第9天。對于 對照組，使用含有組合物的溶液，所述組合物與所述干燥預(yù)混合物相同。圖61為顯示在相同的探針和引物的存在下，使用標(biāo)準(zhǔn)DNA模板與預(yù)混合物進行的 PCR結(jié)果的一組圖，所述預(yù)混合物分別為含有PPi/PPase和熒光物質(zhì)(Greenstar )的用 于熱啟動PCR的干燥預(yù)混合物；以及其他三種來自不同制造商的預(yù)混合物。在該圖中示出 了擴增曲線。圖62顯示了表示實時PCR結(jié)果的擴增曲線以及標(biāo)準(zhǔn)線，所述實時PCR使用干燥預(yù) 混合物按與上述相同的方式進行，所述干燥預(yù)混合物含有PPi和PPase而不含靶特異性引 物組和探針。圖63顯示了表示實時PCR結(jié)果的擴增曲線以及標(biāo)準(zhǔn)線，所述實時PCR使用干 燥預(yù)混合物按與上述相同的方式進行，所述干燥預(yù)混合物含有相同的PPi和PPase組合物， 還含有靶特異性引物組和探針。
實施例在下面的實施例中，對本發(fā)明實用的和現(xiàn)有的優(yōu)選實施方式進行說明。但是，可以理解的是，在考慮本發(fā)明所公開的內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā) 明的精神和范圍內(nèi)作出修改和改進。實施例1 抑制PCR的PPi濃度在此前的專利申請(韓國專利申請No. 10-1999-0004361)中，本發(fā)明者使用具有 低拷貝數(shù)的鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)基因組DNA作為模板，研究了能夠抑制PCR 反應(yīng)的PPi濃度。而在本發(fā)明中，本發(fā)明者不僅使用具有低拷貝數(shù)的靶DNA，還使用具有高 拷貝數(shù)的靶DNA，來嘗試測定能夠抑制低嚴(yán)謹(jǐn)度引發(fā)作用的PPi濃度。首先，使用含有Taq DNA聚合酶的預(yù)混合物(IOmM的Tris-HCl pH9. 0、40mM的 KCl、1.5mM的MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸(每種250 μ M)、IU的Taq DNA聚合酶以及穩(wěn)定 劑，Bioneer公司，韓國)。用5. Ong的λ -DNA作為模板DNA。分別將由序列編號1表示的 L137_F引物和由序列編號2表示的L137_R引物以10ρπιΟ1/20μ 1反應(yīng)液的濃度用于PCR， 所述L137_F引物生成長度137bp的PCR產(chǎn)物。以下列不同濃度加入PPi 0. 30,0. 35,0. 45、 0. 50,0. 60,0. 65,0. 75,0. 80,0. 90,0. 95,1. 30,1. 501. 80,2. 0,2. 5 和 3. OOmM0按下列步驟進行PCR 在94°C預(yù)變性5分鐘；在94°C變性30秒；在53°C退火40秒； 在72°C延伸40秒；從變性到延伸進行36個循環(huán)；以及在72°C最終延伸5分鐘。所述PCR 的結(jié)果用含有2. 0%瓊脂糖的0. 5xTBE緩沖液(Trizma堿、硼酸和0. 5M的EDTA，pH 8. 0)通 過電泳進行證實。結(jié)果，當(dāng)加入至少0. 95mM的PPi時，使用具有 高拷貝數(shù)的λ -DNA沒有由PCR生成 擴增產(chǎn)物(參見圖1的10-16道)。上述結(jié)果表明，PCR反應(yīng)可通過一定量的PPi中斷，并 且，當(dāng)靶DNA具有高拷貝數(shù)時，為抑制所述反應(yīng)，需要至少0. 95mM的PPi，更優(yōu)選至少2. OmM的PPi。隨著PPi濃度的降低，抑制PCR反應(yīng)的作用也在降低。實施例2 在高PPi濃度下恢復(fù)PCR反應(yīng)的PPase活件 在此前的專利文件(韓國專利申請No. 10-1999-0004361)中，本發(fā)明者使用具有 低拷貝數(shù)的鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)基因組DNA作為模板DNA，研究了恢復(fù)PCR 反應(yīng)的PPase活性。而在本發(fā)明中，本發(fā)明者不僅使用具有低拷貝數(shù)的靶DNA，還使用具有高拷貝數(shù)的 靶DNA，來嘗試測定能夠?qū)⒈籔Pi抑制的PCR反應(yīng)恢復(fù)的PPase濃度。首先，制備含有Taq DNA聚合酶的預(yù)混合物(IOmM的Tris-HCl pH9. 0、40mM的 KCl、1.5mM的MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸(每種250 μ M)、IU的Taq DNA聚合酶以及多元醇， Bioneer公司，韓國)以及含有PfuDNA聚合酶的預(yù)混合物(IOmM的Tris-HCl ρΗ 9. 0、40mM 的KCl、1. 5mM的MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸(每種250 μ M)、IU的Pfu DNA聚合酶、0. 01 %的 Tween 20以及多元醇，Bioneer公司，韓國)。用2. 5ng的λ -DNA作為模板DNA。分別將由序 列編號1表示的L137_F引物和由序列編號2表示的L137_R引物以10pmOl/20 μ 1反應(yīng)液的 濃度用于PCR，所述L137_F引物生成長度137bp的PCR產(chǎn)物。以1. OmM的濃度加入PPi以抑 制PCR反應(yīng)。為了恢復(fù)被PPi抑制的PCR反應(yīng)，分別以下列不同濃度加入PPase (SibEnzyme Ltd.) :200、100、50、25、12· 5、6· 3、3· 2、1· 6、0· 8、0· 4、0· 2 和 0. lmU/20 μ 1 反應(yīng)液。以在實 施例1中所描述的相同的方式進行PCR和電泳。結(jié)果，當(dāng)用3. 2mU-200mU的PPase進行處理時，分別使用Taq DNA聚合酶和Pfu DNA 聚合酶的兩個PCR都得以恢復(fù)從而形成擴增產(chǎn)物。特別地，當(dāng)用濃度為12. 5mU-100mU的 PPase進行處理時，PCR反應(yīng)性幾乎與未經(jīng)PPi和PPase處理的對照組相同(圖2)。這一 結(jié)果表明，PPase可有效地將被PPi抑制的PCR反應(yīng)恢復(fù)，表明可提高已被PPi抑制的PCR 反應(yīng)性，所述PPi抑制的目的是為了抑制在熱啟動PCR期間非特異性PCR產(chǎn)物的生成。實施例3 在低PPi濃度恢復(fù)PCR反應(yīng)的PPase活性的測定使用含有Taq DNA聚合酶的預(yù)混合物(IOmM的Tris-HCl ρΗ 9. 0、40mM的KC1、 1. 5mM的MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸(每種250 μ M) UU的Taq DNA聚合酶以及多元醇)。 使用2. Ong人基因組DNA作為模板DNA。分別將由序列編號20表示的Ρ65引物和由序列 編號21表示的ρ83引物以10ρπιΟ1/20μ 1反應(yīng)液的濃度用于PCR，所述Ρ65引物生成長度 1. 5kbp的PCR產(chǎn)物。以0. 15-0. 25mM的濃度加入PPi以抑制PCR反應(yīng)。為了恢復(fù)被0. 25mM 的PPi抑制的PCR反應(yīng)，分別以下列不同濃度加入PPase (SibEnzyme Ltd.) :300、200、100、 50和10mU/20 μ 1反應(yīng)液。以在實施例1中所描述的相同的方式進行PCR和電泳。結(jié)果，在陰性對照中生成非特異性反應(yīng)產(chǎn)物(圖3的1道和2道)。當(dāng)用0. 15mM 的PPi進行處理時，沒有完全捕捉Mg2+，從而生成了少量擴增產(chǎn)物(圖3的3道)。以等量 PPi對每個PCR進行處理，當(dāng)PPase濃度高于300mU時，由于PCR反應(yīng)性的降低，所述擴增產(chǎn) 物也顯著減少。同時，當(dāng)加入PPase直至50mU時，所述非特異性反應(yīng)產(chǎn)物沒有被抑制，并且 所述靶特異性產(chǎn)物也沒有增加(圖3的6-10道)。實施例4 使用PPi和PPase的多重PCR為了證實在所述PPi和PPase濃度下生成的擴增產(chǎn)物中的熱啟動效果，進行多重 PCR0 為此，向所述預(yù)混合物(IOmM 的 Tris-HCl ρΗ 9. 0、40mM 的 KC1、1. 5mM 的 MgCl2,4 種 脫氧核苷三磷酸(每種250 μ M)、IU的Taq DNA聚合酶、0. 01 %的Tween 20以及多元醇)(AccuPower PCR預(yù)混合物，Bioneer公司，韓國)中加入2. OmM的PPi和6OmU或8OmU的 PPase (SibEnzyme Ltd.)，然后將其干燥(以下稱為“預(yù)混合物1”和“預(yù)混合物3”)。向所述 預(yù)混合物中加大2. OmM的PPl、引物和60mU或80mU的PPase (SibEnzyme Ltd.)，然后將其干 燥(以下稱為“預(yù)混合物2”和“預(yù)混合物4”)。作為對照，使用jccw/>ower PCR預(yù)混合物 (Bioneer公司，韓國)或JccwPower 熱啟動PCR預(yù)混合物(Bioneer公司，韓國)(IOmM的 Tris-HCl pH 9. 0、40mM 的 KCl、1. 5mM 的 MgCl2、4 種脫氧核苷三磷酸(每種 250 μ M)、0. 01 % 的Tween 20以及多元醇，每20min反應(yīng)混合物含有20η的mAb以及0. 25U的Taq DNA聚合 酶)。 向所述常規(guī)的預(yù)混合物(IOmM 的 Tris-HCl pH 9. 0、40mM 的 KC1、1. 5mM 的 MgCl2、 4種脫氧核苷三磷酸(每種250 μ M)、IU的Taq DNA聚合酶、IU的Pfu DNA聚合酶、0. 01% 的Tween 20以及穩(wěn)定劑)(Jccw尸ower HL PCR預(yù)混合物，Bioneer公司，韓國)中加入 2. OmM的PPi和60mU或80mU的PPase (SibEnzyme Ltd.)，然后將其干燥(以下稱為“預(yù)混 合物5”和“預(yù)混合物7” )。向所述預(yù)混合物中加入2. OmM的PPi、引物和60mU或80mU的 PPase (SibEnzyme Ltd.)，然后將其干燥(以下稱為“預(yù)混合物6”和“預(yù)混合物8”)。作為 對照，使用HL PCR預(yù)混合物(Bioneer公司，韓國)(表2)。
此時，使用5ng人基因組DNA作為模板DNA，并以5pmol/20 μ 1反應(yīng)液的濃度使用 引物組，所述引物組為包含Ρ53引物(序列編號3)和ρ55引物(序列編號4)的引物組， 該引物組生成211bp的PCR產(chǎn)物；以及包含ρ55弓丨物(序列編號4)和ρ63引物(序列編號 5)的引物組，該引物組生成447bp的PCR產(chǎn)物。表 2 為了證實熱啟動的效果，將所述反應(yīng)混合物在25°C保持2小時(圖4)或在37°C 保持1小時(圖5)。按下列步驟進行PCR 在94°C預(yù)變性5分鐘；在95°C變性15秒；在 62°C退火30秒；在72°C延何40秒；從變性到延伸進行35個循環(huán)；以及在72°C最終延伸5 分鐘。同時，使用Ac^Power 熱啟動PCR預(yù)混合物按下列步驟進行對照PCR 在25°C保持 2小時；在95°C預(yù)變性15分鐘；在95°C變性15秒；在62°C退火30秒；在72°C延伸40秒； 從變性到延伸進行35個循環(huán)；以及在72°C最終延伸5分鐘。所述PCR的結(jié)果用含有2. 0% 瓊脂糖的0.5x TBE緩沖液通過電泳進行證實。由使用Taq DNA聚合酶進行的PCR結(jié)果證實，不同于顯示出低PCR反應(yīng)性和彌散 條帶(smeared band)的對照J(rèn)ccwPower PCR預(yù)混合物(圖4的3道和4道)，含有PPi、 PPase和引物的干燥預(yù)混合物以及首先加入PPi和PPase然后在加入引物前進行干燥的預(yù)混合物均顯示出高PCR反應(yīng)性和高特異性(圖4的5-12道)。通過與使用了抗DNA聚合 酶單克隆抗體的乂eo^iwer 熱啟動PCR預(yù)混合物(Bioneer公司，韓國)(圖4的1道和 2道)進行對比也證實，所述的預(yù)混合物顯示出高PCR反應(yīng)性和反應(yīng)特異性。由使用Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶進行的PCR結(jié)果還證實，相比于JecwjPowe^ HL PCR預(yù)混合 物(圖4的13道和14道)，在加入PPi、PPase和引物后進行干燥的預(yù)混合物以及加入PPi 和PPase然后在加入引物前進行干燥的預(yù)混合物顯示出更高的PCR反應(yīng)性和特異性(圖4 的15-22道或圖5的3道和4道)。在使用上述預(yù)混合物的情況下，所述彌散條帶顯著減 少。因此，證實了用于本發(fā)明的PPase可將被PPi抑制的PCR反應(yīng)有效恢復(fù)，這表明所述非特異性PCR產(chǎn)物得到了抑制而PCR反應(yīng)性得以提高，也就是說其對于熱啟動PCR是有 利的。特別地，即使在容易生成非特異性PCR產(chǎn)物的低溫下，也可將靶DNA特異性擴增。在 各種其他PCR產(chǎn)物中，非特異性擴增的抑制以及PCR反應(yīng)性的增加也得到了證實(圖4和 圖5)。實施例5 含有PPi和PPase的干燥預(yù)、混合物的穩(wěn)滬件為了研究所述干燥預(yù)混合物的熱穩(wěn)定性，向HL PCR預(yù)混合物 (Bioneer 公司，韓國)中加入 2. OmM 的 PPi 和 80mU 的 PPase (SibEnzyme Ltd.)，然后進行 干燥以制備所述干燥預(yù)混合物。將不含2. OmM PPi和80mU的PPase (SibEnzyme Ltd.)的 預(yù)混合物用于對照。在室溫下，將用于20μ 1反應(yīng)液的10μ 1的2χ溶液在大型中央蒸發(fā)器 (supercentra evaporator)中于真空條件下進行30分鐘的干燥。此時，使用5ng人基因組 DNA作為模板DNA，并以5ρπιΟ1/20μ 1反應(yīng)液的濃度使用引物組，所述引物組為包含由序列 編號3表示的ρ53引物和由序列編號4表示的ρ55引物的引物組，該引物組生成211bp的 PCR產(chǎn)物；以及包含由序列編號4表示的p55引物和由序列編號5表示的p63引物的引物 組，該引物組生成447bp的PCR產(chǎn)物。將上述制得的干燥組合物置于50°C的反應(yīng)器中。從第O天至第4天每天進行取 樣。將所獲得的樣品貯藏于冰箱中直至用于PCR。為了證實所述PCR產(chǎn)物，以與實施例1所 描述的相同的方式進行PCR和電泳。結(jié)果，直至將其置于50°C起的第4天，本發(fā)明中所述 的含有2. OmM PPi和80mU PPase的預(yù)混合物以及所述對照預(yù)混合物都顯示出PCR反應(yīng)性 (圖 6)。將常規(guī)的master混合物和本發(fā)明中所述的干燥預(yù)混合物的穩(wěn)定性進行對比。為 此，制備熱啟動master混合物溶液，將其在室溫(25°C -30°C )保持一段時間，然后進行所 述穩(wěn)定性試驗。在50°C對本發(fā)明中所述的干燥組合物測試其隨時間變化的穩(wěn)定性。20 μ 1 預(yù)混合物的組合物如下IOmM Tris-HCl ρΗ 9. 0、40mM的KC1、1. 5mM的MgCl2、4種脫氧核苷 三磷酸(每種250 μ M)、IU的Taq DNA聚合酶、0. 01 %的Tween 20、穩(wěn)定劑、2mM的PPi以及 500U 的 PPase。一段時間后，按如下步驟進行PCR 在30°C進行一個4小時的循環(huán)；在94°C進行一 個5分鐘的循環(huán)；然后重復(fù)32個如下循環(huán)在94°C進行20秒、在55°C進行40秒、在72°C進 行1分鐘；接下來，在72°C進行5分鐘的最終延伸。在37°C進行一個4小時的循環(huán)是為了證 實所述非特異性結(jié)合的形成。使用IOng人基因組DNA作為靶p53基因的模板。將p75 (序 列編號22)/P73(序列編號23)的引物組用于1道，將P55(序列編號4)/P53(序列編號3)的引物組用于2道，將P55(序列編號4)/P63(序列編號5)的引物組用于3道，將p75(序 列編號22) /p83 (序列編號21)的引物組用于4道，將p55 (序列編號4) /p73 (序列編號23) 的引物組用于5道，將p65 (序列編號20) /p83 (序列編號21)用于6道，將p55 (序列編號 4)/p83(序列編號21)的引物組用于7道。所得結(jié)果示于圖7和圖8中。如圖7和圖8所示，本發(fā)明中所述用于熱啟動PCR的干燥組合物即使在50°C保持 9天后仍保持了反應(yīng)性。然而，從置于室溫下第二天起，常規(guī)的熱啟動master混合物溶液就 不具有反應(yīng)性，沒有顯示出所述的熱啟動效果。實施例6 用含有PPi和PPase的干燥預(yù)混合物講行的長PCR使用λ -DNA作為模板，用含有PPi和PPase (SibEnzyme Ltd.)的所述干燥預(yù)混合 物進行PCR，來產(chǎn)生不同長度的擴增產(chǎn)物。為此，以與實施例5中所描述的相同的方式制備 所述用于熱啟動PCR的干燥組合物，即，將2. OmM的PPi和80mU的PPase同樣地加入下述 預(yù)混合物(1)含有Taq DNA聚合酶的預(yù)混合物，該預(yù)混合物包含IOmM Tris-HCl pH9. 0、 40mM的KCl、1.5mM的MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸(每種250 μ M)、IU的Taq DNA聚合酶、 0. 01 %的Tween 20以及穩(wěn)定劑；(2)含有Pfu DNA聚合酶的預(yù)混合物，該預(yù)混合物包含 IOmM Tris-HCl ρΗ 9. 0、40mM 的 KCl、1. 5mM 的 MgCl2、4 種脫氧核苷三磷酸(每種 250 μ Μ)、 IU的PfuDNA聚合酶、0.01%的Tween 20以及穩(wěn)定劑；以及(3)同時含有Taq DNA聚合酶和 Pfu DNA聚合酶的預(yù)混合物，該預(yù)混合物包含IOmM Tris-HClpH 9. 0、40mM的KC1、1. 5mM的 MgCl2,4種脫氧核苷三磷酸(每種250 μ M)、IU的Taq DNA聚合酶、IU的Pfu DNA聚合酶、 0. 01%的Tween20以及穩(wěn)定劑。使用20ng的λ -DNA作為模板DNA。為產(chǎn)生500bp_15. Okbp的產(chǎn)物，使用由序列 編號6表示的L303050-F作為正向引物，并使用由序列編號7-13表示的反向引物以產(chǎn)生 500bp、lkbp、2kbp、5. OkbpUO. 0kbp、12. Okbp 和 15kbp 的產(chǎn)物。為產(chǎn)生 20. Okbp 的產(chǎn)物，使 用由序列編號14和序列編號15表示的引物組成的引物組。并且，為產(chǎn)生30. Okbp的產(chǎn)物， 使用由序列編號16和序列編號17表示的引物組成的引物組。將每種含有Taq DNA聚合酶以及Taq DNA聚合酶/Pfu DNA聚合酶的反應(yīng)混合物 在37°C保持2小時，然后按下列步驟進行PCR 在94°C預(yù)變性5分鐘；在94°C變性30秒；在 68°C退火并延伸20分鐘；從變性到延伸進行28個循環(huán)；以及在72°C最終延伸10分鐘。同 時，使用只含有Pfu DNA聚合酶的預(yù)混合物按下列步驟進行PCR 在94°C預(yù)變性5分鐘；在 94°C變性30秒；在68°C退火并延伸20分鐘；從變性到延伸進行28個循環(huán)；以及在72°C最 終延伸10分鐘。所述PCR的結(jié)果用含有1. 0%瓊脂糖的0. 5x TBE緩沖液通過電泳進行證 實。結(jié)果，在每種條件下，含有2. OmM的PPi、80mU的PPase和Taq DNA聚合酶的所述預(yù) 混合物對于擴增500bp-15. Okbp的DNA顯示出高PCR反應(yīng)性。特別地，用15kbp的擴增產(chǎn) 物證實了熱啟動效果，所述熱啟動效果為非特異性反應(yīng)的顯著抑制以及高PCR反應(yīng)性(圖 9)。當(dāng)用含有Pfu DNA聚合酶的所述預(yù)混合物進行PCR時，直至5. Okb證實了其反應(yīng)性；然 而，當(dāng)用含有2. OmM的PPi、80mU的PPase和Pfu DNA聚合酶的預(yù)混合物進行PCR時，直至 10. Okb證實了其反應(yīng)性。也就是說，當(dāng)用PPi和PPase共同處理時，證實了熱啟動效果，所 述熱啟動效果為非特異性反應(yīng)的顯著抑制以及高PCR反應(yīng)性(圖10)。同樣得到證實的是， 當(dāng)使用含有2. OmM的PPi、80mU的PPase、Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶的預(yù)混合物進行PCR時，以及當(dāng)使用含有Taq DNA聚合酶和PfuDNA聚合酶的預(yù)混合物進行PCR時，直至 20. Okb其反應(yīng)性全部得到了證實。特別地，當(dāng)用PPi和PPase共同進行處理以生成1. Okb 的產(chǎn)物時，所述非特異性反應(yīng)得以消除(圖11)。也就是說，熱啟動效果得到了證實，所述熱 啟動效果為非特異性反應(yīng)的顯著抑制以及高PCR反應(yīng)性。實施例7 使用含有PPi和PPase的熱啟動反應(yīng)物講行的實時PCR 為了通過實時PCR研究含有PPi和PPase (SibEnzyme Ltd.)的PCR組合物的熱啟 動效果，向2x PCR預(yù)混合物溶液(包含IOmM Tris-HCl pH9. 0、50mM 的 KCl,2. OmM 的 MgCl2,4 種脫氧核苷三磷酸(每種 250 μ M)、1U 的 Taq DNA聚合酶、0. 01%的Tween 20以及穩(wěn)定劑)中，以0. 25χ/20 μ 1反應(yīng)液的濃度加入熒光 物質(zhì)(Greenstar ，Bioneer公司，韓國)，向所述溶液中加入濃度分別為2. OmM和80mU的 PPi和 PPase。對于對照組，向2x PCR預(yù)混合物溶液(包含IOmM Tris-HCl pH 9. 0、50mM 的KCl,2. OmM的MgCl2,4種脫氧核苷三磷酸(每種250 μ M)、1U的Taq DNA聚合酶、0. 01% 的Tween 20以及穩(wěn)定劑)中，以0. 25χ/20 μ 1反應(yīng)液的濃度加入熒光物質(zhì)(Greenstar ， Bioneer公司，韓國)。上述熒光物質(zhì)有助于在沒有序列特異性熒光探針的情況下進行簡 單的分析，所述分析僅通過測定在嵌入所述熒光物質(zhì)后產(chǎn)生的熒光來進行，所述熒光在DNA 擴增期間生成的雙鏈DNA中產(chǎn)生。使用Ing的λ -DNA作為模板DNA。分別以10pmOl/20 μ 1反應(yīng)液的濃度使用由序列 編號18表示的L90_F引物以及由序列編號19表示的L90_R引物，所述兩種引物生成90bp 的PCR產(chǎn)物。通過使用ABI 7500Fast系統(tǒng)(Applied Biosystems)按如下步驟進行PCR 在94°C預(yù)變性5分鐘；在95°C變性10秒；在60°C退火15秒同時延伸(40個循環(huán))。在解 離步驟后，繪制所述擴增產(chǎn)物的熔解曲線以證實PCR的反應(yīng)性和特異性。結(jié)果，如圖12所示，線1和線2的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)均為21. 19。因此，無論是否用 PPi或PPase進行處理，實時定量PCR的PCR反應(yīng)性都相等。如圖13所示，在由使用PPi和PPase的PCR得到的線1中觀察到一個清晰的熒光 峰，這表明生成了準(zhǔn)確的擴增產(chǎn)物。與此同時，通過由未使用PPi和PPase的PCR得到的線 2中的兩個熒光峰確定了兩種擴增產(chǎn)物，這意味著除所述目標(biāo)產(chǎn)物外，生成了另一小尺寸的 引物二聚體擴增產(chǎn)物。在實驗組(線1)和對照組(線2)中，所述目標(biāo)PCR產(chǎn)物的熔解溫 度(Tm)均為82.8°C。所述引物二聚體條帶的熔解溫度(Tm)為75°C，略低于上述溫度。由上述結(jié)果證實，用于本發(fā)明的PPase在實時PCR中恢復(fù)了被PPi抑制的PCR反 應(yīng)，因此其可抑制非特異性PCR的產(chǎn)生并增加PCR反應(yīng)性。相反，在所述對照組中，除所述 目標(biāo)PCR產(chǎn)物之外，還生成了引物二聚體，表現(xiàn)出了低特異性。實施例8 使用含有PPi和PPase的熱啟動反應(yīng)物進行的實時定量PCR通過實時定量PCR來檢驗由PPi和PPase產(chǎn)生的熱啟動效果。向2xPCR預(yù)混合物 溶液(包含IOmM Tris-HCl pH 9. 0、50mM的KC1、2. OmM的MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸(每 種250 μ M)、IU的Taq DNA聚合酶、0. 01%的Tween 20以及多元醇)中，以0. 25χ/20 μ 1反 應(yīng)液的濃度加入熒光物質(zhì)(Greenstar ，Bioneer公司，韓國)，向所述溶液中加入2. OmM的 PPi和80mU的PPase (SibEnzyme Ltd.)，從而實現(xiàn)組合物1的制備。向2x PCR預(yù)混合物 溶液(包含IOmM Tris-HCl pH 9. 0、50mM的KC1、2. OmM的MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸(每 種250 μ M)、IU的Taq DNA聚合酶、0. 01%的Tween 20以及多元醇)中，以0. 25χ/20 μ 1反應(yīng)液的濃度加入熒光物質(zhì)(Greenstar ，Bioneer公司，韓國)，向所述溶液中加入0. 5mM的 PPi和0. 3mU的PPase (SibEnzyme Ltd.)，從而實現(xiàn)組合物2的制備。對于對照組，向所述 2x PCR預(yù)混合物溶液中以0. 25χ/20 μ 1反應(yīng)液的濃度加入所述熒光物質(zhì)。將模板DNA(S卩λ-DNA)逐步稀釋，每次稀釋10倍，所得6個濃度依次為10ng、lng、 lOOpg、10pg、Ipg和lOOfg。以10pmOl/20 μ 1反應(yīng)液的濃度使用由序列編號18表示的L90_ F引物和由序列編號19表示的L90_R引物，所述兩種引物生成90bp的產(chǎn)物。PCR和熔解曲 線以在實施例7中所描述的相同方式進行繪制。對所述連續(xù)稀釋的模板的PCR效率(以下 稱為“E”)以及PCR線性(以下稱為“R2”)進行研究和比較，以證實所述熱啟動效果(圖 14和圖15)。如圖16所示，不同于圖13中在75°C證實的熒光峰，所述對照組中在87.5°C觀察 到熒光峰。也就是說，表示目標(biāo)PCR產(chǎn)物的熒光峰是在82. 8V的熔解溫度觀察到的峰，而 在87. 5°C的熔解溫度觀察到的另一個熒光峰表示非特異性反應(yīng)產(chǎn)物。從所述熔解曲線的頂 部到底部，將λ -DNA的濃度逐步稀釋為IOngUngUOOpg和10pg。圖14和圖15所示的實 時定量PCR的結(jié)果表明，生成了非特異性反應(yīng)產(chǎn)物。因此，這些結(jié)果不能被認(rèn)為是精確定量 PCR的結(jié)果(圖17和圖18)。如圖19所示，當(dāng)使用組合物2時，觀察到三個熒光峰。在82. 8°C的熔解溫度(Tm) 觀察到一個表示所述目標(biāo)產(chǎn)物的峰，在75°C的熔解溫度(Tm)觀察到表示引物二聚體的另 一個峰(圖19中的“I”)，在87.5°C的熔解溫度(Tm)觀察到最后一個峰，該峰表示比所述 目標(biāo)產(chǎn)物大的所述非特異性擴增產(chǎn)物(圖19中的“II”)。與圖16中的結(jié)果相比，由“II” 所表示的峰的大小有所降低，這表明了所述的熱啟動效果。然而，仍然生成了引物二聚體和 所述非特異性擴增產(chǎn)物。圖17和圖18所示的實時定量PCR結(jié)果表明，還生成了所述非特 異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體。因此，這些結(jié)果不能被認(rèn)為是精確定量PCR的結(jié)果(圖20和 21)。如圖22所示，當(dāng)使用組合物1時，僅在82. 8°C的熔解溫度觀察到一個熒光峰，這表 明生成了精確的目標(biāo)產(chǎn)物。在所述熔解曲線中，λ-DNA的濃度從頂部到底部依次為10ng、 lng、IOOpg和10pg。圖20和圖21顯示了表明所述特異性反應(yīng)產(chǎn)物的實時定量PCR的結(jié)果，所述結(jié)果表明準(zhǔn)確的目標(biāo)產(chǎn)物得到了擴增。也就是說，在實時定量PCR(qPCR)中也觀察到 了由PPi和PPase產(chǎn)生的所述熱啟動效果。與含有PPi和PPase的組合物2 (韓國專利申 請No. 10-1999-0004361)相比，組合物1沒有產(chǎn)生引物二聚體，并且使非特異性擴增產(chǎn)物的 產(chǎn)生最小化。圖23為通過將圖16的熔解曲線重疊于圖22的熔解曲線來表示其對比關(guān)系的圖。 在該圖中，橫軸表示溫度變化，縱軸表示隨溫度升高而測定的熒光。w/o (不含)PPi+PPase 表示由使用了 2x PCR預(yù)混合物溶液進行的實時定量PCR產(chǎn)生的熔解曲線。在該圖中，線1-4 表示在濃度依次為10ng、lng、100pg和IOpg處顯示出所述非特異性擴增產(chǎn)物的熒光峰，所 述濃度依次為10ng、lng、100pg和10pg。w/(含有)PPi+PPase顯示了由使用了 2x PCR預(yù) 混合物溶液進行的實時定量PCR產(chǎn)生的熔解曲線，所述溶液每20μ 1反應(yīng)液含有2. OmM的 PPi和80mU的PPase，這表明沒有生成非特異性擴增產(chǎn)物。實施例9 使用含有Top DNA聚合酶、PPi和PPase的干燥預(yù)混合物進行的PCR為了擴增不同長度的產(chǎn)物，使用人DNA作為模板，用含有Top DNA聚合酶、PPi和PPase的所述干燥預(yù)混合物進行PCR。為此，制備下述干燥組合物(1)含有Top DNA聚合 酶、PPi 和 PPase (SibEnzyme Ltd.)的預(yù)混合物(包含 IOmM Tris-HCl pH 9. 0、40mM 的 KC1、 1. 5mM的MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸(每種250 μ M)、IU的Top DNA聚合酶、0. 01 %的Tween 20,2. OmM的PPi、80mU的PPase以及穩(wěn)定劑)的干燥組合物；以及⑵含有Top DNA聚合 酶的預(yù)混合物(包含IOmM Tris-HClpH 9. 0、40mM的KC1、1. 5mM的Mg 2C12、4種脫氧核苷 三磷酸(每種250 μ M)、IU的Top DNA聚合酶、0. 01 %的Tween 20以及穩(wěn)定劑)的干燥組 合物。使用IOng人基因組DNA作為模板DNA。為了擴增139bp的產(chǎn)物，使用由序列編號22表示的正向引物以及由序列編號23表示的反向引物組成的引物組(圖24的1道和8 道)。為了擴增211bp的產(chǎn)物，使用由序列編號4表示的正向引物以及由序列編號3表示 的反向引物組成的引物組(圖24的2道和9道)。為了擴增447bp的產(chǎn)物，使用由序列編 號4表示的正向引物以及由序列編號5表示的反向引物組成的引物組(圖24的3道和10 道)。為了擴增618bp的產(chǎn)物，使用由序列編號22表示的正向引物以及由序列編號21表示 的反向引物組成的引物組(圖24的4道和11道)。為了擴增l，082bp的產(chǎn)物，使用由序 列編號4表示的正向引物以及由序列編號23表示的反向引物組成的引物組(圖24的5道 和12道)。為了擴增l，296bp的產(chǎn)物，使用由序列編號20表示的正向引物以及由序列編號 21表示的反向引物組成的引物組(圖24的6道和13道)。為了擴增1，561bp的產(chǎn)物，使 用由序列編號4表示的正向引物以及由序列編號21表示的反向引物組成的引物組(圖24 的7道和14道)。在進行PCR之前，將所述反應(yīng)混合物在37°C下保持4小時。然后按下列步驟進行 PCR 在94°C預(yù)變性5分鐘；在94°C變性20秒；在55°C退火40秒；在72°C延伸40秒；從變 性到延伸進行33個循環(huán)；以及在72°C最終延伸5分鐘。所述PCR的結(jié)果用含有1. 6%瓊脂 糖的0. 5xTBE緩沖液通過電泳進行證實。結(jié)果，當(dāng)使用含有2. OmM的PPi、80mU的PPase和Top DNA聚合酶的所述預(yù)混合物 時，即使在預(yù)處理4小時后，在擴增lOObp-1. 6kbpDNA的每種實驗條件下，PCR反應(yīng)性和特異 性都十分出色(圖24的1-7道)。另一方面，當(dāng)單獨使用含有Top DNA聚合酶的所述預(yù)混 合物時，在擴增lOObp-1. 6kbp DNA的每種實驗條件下，都檢測到了非特異性反應(yīng)性或是反 應(yīng)本身無法成功進行(圖24的8-14道)。從上述結(jié)果可知，當(dāng)使用含有Top DNA聚合酶、 PPi和PPase的所述預(yù)混合物時，證實了熱啟動效果，所述熱啟動效果為非特異性反應(yīng)的顯 著抑制和高PCR反應(yīng)性。實施例10 含有PPi和PPase的所述干燥熱啟動預(yù)混合物組合物的貯藏穩(wěn)定性為了研究含有PPi和PPaSe(Bi0neer公司，韓國)的所述熱啟動預(yù)混合物組合物 的貯藏穩(wěn)定性，制備包含下列成分的所述干燥預(yù)混合物10mM Tris-HCl pH 9. 2、60mM的 KC1、1. 5mM的MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸(每種250 μ M)、IU的wTf i DNA聚合酶、0.01% 的 Tween 20,2. OmM 的 PPi,92. 5mU 的 PPaseU. 2μ g 的 BSA 以及穩(wěn)定劑(甲基- a -D-葡 糖-吡喃糖苷α-MG)。對于對照組，在使用前制備含有與上述相同的組合物的溶液。在 SuperCentra(Bioneer公司，韓國)中進行50分鐘的干燥，其中所述裝置外的溫度設(shè)定為 40°C，所述裝置內(nèi)的溫度設(shè)定為36°C。將所制得的預(yù)混合物貯藏于50°C的反應(yīng)器中。從第 0天到第7天，每天取出含有所述預(yù)混合物的8孔板條(8-well strip)。將所述板條貯藏于深度冷凍器中直至進行實時PCR，或?qū)⑺霭鍡l在與對照組相同的條件下于采樣當(dāng)天用 于實時PCR。用于實時PCR的引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)模板DNA如下所述。使用含有水痘帶狀皰疹病 毒ORF基因序列的質(zhì)粒DNA作為模板DNA。向每個孔中加入10 μ 1具有IX 10°_1X IO6拷 貝/μ 1的拷貝數(shù)的模板DNA。將與模板DNA體積相同的、經(jīng)DEPC處理的蒸餾水用于所述 對照組。使用由序列編號25(5' -TGGATGTGGTGTTCCCAAT-3')表示的正向引物以及由序 列編號26(5' -GTTCAGGCAACCGTTTTGA-3‘)表示的反向引物組成的引物組，所述引物組生 成80bp的PCR產(chǎn)物。使用由序列編號27(5' -CTCATACC GAGTTGCATCCAACG-3‘)表示的 TaqMan探針(Taqman_based probe)作為探針，其中在5‘端標(biāo)記有FAM，在3'端標(biāo)記有 TAMRA。以10pmOl/50 μ 1反應(yīng)液的濃度加入由序列編號25和序列編號26表示的引物。以 7. 5pmol/50 μ 1反應(yīng)液的濃度加入由序列編號27表示的探針。向每個孔中加入經(jīng)DEPC處 理的蒸餾水，使得總反應(yīng)溶液為50 μ 1。將含有與所述干燥預(yù)混合物組合物相同的組合物的 溶液用于所述對照組，來比較干燥和貯藏期間的反應(yīng)性，所述溶液在使用前進行制備。在與 使用所述干燥預(yù)混合物進行的實時PCR相同的條件下進行實時PCR。將Exicycler 3. 0版(Bioneer公司，韓國)用于實時PCR。根據(jù)產(chǎn)品說明書執(zhí)行 操作程序和分析程序。按如下步驟進行實時PCR 在95°C預(yù)變性5分鐘；在95°C變性20 秒；在55°C退火/延伸40秒；以及檢測熒光(45個循環(huán))。一旦完成所述PCR，通過在所述 Excicycler實時PCR裝置中運行分析程序，對所述PCR產(chǎn)物進行檢驗。結(jié)果，在50°C貯藏了 8天的所述干燥預(yù)混合物的反應(yīng)性與最初的干燥預(yù)混合物類似。將在干燥之后的Rn值與在50°C貯藏至9天的預(yù)混合物的Rn值相比。結(jié)果，保持了 85% 的熒光(圖25-31)。將50°C實驗的結(jié)果再次計算，來研究低于_20°C下貯藏的反應(yīng)性。結(jié)果， 所述干燥預(yù)混合物預(yù)計可保持與對照組類似的反應(yīng)性達(dá)1，152天(3. 1年)(Leesangyong， Reliability engineering, 1999, Hyungseul Publishing Company)。實施例11 含有PPi和PPase的所沭干燥熱啟動預(yù)混合物以及含有與所沭預(yù)混合 奪勿才目同的組合4勿的熱啟云力溶液t丨旬在7令藏,禾盯東藏J月丨旬穩(wěn)定j牛的X寸比為了將含有PPi和PPase (Bioneer公司，韓國)的所述干燥熱啟動預(yù)混合物以及 含有與上述預(yù)混合物相同的組合物的熱啟動溶液之間在冷藏(4°C )和凍藏(-20°C )期間 的穩(wěn)定性進行比較，以與實施例10中所描述的相同方式制備所述干燥預(yù)混合物。將所制得 的預(yù)混合物貯藏于冰箱(4°C)或深度冷凍器中(-20°C)中。在7個星期的貯藏中，每星期 取出板條。將所述板條貯藏于深度冷凍器中直至進行實時PCR，或?qū)⑺霭鍡l在與對照組相 同的條件下于采樣當(dāng)天用于實時PCR。對于對照組，在使用前制備含有與上述相同的組合物 的熱啟動溶液。用于實時PCR的引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)模板DNA如下所述。使用含有HBV表面抗原基因 (大表面基因)序列的質(zhì)粒DNA作為模板DNA。向每個孔中加入10 μ 1具有1 X IO0-I X IO6 拷貝/ μ 1拷貝數(shù)的模板DNA。使用由序列編號28 (5 ‘ -CCAATCACTCACCAACCTCTTGT-3 ‘) 表示的正向引物以及由序列編號29 (5 ‘ -AGCAGGATGAAGAGGAATATGATAAA-3 ‘)表示的反向 引物組成的引物組，所述引物組生成91bp的PCR產(chǎn)物。使用由序列編號30(5' -TCCTGGCT ATCGCTGGATGTGTCTGC-3‘)表示的TaqMan探針作為探針，其中在5‘端標(biāo)記有FAM，在3‘ 端標(biāo)記有TAMRA。以在實施例10中所描述的相同的方式進行實時PCR。
將7500Fast系統(tǒng)(Applied Biosystem)用于實時PCR。根據(jù)產(chǎn)品說明書執(zhí)行操作程序和分析程序。按如下步驟進行實時PCR 在95°C預(yù)變性5分鐘；在95°C變性20秒；在 55°C退火/延伸40秒；以及檢測熒光(45個循環(huán))。結(jié)果，本發(fā)明中所述的干燥熱啟動預(yù)混合物保持其反應(yīng)性直至7個星期的冷藏 (4°C )或凍藏(-20°C )(圖32-36、圖39和圖40)。與此同時，含有與所述預(yù)混合物相同的 組合物的對照熱啟動溶液在直至3個星期的冷藏(4°C)中顯示出類似的反應(yīng)性，然后在7 個星期的冷藏后失去了反應(yīng)性(圖37和圖38)。上述結(jié)果表明，當(dāng)將所述master混合物作 為溶液進行貯藏時，從冷藏(4°C)的第三個星期起迅速地失去反應(yīng)性；但是當(dāng)將其制備為 干燥熱啟動預(yù)混合物時，可長期保持反應(yīng)性。實施例12 含有PPi和PPase的所沭干燥預(yù)、混合物的PCR /i/^t牛以及常規(guī)的熱啟 動預(yù)混合物的PCR反應(yīng)件為了比較含有PPi和PPase的所述干燥熱啟動預(yù)混合物以及常規(guī)的熱啟動預(yù) 混合物之間的反應(yīng)性，選擇 TaKaRa Premix Ex Taq (Takara, Cat# :RR039A)、Qiagen QuantiFast Probe PCR+ROX Vial Kit(Qiagen，Cat# :204352)以及 Invitrogen Platinum Quantitative PCR SuperMix-U(Invitrogen，Cat# : 11730-017)用于比較組。在 本發(fā)明中所述的干燥熱啟動預(yù)混合物以及上述選定的混合物之間比較PCR反應(yīng)性。以與在 實施例10中所描述的相同的方式進行干燥，來制備含有PPi和PPase的所述干燥熱啟動預(yù) 混合物。用于實時PCR的引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)模板DNA如下所述。使用含有西尼羅病毒E基因 序列的質(zhì)粒DNA作為模板DNA。向每個孔中加入5 μ 1具有2X 10°-2X IO6拷貝/ μ 1拷貝數(shù)的 模板DNA。使用由序列編號31 (5 ‘ -GTGGAGGAACAGAGAGACGTTAATG-3 ‘)表示的正向引物以 及由序列編號32(5' -TCCCTCTTGTGAGCCC AATG-3')表示的反向引物組成的引物組，所述 引物組生成85bp的PCR產(chǎn)物。使用由序列編號33(5' -TGAG GAACCACACGCCACGAAGC-3 ‘) 表示的TaqMan探針作為探針，其中在5'端標(biāo)記有FAM，在3'端標(biāo)記有TAMRA。以實施 例10中所描述的相同的方式進行實時PCR。將相同的引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)模板DNA樣品用于 上述三種來自三個不同公司的預(yù)混合物產(chǎn)品，并且此時根據(jù)產(chǎn)品說明書設(shè)定用于制備實時 PCR和master混合物的條件。將7500Fast系統(tǒng)(Applied Biosystem)用于實時PCR。根據(jù)產(chǎn)品說明書執(zhí)行操 作程序和分析程序。一旦完成所述PCR，通過在所述7500Fast系統(tǒng)中運行分析程序?qū)λ?PCR產(chǎn)物進行檢驗。結(jié)果，當(dāng)使用本發(fā)明中所述的含有PPi/PPase的干燥預(yù)混合物(Dualstar 預(yù)混合 物，Bioneer公司)以及Takara的預(yù)混合物時，可檢測到直至10個拷貝的西尼羅病毒。當(dāng) 使用另外兩種產(chǎn)品時，可檢測到直至100個拷貝的西尼羅病毒(圖41)。還對熒光水平進行 比較。結(jié)果，當(dāng)使用本發(fā)明中所述的干燥預(yù)混合物時，其熒光為使用Takara預(yù)混合物時所 獲得熒光的至少2倍(圖42)。上述結(jié)果表明，相比于由三個不同的公司所提供的其他產(chǎn) 品，本發(fā)明的含有PPi/PPase的干燥熱啟動預(yù)混合物顯示出明顯更高的PCR反應(yīng)性。實施例13 含有PPi和PPase而不含穩(wěn)定劑的干燥熱啟動預(yù)混合物的PCR反應(yīng)性為了對含有PPi和PPase (Bioneer公司，韓國)而不含穩(wěn)定劑甲基_ α-D-葡 糖-吡喃糖苷(a-MG)的干燥熱啟動預(yù)混合物的PCR反應(yīng)性和穩(wěn)定性進行研究，首先通過與在實施例10中所描述的相同的方式制備所述干燥預(yù)混合物。作為對照的預(yù)混合物含有與上述相同的組合物，但從中除去了 0. IM的α -MG。制備上述干燥預(yù)混合物的干燥條件與 實施例10中所描述的相同。在相同條件下，用所述干燥預(yù)混合物以及所述對照預(yù)混合物進 行實時PCR。用于實時PCR的引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)模板DNA樣品序列與實施例11中所描述的相 同。使用含有HBV表面抗原基因(大表面基因)序列的質(zhì)粒DNA作為模板DNA。向每個孔 中加入10 μ 1具有1 X IO0-I X IO6拷貝/ μ 1拷貝數(shù)的模板DNA。實時PCR的條件與實施例 10中所描述的相同。將7500Fast系統(tǒng)(Applied Biosystem)用于實時PCR。根據(jù)產(chǎn)品說明書執(zhí)行操 作程序和分析程序。按如下步驟進行實時PCR 在95°C預(yù)變性5分鐘；在95°C變性20秒； 在55°C退火/延伸40秒；以及檢測熒光(45個循環(huán))。一旦完成所述PCR，通過在所述 7500Fast系統(tǒng)中運行分析程序?qū)λ鯬CR產(chǎn)物進行檢驗。結(jié)果，不含穩(wěn)定劑的干燥熱啟動預(yù)混合物的反應(yīng)性與含有穩(wěn)定劑的對照預(yù)混合物 的反應(yīng)性并無太大差異。特別地，對于相同的標(biāo)準(zhǔn)樣品，其Ct值也相近(圖43和圖44)。 上述結(jié)果表明，穩(wěn)定劑的加入不影響所述干燥熱啟動預(yù)混合物的PCR反應(yīng)性。實施例14 根據(jù)不同實時PCR裝置測丨定的含有PPi和PPase的干燥熱啟云肝頁餛合 物的反應(yīng)件為了研究含有PPi和PPaSe(Bi0neer公司，韓國)的所述干燥熱啟動預(yù)混合物的 反應(yīng)性在各種實時PCR裝置上是否不同，使用由三個公司提供的5種不同的實時PCR裝置。 所述干燥預(yù)混合物的組合物以及干燥條件與實施例10中所描述的相同。使用所述的5種 PCR裝置用所述干燥預(yù)混合物進行實時PCR。用于本發(fā)明的實時PCR裝置如下=Exicyclerf 版(Bioneer 公司，韓國)、Applied Biosystem 7500 系統(tǒng)、7500Fast 系統(tǒng)、St印one 系統(tǒng) (Applied Biosystem)、以及 DNA engine opticon (MJResearch Inc.)。根據(jù)產(chǎn)品說明書執(zhí) 行操作程序和分析程序。以與實施例10中所描述的相同方式進行實時PCR。一旦完成所述 PCR,通過在每種實時PCR裝置中運行分析程序，對所述PCR產(chǎn)物進行檢驗。用于實時PCR的引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)模板DNA樣品序列與實施例12中所描述的相 同。使用含有西尼羅病毒E基因序列的質(zhì)粒DNA作為模板DNA。向每個孔中加入5μ1具 有2Χ10°-2Χ106拷貝/ μ 1拷貝數(shù)的模板DNA。實時PCR的條件與實施例10中所描述的 相同。結(jié)果，所述干燥熱啟動預(yù)混合物在使用不同PCR裝置的情況下顯示出一致的結(jié)果 (圖45-圖49)。因此證實，本發(fā)明中所述的干燥組合物不限于具體的裝置，可應(yīng)用于各種 不同的一般性裝置。實施例15 通過使用各種靶基因，檢驗含有PPi和PPase的干燥熱啟動預(yù)混合物 的PCR反應(yīng)性為了研究含有PPi和PPase的干燥熱啟動預(yù)混合物的PCR反應(yīng)性對于不同的靶基 因是否可變，使用三種不同的靶基因(西尼羅病毒E基因、水痘帶狀皰疹病毒ORF基因以及 HBV表面抗原基因)。制備含有PPi和PPase的干燥熱啟動預(yù)混合物的條件與實施例10中 所描述的相同。用于實時PCR的引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)模板DNA樣品序列與實施例10、11以及12中所描述的相同。使用質(zhì)粒DNA作為模板DNA，所述質(zhì)粒DNA含有西尼羅病毒E基因、水痘帶狀 皰疹病毒ORF基因或HBV表面抗原基因的序列。向每個孔中加入5μ 1具有2Χ10°-2Χ106 拷貝/μ 1拷貝數(shù)的模板DNA。實時PCR的條件與實施例10中所描述的相同。將Exicycler 3. 0版(Bioneer公司，韓國)用于實時PCR。根據(jù)產(chǎn)品說明書執(zhí)行 操作程序和分析程序。按如下步驟進行實時PCR 在95°C預(yù)變性5分鐘；在95°C變性20 秒；在55°C退火/延伸40秒；以及檢測熒光(45個循環(huán))。一旦完成所述PCR，通過在所述 Excicycler實時PCR裝置中運行分析程序，對所述PCR產(chǎn)物進行檢驗。結(jié)果，三種不同的靶基因的反應(yīng)性全部一致(圖50-52)，所述三種靶基因的基因 序列不同、核苷酸的組成不同以及所擴增的靶序列的長度不同。上述結(jié)果表明，本發(fā)明中所 述的干燥熱啟動預(yù)混合物可應(yīng)用于多種靶基因。實施例16 使用含有PPi、PPase和CyBr Rreen熒光染料的干燥熱啟動預(yù)混合物 講行的實時PCR為了研究含有PPi、PPase和CyBr green熒光染料的干燥熱啟動預(yù)混合物的反應(yīng) 性，將IOx CyBr green熒光物質(zhì)(Greenstar ，Bioneer公司，韓國)以0. 6x的最終濃度加 入50 μ 1反應(yīng)混合物中，所述反應(yīng)混合物包含IOmM Tris-HCl ρΗ 9. 0、40mM的KCl、2. OmM 的MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸(每種250 μ Μ,最終濃度0. 25mM)、2. 5U的Top DNA聚合酶、 0. 01 %的Tween 20以及穩(wěn)定劑，分別以2. OmM和92. 5mU的濃度向所述反應(yīng)混合物中加入 PPi和PPase (Bioneer公司，韓國)，從而實現(xiàn)組合物的制備。以與實施例10中所描述的相 同的方式進行所述熱啟動預(yù)混合物的干燥。對于對照組，在使用前制備含有與上述相同的 組合物的master混合物溶液。僅通過對在模板DNA擴增期間嵌入了熒光物質(zhì)的雙鏈DNA 所生成的熒光進行測定，本文所述的熒光物質(zhì)有助于在不使用序列特異性熒光探針的情況 下進行分析。以0. lng-0. Ipg的不同濃度使用λ-DNA(Bioneer公司，韓國)作為模板。以 1 Opmo 1 /50 μ 1 反應(yīng)液的濃度使用由序列編號 34 (5 ‘ -GAACTGATGAGCGATCCGAATAG-3 ‘) 表示的L127F引物以及由序列編號35(5' -CCACCACTGATTAGCGAATGC-3 ‘)表示的L127R 引物，所述兩種引物生成127bp的PCR產(chǎn)物。通過使用ABI 7500Fast系統(tǒng)(Applied Biosystems)按如下步驟進行PCR 在95°C預(yù)變性1分鐘；在95°C變性5秒；在55°C退火 35秒同時延伸(40個循環(huán))。在解離步驟后，繪制所述擴增產(chǎn)物的熔解曲線以證實PCR反 應(yīng)性和特異性。結(jié)果，使用所述干燥熱啟動預(yù)混合物進行PCR的結(jié)果與使用所述對照預(yù)混合物進 行PCR的結(jié)果相近(圖53和圖54)。因此證實，含有PPi、PPase和CyBr green熒光染料 的干燥熱啟動預(yù)混合物的PCR反應(yīng)性在實時PCR中得以保持。實施例17 含有PPi、PPase CyBr Rreen熒光物質(zhì)的干燥預(yù)混合物的貯藏穩(wěn)定性為了研究含有PPi、PPase和CyBr green熒光物質(zhì)的干燥熱啟動預(yù)混合物的 貯藏穩(wěn)定性，首先以與實施例16中所描述的相同的方式制備所述干燥預(yù)混合物。對 于對照組，在使用前制備含有與上述相同的組合物的溶液。在5分鐘的預(yù)熱后，在 SuperCentra(Bioneer公司，韓國)中進行50分鐘的干燥，其中所述裝置外的溫度設(shè)定為 400C，所述裝置內(nèi)的 溫度設(shè)定為36°C。將所制得的預(yù)混合物貯藏于50°C的反應(yīng)器中，從第0 天到第9天，每天取出含有所述預(yù)混合物的8孔板條。將所述板條貯藏于深度冷凍器中直至進行實時PCR，或?qū)⑺霭鍡l在與對照組相同的條件下于采樣當(dāng)天用于實時PCR。使用與 實施例16中所使用的相同的模板DNA。實驗條件也與實施例16中所描述的相同。以與實 施例16中所描述的相同的方式進行PCR和結(jié)果分析。結(jié)果，本發(fā)明中所述的干燥組合物即使在50°C貯藏7天后也顯示出與最初的預(yù)混合物組合物相近的反應(yīng)性。在50°C貯藏的第9天，比較其熒光與所述最初前干燥組 合物的熒光。結(jié)果，熒光稍有降低，但這一降低不強烈，并沒有影響反應(yīng)性(圖55-60)。 將50°C實驗的結(jié)果再次計算，來研究低于-20°C下貯藏的反應(yīng)性。結(jié)果，所述干燥預(yù) 混合物預(yù)計可保持與所述對照組類似的反應(yīng)性達(dá)1，152天(3.1年)(Lee sangyong, Reliabilityengineering, 1999, Hyungseul Publishing Company)。實施例18 含有CyBr green熒光染料、PPi和PPase的干燥熱啟動預(yù)混合物的PCR 反應(yīng)件以及常規(guī)的熱啟動預(yù)混合物的PCR反應(yīng)件為了比較本發(fā)明中所述的含有CyBr green熒光染料、PPi和PPase的干燥熱 啟動預(yù)混合物以及常規(guī)的熱啟動預(yù)混合物之間的反應(yīng)性，選擇Takara SYBR Premix Ex Taq (Takara, Cat# :RR041)、ABI SYBR GreenPCR Master Mix(ABI, Cat# :4309155)以 R Invitrogen SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal(Invitrogen, Ciit# : 11762—100) 用于比較組。以與實施例16中所描述的相同的方式進行干燥，來制備含有CyBr green熒 光染料、PPi和PPase的所述干燥熱啟動預(yù)混合物。用于實時PCR的引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)模板DNA與實施例16中所描述的相同。以在 實施例16中所描述的相同的方式進行實時PCR。將相同的引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)模板DNA樣品 用于上述三種來自三個不同公司的預(yù)混合物產(chǎn)品，并且此時根據(jù)產(chǎn)品說明書設(shè)定用于實時 PCR和master混合物制備的條件。將7500Fast系統(tǒng)(Applied Biosystem)用于實時PCR。根據(jù)產(chǎn)品說明書執(zhí)行操作 程序和分析程序。一旦完成所述PCR，通過在所述7500Fast系統(tǒng)中運行分析程序，對所述 PCR產(chǎn)物進行檢驗。結(jié)果，含有CyBr green熒光染料、PPi和PPase的所述干燥熱啟動預(yù)混合物顯示 出與由三個不同公司提供的三種常規(guī)預(yù)混合物相近的PCR效率和擴增曲線(圖61)。實施例19 包含PPi、PPase、引物組和用熒光染料標(biāo)記的探針的干燥熱啟動預(yù)混 合物的PCR反應(yīng)性對所述干燥熱啟動預(yù)混合物的PCR反應(yīng)性進行研究，所述預(yù)混合物包含PPi、 PPase (Bioneer公司，韓國)、靶特異性引物組以及用熒光染料標(biāo)記的探針。向反應(yīng)混合物 中加入IOpmol靶特異性引物組和IOpmol熒光染料標(biāo)記的探針(1 μ 1/20 μ 1反應(yīng)體積) 來制備所述干燥預(yù)混合物，所述引物組包含正向引物(1μ 1/20μ 1反應(yīng)體積)和反向引物 (1 μ 1/20 μ 1反應(yīng)體積)，所述反應(yīng)混合物包含IOmM Tris-HCl ρΗ 9. 2、60mM的KC1、1. 5mM 的MgCl2,4種脫氧核苷三磷酸(每種250 μ M)、IU的wTfi DNA聚合酶、0. 01 %的Tween 20、 2. OmM的PPi、37mU的PPase、1. 2 μ g的BSA以及穩(wěn)定劑(甲基_ α-D-葡糖-吡喃糖苷 α -MG)。對于對照組，制備含有與上述相同的組合物、但不含引物組和探針的干燥預(yù)混合 物。在SuperCentra(Bioneer公司，韓國)中進行25分鐘的干燥，其中所述裝置外的溫度 設(shè)定為40°C，所述裝置內(nèi)的溫度設(shè)定為36°C。在相同條件下進行實時PCR。用于實時PCR的引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)模板DNA樣品序列與實施例11中所描述的相同。使用含有HBV表面抗原基因(大表面基因)序列的質(zhì)粒DNA作為模板DNA。向每個孔 中加入5μ 1具有IX 10°-1X IO6拷貝/ μ 1拷貝數(shù)的模板DNA。向不含所述引物組和所述 探針的對照預(yù)混合物中加入IOpmol引物組和IOpmol熒光染料標(biāo)記的探針(1 μ 1/20 μ 1反 應(yīng)體積)，所述引物組包含正向引物(1 μ 1/20 μ 1反應(yīng)體積)和反向引物(1 μ 1/20 μ 1反應(yīng) 體積)。加入經(jīng)DEPC處理的蒸餾水12 μ 1，使得最終體積為20 μ 1/孔。從所述干燥過程的 一開始，向具有相同濃度的所述熱啟動預(yù)混合物中加入相同的序列引物組和探針，同時加 入經(jīng)DEPC處理的蒸餾水15 μ 1，使得最終反應(yīng)體積為20 μ 1/孔。其余的實時PCR的條件與 實施例10中所描述的相同。將7500Fast系統(tǒng)(Applied Biosystem)用于實時PCR。根據(jù)產(chǎn)品說明書執(zhí)行操 作程序和分析程序。按如下步驟進行實時PCR 在95°C預(yù)變性5分鐘；在95°C變性20秒； 在55°C退火/延伸40秒；以及檢測熒光(45個循環(huán))。一旦完成所述PCR，通過在所述 7500Fast系統(tǒng)中運行分析程序，對所述PCR產(chǎn)物進行檢驗。結(jié)果，含有靶特異性引物組和探針的所述干燥熱啟動預(yù)混合物的反應(yīng)性，與不使 用所述靶特異性引物和探針制備、但含有PPi和PPase的對照干燥熱啟動預(yù)混合物的反應(yīng) 性相近(圖62和圖63)。上述結(jié)果表明，即使通過在干燥過程期間加入靶特異性引物組和 探針來制備所述熱啟動預(yù)混合物，也不會改變PCR反應(yīng)性。因此，其顯示出通過在所述預(yù)混 合物中含有靶特異性引物組和探針而應(yīng)用于生產(chǎn)用于各種疾病的診斷試劑盒的可能性。序列表在此一并附上序列表。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會明了的是，可容易地利用 在上述說明書中所公開的概念和具 體實施方式，作為改進或設(shè)計其他實現(xiàn)與本發(fā)明用途相同的實施方式的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù) 人員還將明了的是，這類等同的實施方式?jīng)]有脫離如所附權(quán)利要求書中闡明的本發(fā)明的精 神和范圍。
權(quán)利要求
一種用于熱啟動PCR的干燥組合物，所述干燥組合物包含反應(yīng)緩沖液、MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、焦磷酸鹽和焦磷酸酶。
2.如權(quán)利要求1所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其中，所述組合物進一步包含引 物組或探針。
3.如權(quán)利要求1所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其中，所述組合物進一步包含結(jié) 合至DNA的熒光染料。
4.如權(quán)利要求3所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其中，所述熒光染料選自于由 SyBr Green、EtBr 和 HRdye 所組成的組。
5.如權(quán)利要求1所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其中，所述組合物進一步包含模 板核酸。
6.如權(quán)利要求1所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其中，所述焦磷酸鹽以0.3-5mM 的濃度包含于最終反應(yīng)溶液中，所述焦磷酸酶以高于30mU直至200mU的濃度包含于20 u 1 的最終反應(yīng)溶液中。
7.如權(quán)利要求6所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其中，所述焦磷酸鹽以 0. 95-3. OmM的濃度包含于所述最終反應(yīng)溶液中。
8.如權(quán)利要求6所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其中，所述焦磷酸酶以 50-100mU的濃度包含于20iU的所述最終反應(yīng)溶液中。
9.如權(quán)利要求1所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其中，所述DNA聚合酶為選 自于由下列物質(zhì)所組成的組中的一種或多種聚合酶具有5' -3'外切核酸酶活性的聚 合酶、具有3' -5'外切核酸酶活性的聚合酶、以及不具有5' -3'外切核酸酶活性和 3' -5'外切核酸酶活性的聚合酶。
10.如權(quán)利要求1所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其中，所述組合物進一步包含 對于核酸不具有反應(yīng)性的染料。
11.如權(quán)利要求10所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其中，所述染料為選自于由羅 丹明、tamra、lax、溴酚藍(lán)、二甲苯青、溴甲酚紅和甲酚紅所組成的組中的一種或多種物質(zhì)。
12.如權(quán)利要求1所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其中，所述組合物進一步包含 選自于由多元醇、明膠、牛血清白蛋白(BSA)、Thesit和PET-8000所組成的組中的一種或多 種物質(zhì)。
13.如權(quán)利要求1所述的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其中，所述組合物用于多重 PCR、實時PCR或?qū)崟r定量PCR。
14.一種用于熱啟動PCR的干燥組合物的制備方法，所述方法包括下述步驟在反應(yīng)管 中制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含反應(yīng)緩沖液、MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸、DNA聚合 酶、焦磷酸鹽和焦磷酸酶；以及將所述反應(yīng)混合物進行干燥。
15.如權(quán)利要求14所述的制備方法，其中，所述反應(yīng)混合物進一步包含一種或多種引 物或探針。
16.如權(quán)利要求14所述的制備方法，其中，所述反應(yīng)混合物進一步包含結(jié)合至DNA的熒 光染料。
17.如權(quán)利要求16所述的制備方法，其中，所述熒光染料選自于由SyBrGreeruEtBr和 HRdye所組成的組。
18.如權(quán)利要求14所述的制備方法，其中，所述反應(yīng)混合物進一步包含模板核酸。
19.如權(quán)利要求14所述的制備方法，其中，所述焦磷酸鹽以0.3-5mM的濃度包含于最 終反應(yīng)溶液中，所述焦磷酸酶以高于30mU直至200mU的濃度包含于20 u 1的最終反應(yīng)溶液 中。
20.如權(quán)利要求19所述的制備方法，其中，所述焦磷酸鹽以0.95-3. OmM的濃度包含于 所述最終反應(yīng)溶液中。
21.如權(quán)利要求19所述的制備方法，其中，所述焦磷酸酶以50-100mU的濃度包含于 20 yl的所述最終反應(yīng)溶液中。
22.如權(quán)利要求14所述的制備方法，其中，所述DNA聚合酶為選自于由下列物質(zhì)所組成 的組中的一種或多種聚合酶具有5' -3'外切核酸酶活性的聚合酶、具有3' -5'外切 核酸酶活性的聚合酶、以及不具有5' -3'外切核酸酶活性和3' -5'外切核酸酶活性 的聚合酶。
23.如權(quán)利要求14所述的制備方法，其中，所述反應(yīng)混合物進一步包含對于核酸不具 有反應(yīng)性的染料。
24.如權(quán)利要求23所述的制備方法，其中，所述染料為選自于由羅丹明、tamraUax、溴 酚藍(lán)、二甲苯青、溴甲酚紅和甲酚紅所組成的組中的一種或多種物質(zhì)。
25.如權(quán)利要求14所述的制備方法，其中，所述反應(yīng)混合物進一步包含選自于由多元 醇、明膠、牛血清白蛋白(BSA)、Thesit和PET-8000所組成的組中的一種或多種物質(zhì)。
26.一種用于熱啟動PCR的試劑盒，所述試劑盒包含如權(quán)利要求1-13所述的用于熱啟 動PCR的干燥組合物之一。
27.一種用于擴增核酸的方法，所述方法使用如權(quán)利要求1-13所述的用于熱啟動PCR 的干燥組合物之一。
28.如權(quán)利要求27所述的用于擴增核酸的方法，其中，所述方法包括下述步驟將含有 模板核酸的樣品與所述用于熱啟動PCR的干燥組合物進行混合；進行反應(yīng)以擴增所述反應(yīng) 混合物；以及分析所述模板核酸的擴增產(chǎn)物。
29.如權(quán)利要求27所述的用于擴增核酸的方法，其中，所述PCR選自于由多重PCR、實 時PCR和實時定量PCR所組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于熱啟動PCR的干燥組合物，更確切地說涉及具有改進的穩(wěn)定性和長期耐貯藏性的用于熱啟動PCR的干燥組合物，其特征在于所述干燥組合物通過下述步驟進行制備通過將水溶液與焦磷酸鹽和焦磷酸酶在反應(yīng)管中混合來制備反應(yīng)混合物，所述水溶液含有反應(yīng)緩沖液、MgCl2、4種脫氧核苷三磷酸、DNA聚合酶；以及將上述制得的反應(yīng)混合物干燥。本發(fā)明還涉及所述干燥組合物的制備方法以及使用所述干燥組合物擴增核酸的方法。在干燥前將焦磷酸鹽和焦磷酸酶共同加入所述用于熱啟動PCR的干燥組合物，從而使其相比于所述用于熱啟動PCR的常規(guī)組合物，具有改進的穩(wěn)定性和長期耐貯藏性，并且便于使用。因此，這一組合物可有效地用于熱啟動PCR、多重PCR或?qū)崟r定量PCR。
文檔編號C12Q1/00GK101842492SQ200880113605
公開日2010年9月22日 申請日期2008年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日
發(fā)明者樸海埻, 樸翰悟, 金成烈, 金鉉培 申請人:株式會社百奧尼